Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo monitorear la dinámica de proteínas con fluorescencia de etiquetado en las superficies celulares de las plantas con la microscopía de epifluorescencia de ángulo variable, mostrando parpadear puntos de PATROL1 GFP-etiquetados, una proteína tráfico de membrana, en la corteza celular del complejo estomático en Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Preparación de plántulas
- Esterilizar las semillas.
- Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 l NaClO (cloro disponible: 5,0%) y 1 l 10% de Triton X-100 a 500 l de agua estéril.
- Lugar ca. 10 transgénico A. thaliana semillas que llevan GFP-PATROL1 8 en un tubo de 1,5 ml.
- Añadir 1 ml solución de etanol al 70%, y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 min.
- Tenga en cuenta las semillas se hunden hasta el fondo del tubo. En una cabina de flujo laminar limpio, retire suavemente el etanol al 70% utilizando una micropipeta, y añadir 1 ml de solución de esterilización. Mezclar bien por inversión cinco veces y se deja durante 5 min.
- Lavar las semillas. Sigue trabajando en condiciones asépticas en un banco limpio, retire con cuidado la solución con una micropipeta, y añadir 1 ml de agua estéril. Repita esto cinco veces. Las semillas esterilizadas se pueden almacenar en agua estéril a 4 ° C durante 2 días.
- Asi quew las semillas esterilizadas en un gellan 0,5% de goma solidificado media Murashige y Skoog placa de medio (pH 5,8) 9. Cinta de la tapa sobre la placa usando dos capas de cinta quirúrgica.
- Incubar la placa en la oscuridad a 4 ° C con una cámara de almacenamiento en frío, O / N.
- La transferencia de la placa en una cámara de crecimiento fijado en 23,5 ° C, con un ciclo de luz-oscuridad / 12-hr 12 hr utilizando 100 mol m -2 s -1 luces blancas, y se incuba durante 7 días. Las plántulas con cotiledones de alrededor de 1 mm de largo y luego se pueden cosechar.
2. Sky gota Montaje de Cotiledón Especímenes
NOTA: Un factor importante en la preparación de muestras para la observación VAEM es evitar la inclusión de burbujas de aire entre la muestra y la cubierta de vidrio. Burbujas reducen en gran medida la calidad de imagen de VAEM al causar diferencias en el índice de refracción. Un método simple, lo que hemos llamado "caída del cielo 'de montaje, se puede utilizar para evitar burbujasentre la A. cotiledones thaliana y la cubierta de vidrio. Esto se debe hacer inmediatamente antes de la observación.
- Coloque 30 l de tampón basal [5 mM 2- (N morfolino) etanosulfónico ácido-Tris (Tris-MES) a pH 6,5, KCl 50 mM, 100 mM CaCl 2] en el centro de un portaobjetos de vidrio (tamaño: 76 × 26 mm, espesor: 1,0 a 1,2 mm).
- Retirar un cotiledón de una plántula de 7 días de edad, con unas tijeras de disección. Flotador el cotiledón con la cara de observación arriba en la caída de tampón basal (Figura 1, paso 1).
- Ponga 30 l de tampón basal en el centro de una cubierta de vidrio (tamaño: 18 × 18 mm, espesor: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, paso 2). Gire la cubierta de vidrio boca abajo con suavidad. La tensión superficial evitará la caída de tampón de caerse. Sostenga la cubierta de vidrio con pinzas en un borde. Coloque el borde opuesto sobre el portaobjetos de vidrio de modo que la caída de tampón es de aproximadamente por encima del cotiledón.
- Con el borde de la cubierta de vidrio aún en la diapositiva, y todavía con el borde opuesto con pinzas, ajustar la posición de la caída de amortiguación bajo la cubierta de vidrio para que sea directamente sobre la muestra cotiledones (Figura 1, paso 3). Dejar de lado la cubierta de vidrio. Montar una gota en la muestra resultante en una preparación sin burbujas de aire.
- Limpie el exceso de buffer usando tejidos sin pelusa. Observar la preparación inmediatamente (ver paso 3).
NOTA: No hay necesidad de sellar las muestras.
3. VAEM Observación y Movie Adquisición
NOTA: El sistema de microscopio TIRF 9 utilizado en el presente estudio se describe como sigue: un microscopio invertido está equipado con una unidad de TIRF y una lente objetivo TIRF con una apertura numérica de 1,49. Para el control informatizado del ángulo de entrada del láser, se utiliza una caja de control. Proteína verde fluorescente (GFP) se excita con un 488 nm láser semiconductor de bombeo óptico, y tque la fluorescencia se detecta a través de un filtro de paso de banda 510 a 550 nm para evitar que la autofluorescencia de los cloroplastos. El valor máximo medido de la potencia de salida de la fibra es 13,0 a 13,5 mW. Para la detección, un electrón multiplicando dispositivo de carga acoplada (EM-CCD) sistema de cabezal de la cámara y una unidad de cambio de magnificación de la cámara de montaje C se utilizan.
- Calibrar centrar el láser y el enfoque de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Este paso es crucial para las observaciones VAEM precisas. Se recomienda encarecidamente que los controles periódicos de los procedimientos de ajuste de trayectoria láser, apropiado a su microscopio, se llevan a cabo.- Determinar la posición central iluminada con una trayectoria de la luz sin lente objetivo en el techo de la sala de microscopía. Para marcar la posición central, poner un sello de color en el techo (Figura 2, paso 1, 2).
- Ilumine el techo con una lente objetivo (Figura 2, paso 3, 4). Mueva el illuminated región a la posición central (Figura 2, paso 5). Enfoque el láser (figura 2, paso 6). Ajustar la posición del láser enfocado hacia el centro (figura 2, paso 7).
- Establecer un ejemplar en la platina del microscopio y seleccionar celdas de observación utilizando iluminación de campo brillante.
- Compruebe que la proteína fluorescente se puede observar en las células, y fijó la posición de la z eje x en la superficie celular mediante la iluminación de epifluorescencia (Figura 3A).
- Realizar observaciones VAEM.
- Inclinar el ángulo de entrada del haz de láser gradualmente con la caja del controlador. Al mismo tiempo, controlar la imagen en vivo con cuidado. Inicialmente, la imagen será borrosa (Figura 3B).
- A medida que el ángulo aumenta láser, la imagen VAEM será menos borrosa, finalmente producir un imagen clara (Figura 3C y D). En este punto, dejar de Increacantar el ángulo láser. Si se pierde la señal de fluorescencia, disminuya a un ángulo menos profundo.
- Ajustar el ángulo de entrada de láser para obtener una mejor imagen. Puesta a punto de la posición del eje x z también puede mejorar la imagen. Si es necesario, ajuste los parámetros ópticos (energía láser, longitud de onda y de conjunto de filtros) y parámetros del sensor de imagen [tamaño de imagen, tiempo de exposición, ganancia, digitalizador y (EM) de ganancia de electrones multiplicando].
NOTA: En el caso de los equipos microscopio TIRF ha descrito anteriormente, los parámetros representativos son los siguientes. Ampliación de la lente justo en frente de la cámara: 2X; Salida de láser: 1,0 mW; Tamaño de imagen: 512 × 512 píxeles; Tiempo de exposición: 100 ms; Ganancia: 5 ×; Digitalizador: 11 MHz; y EM ganancia: 100.
- Adquirir una película como una de varias páginas TIFF archivo de imagen utilizando el software microscopio comercial. En este caso, la película es de puntos GFP-etiquetados parpadeantes en la superficie de las células de los estomas.
NOTA: las condiciones de adquisición de imágenes representativas son como folmínimos. Modo de adquisición: Corriente de RAM; Número de imágenes: 600; y el tamaño de varias páginas TIFF: ~ 302 MB.
4. Análisis quimógrafo para la cuantificación de GFP-etiquetados Dot Residencia Tiempo Usando Fiji Software
- Instale Fiji ('Fiji es Justo ImageJ') de software 10 usando las instrucciones de los autores (http://fiji.sc/Fiji).
- Ejecute Fiji y abra el archivo TIFF de varias páginas adquirida mediante el menú Fiji "Archivo-Abrir".
- Coloque una línea en el sitio de interés, utilizando la herramienta de menú de la barra de Fiji "Herramienta de selección Línea Recta". Opcionalmente, utilice la "Herramienta de selección de línea segmentada" o "Herramienta de selección Línea a mano alzada". En los resultados presentados aquí, una línea recta de 100 pixeles (correspondientes a 8,0 M) se colocó en una célula subsidiaria (Figura 4A).
- Hacer una imagen quimógrafo usando el menú de Fiji "Imagen-Pilas-Dynamic Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (Figura 4B). Opcionalmente, "Flip vertical" y "Girar 90 grados" en una ventana de la casilla de verificación también están disponibles (no se utiliza en los resultados presentados aquí). La x y eje y en la imagen quimógrafo indican la posición de la línea (100 píxeles correspondiente a 8,0 micras) y el tiempo de observación (600 píxeles correspondientes a 60 seg), respectivamente. Si la imagen quimógrafo no es satisfactoria, la posición y el tipo (recta, segmentados y mano alzada) de la línea en la imagen de varias páginas se pueden cambiar. Como los cambios en la formación, la imagen quimógrafo cambia dinámicamente. Guarda una imagen de quimógrafo como un archivo TIFF usando el menú de Fiji "Archivo-Guardar como-Tiff".
- Mida la longitud de la burbuja en la orientación del eje de tiempo.
- Para llevar a cabo la reducción de ruido, aplicar un filtro gaussiano a las imágenes quimógrafo utilizando el menú de Fiji "Process-Filtros-Gaussian Blur". El "Sigma (Radius) "parámetro es sintonizable (1 radio de píxeles se utiliza para los resultados presentados).
- Segmento de las regiones de señal de umbral, utilizando el menú de Fiji "Imagen-Adjust-Umbral".
NOTA: Hay varios algoritmos de umbral para elegir. En los resultados presentados, el algoritmo "Yen" fue elegido (Figura 4C). - Prepárese para medir el tiempo (y) eje x longitud de la burbuja con el menú "Analizar-Set Mediciones". Compruebe el "rectángulo delimitador" en la ventana "Medidas Set". Lo ideal sería que el área de juego debe ser lo más pequeño posible, para excluir el ruido. En este caso, el área mínima se fijó en 50 píxeles. Medir el tiempo (y) eje x longitud de la burbuja con el menú "Analizar-Analizar Partículas". Para obtener los valores de los resultados y demostrar la credibilidad de las regiones de medición, compruebe los "Mostrar resultados" y "Añadir a Gerente </ em> "cajas.
- Los valores en la columna "Altura" son el tiempo (y) eje x longitudes para la mancha de medición (Figura 4D). Guarde los valores utilizando el menú de la tabla Resultados "Archivo-Guardar como" y calcular y procesar el conjunto de datos de las duraciones imagen blob utilizando un paquete estadístico y / o software de hoja de cálculo (Figura 4E).
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Representative Results
En este artículo de vídeo, los protocolos para VAEM observación de GFP-PATROL1 en A. Se proporcionan células complejas thaliana cotiledones estomas. Montaje caída del cielo es un método de preparación simple que puede ayudar a reducir la aparición de burbujas de aire en los preparativos VAEM de A. cotiledones thaliana (Figura 1). Inclinación excesiva del láser de entrada y / o z-posicionamiento de muestras para VAEM proporcionará una imagen clara. Si eso sucede, se recomienda volver a empezar desde una posición inmediatamente por encima de la muestra, según la opinión de la iluminación de epifluorescencia. Después de la experiencia de unos días de observación VAEM, debería ser posible adquirir películas VAEM con éxito y de forma rutinaria, como la que se muestra aquí de GFP-PATROL1 punto intermitente. Utilizando el análisis de quimógrafo presentado en la Figura 4, los tiempos de residencia de 185 puntos GFP-PATROL1 de 12 células subsidiarias independientes en A. Se midieron los cotiledones thaliana. La densidad equipadafunción reveló que la mayoría de los puntos de GFP-PATROL1 residían en una celda de la filial de entre 2 y 10 segundos, con un pico de alrededor de 3,5 segundos (Figura 4E), lo que sugiere la exocitosis rápida / endocitosis de protones bombas en la superficie celular subsidiaria.
Figura 1. Esquema del cielo gota método de montaje Paso 1:. Specimen Arabidopsis thaliana cotiledones se hacen flotar sobre una gota de tampón basal en un portaobjetos de vidrio. Paso 2: Una gota de la gota de tampón basal se coloca sobre una cubierta de vidrio. Paso 3: La cubierta de vidrio con la caída da un vuelco y la caída se sitúa por encima de la muestra en el portaobjetos de vidrio. Paso 4: El vidrio de cubierta se libera y la gota cae sobre la muestra. (Arriba) Vista de pájaro. (Abajo) Lateral y vista ampliada. Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Calibración del centrador láser y centrándose Paso 1:. La posición vacía del revólver del microscopio se ha seleccionado para enviar la luz láser en el techo por encima del microscopio. Paso 2: La posición central se marca mediante un sello de color en el techo. Paso 3: Se selecciona un objetivo. Paso 4: Verifique la posición iluminada por la luz láser a través de la lente del objetivo. Paso 5: La iluminación se ajusta a la posición central marcada. Paso 6: La luz láser se enfoca. Paso 7:. La luz láser enfocado se mueve a la posición central marcada Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de la microscopía de epifluorescencia y microscopía de epifluorescencia ángulo variable (VAEM). (A) Esquema de la trayectoria de la luz del láser en la microscopía de epifluorescencia. Imagen de epifluorescencia Representante de GFP-PATROL1 en las superficies de cotiledones en 7 días de edad, las plántulas de Arabidopsis thaliana (B). La barra de escala indica 5 micras. (C) Esquema de la trayectoria de la luz del láser en VAEM. Tenga en cuenta que la entrada del láser está inclinado, e ilumina la superficie de la muestra con profundidad variable. Imágenes (D) VAEM de la misma región como se muestra en (B). La barra de escala indica 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis quimógrafo para cuantificar el tiempo de permanencia de un GFP-PATROL1 punto. De imagen (A) VAEM con una línea recta situada para hacer una quimógrafo. La barra de escala indica 5 micras. Una imagen quimógrafo largo de la línea se muestra en (A) (B). (C) Una imagen binaria de (B) basado en el algoritmo de Yen, generado en el software de Fiji. Las líneas amarillas muestran la región de forma automática de la señal detectada-GFP-PATROL1. (D) Captura de pantalla de los resultados de la tabla del Fiji "Analizar Partículas" función. (E) Un histograma del tiempo de residencia de GFP-PATROL1 punto en células auxiliares. La línea roja muestra la función de densidad. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo de vídeo, los protocolos se dan para el seguimiento y la medición del comportamiento dinámico de puntos GFP-PATROL1 en el complejo de los estomas de Arabidopsis thaliana. Como se muestra aquí, la observación VAEM es una poderosa herramienta para imágenes en vivo de las superficies celulares de las plantas. Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí para la supervisión GFP-PATROL1, había muy poco photobleaching fluorescencia en la muestra utilizada para 1 min de captura de vídeo, debido a que el altamente sensible EM-CCD permite el uso de un láser de excitación relativamente débil en la óptica VAEM. Laser centrado y de enfoque, antes del comienzo de cada experimento, son importantes para la observación VAEM éxito. Los usuarios deben ser capacitados por el personal profesional de la empresa microscopio elegido antes de usar VAEM.
VAEM revela que GFP-PATROL1 tiene una localización dinámica con un compartimiento punteado inmóvil parpadeante en la membrana plasmática. Los errores de l Aha1 plasma la bomba de protones de membrana la etiqueta fluorescente-ocalizes en células de guarda y células auxiliares patrol1 mutante, como se informó anteriormente 8,9. Por lo tanto, la dinámica de punto GFP-PATROL1 visualizados-VAEM pueden representar la entrega de la bomba de protones en la membrana plasmática. Este comportamiento dinámico de GFP-PATROL1 es difícil de visualizar usando galvanómetro de espejo de tipo convencional microscopía confocal de barrido láser, lo que indica la utilidad de VAEM en el descubrimiento de la dinámica de proteínas en tiempo real en las superficies celulares de las plantas. Observación GFP-PATROL1 es sólo un ejemplo de aplicación VAEM en biología celular de la planta. VAEM sería aplicable a la supervisión de los numerosos eventos en la capa cortical delgada de citoplasma en las células vegetales (por ejemplo, la secreción de enzimas en la síntesis de la pared celular o modificación 11,12, la membrana plasmática la dinámica de proteínas, 7,13,14 dinámica de los microtúbulos corticales 4, reordenación de microfilamentos de actina 4,15 y orgánulo movimiento 6). Una amplia gama de científicos de células vegetales debería beneficiarseadaptarse a partir de técnicas VAEM.
Evaluación cuantitativa de datos de imágenes biológicas ha convertido recientemente en importante, impulsado por los avances en equipos de microscopio y la informática. Datos de la película VAEM que contienen 512 (x) x 512 (y) × 600 píxeles (t) se pueden obtener fácilmente en sólo unos minutos. El análisis de imágenes no sólo ayuda en la medición de la vida útil o el movimiento de una proteína con fluorescencia marcado, sino también en la minería de información biológica a partir de grandes conjuntos de datos de imagen, multidimensionales. A quimógrafo es un enfoque básico, pero valioso para la determinación de destino movimiento proteína a partir de datos de la película VAEM, como se muestra por el reclutamiento secuencial de proteínas en las membranas plasmáticas 2. El quimógrafo permite la visualización de tiempos de residencia los puntos GFP-PATROL1 ', y su baja motilidad en las membranas plasmáticas, como se muestra en la Figura 4. A la inversa, un quimógrafo tiene una eficacia limitada para evaluar los movimientos más complicados, tales como corriente citoplasmática. Para obtener más complimovimiento cado, otros análisis de imagen enfoques tales como el flujo óptico 16 sería útil.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
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