Summary
このプロトコルの目的は、気孔複合体の細胞皮質内に、GFPタグPATROL1、膜輸送タンパク質のドットを点滅示す可変角度落射蛍光顕微鏡で植物細胞表面上の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを監視する方法を示すことですシロイヌナズナ 。
Protocol
苗の調製
- 種子を滅菌します。
- 1μlの10％トリトンX-100〜500μlの滅菌水：500μLのNaClO（5.0％有効塩素）を加えることによって滅菌溶液を調製します。
- 場所の約 10 形質転換A. 1.5 mlチューブに、GFP-PATROL1 8を運ぶ シロイヌナズナの種子。
- 1ミリリットルの70％エタノール溶液を追加し、5回反転させてよく混ぜます。 1分間のままにしておきます。
- 種子は、チューブの底に沈む確認します。クリーンクリーンベンチでは、静かにマイクロピペットを用いて70％のエタノールを除去し、1ミリリットルに滅菌溶液を添加。 5回反転させることによって十分に混合し、5分間放置します。
- 種子を洗ってください。それでもクリーンベンチに無菌状態の下で働いて、静かにマイクロピペットを用いて溶液を除去し、1ミリリットルに滅菌水を追加します。この5回繰り返します。滅菌種子は、2日間4℃で滅菌水に格納されてもよいです。
- だから、0.5％ジェランガム固化1/2ムラシゲ・スクーグ培地プレート（pHは5.8）9の滅菌種子ワットサージカルテープの二つの層を用いてプレート上にふたをテープで固定します。
- 冷蔵室、O / Nで、4℃で暗所でプレートをインキュベートします。
- 100マイクロモルメートル-2秒 -1白いライトを使用して12時間/ 12時間の明暗サイクルで23.5℃に設定し、成長チャンバ内にプレートを移し、7日間インキュベートします。長い1mm程度の子葉と苗木は、その後収穫することができます。
2.スカイドロップ子葉片の取り付け
注：VAEM観察用の試料の調製における重要な要因は、試料とカバーガラスの間に気泡の混入を回避されます。気泡が大きく屈折率の差を生じさせることによってVAEMの画質を低下させます。我々は、「空のドロップ」と呼ばれている単純な実装方法は、気泡を回避するために使用することができA.間のシロイヌナズナ子葉とカバーガラス。これは、観測の直前に行われる必要があります。
- 76：スライドガラス（サイズの中央に基礎緩衝液30μl[5 mMの2-（N-モルホリノ） -エタン酸トリス（MES-トリス）pH6.5で、50mMの塩化カリウム、100μMのCaCl 2]を配置します×26ミリメートル、厚さ：1.0〜1.2ミリメートル）。
- 解剖ハサミを使用して、7日齢の苗から子葉を削除します。観察側が基底バッファ降下（ 図1、ステップ1）上に向けて子葉をフロート。
- カバーガラスの中心に基礎緩衝液30μlを置き（サイズ：18×18ミリメートル、厚さ：0.12〜0.17ミリメートル）（ 図1、ステップ2）。逆さまに静かにカバーガラスを回します。表面張力が脱落バッファ低下を防ぐことができます。一方の縁部にピンセットでカバーガラスを保持します。バッファ降下は約子葉の上にあるように、スライドガラス上に反対側の端を置きます。
- それは子葉試料（ 図1、ステップ3）の真上になるように、スライド上の静止カバーガラスのエッジ、まだピンセットで反対側の縁部を保持して、カバーガラスの下にバッファのドロップの位置を調整します。カバーガラスを手放します。気泡のない準備で得られた試料のドロップをマウントします。
- 糸くずの出ない組織を使用して余分なバッファを拭き取ってください。すぐに準備を観察し（ステップ3を参照）。
注：サンプルをシールする必要はありません。
3. VAEM観察ムービー取得
倒立顕微鏡はTIRFユニットと1.49の開口数とTIRF対物レンズを搭載しています。注：以下のように本研究で使用するTIRF顕微鏡システム9について説明します 。レーザー入射角のコンピュータ制御は、制御ボックスが使用されます。緑色蛍光タンパク質（GFP）は、488nmの光励起半導体レーザで励起され、そしてt彼は、蛍光が葉緑体の自己蛍光を防ぐために、510から550 nmのバンドパスフィルタを介して検出されます。ファイバ出力電力の測定された最大値は13.0から13.5ミリワットです。検出のために、電子増倍電荷結合素子（EM-CCD）カメラヘッドシステムとCマウントカメラ倍率変更手段が使用されます。
- 製造元の指示に従ってを中心と集光レーザーを調整します。
注：この手順は、正確なVAEM観測のために重要です。それは強くレーザー経路の調整手順の定期的なチェックは、あなたの顕微鏡に応じて、実行することをお勧めします。- 顕微鏡室の天井に対物レンズのない光路で照射中心位置を決定します。中央の位置をマークするには、天井に色付きの円シールを置く（ 図2、ステップ1、2）。
- 対物レンズ（ 図2、ステップ3、4）で天井を照らします。私を移動します中心位置（ 図2、ステップ5）に地域をlluminated。レーザー（ 図2、ステップ6）フォーカス。微調整の中心に集光されたレーザ（ 図2、ステップ7）の位置。
- 顕微鏡のステージ上の試料をセットし、明視野照明を使用して観察するためのセルを選択します。
- 蛍光タンパク質は、細胞で観察することができることを確認し、落射蛍光照明（ 図3A）を用いて細胞表面でのz -軸位置を設定します。
- VAEM観測を行います。
- コントローラボックスで徐々にレーザービームの入射角を傾け。同時に、慎重にライブ映像を監視します。最初は、イメージが（ 図3B）ぼかされます。
- レーザー角が増加するにつれて、VAEM画像は最終的には鮮明な画像（ 図3CおよびD）を製造する 、より少ない不鮮明になるであろう。この時点で、increaを停止レーザー角度を歌います。蛍光信号が失われた場合、より浅い角度に減少します。
- 微調整のレーザー入射角は、より良好な画像を得ることができます。 Z -軸の位置の微調整は、画像を改善することができます。必要に応じて、光学パラメータ（レーザー出力、波長フィルタセット）を調整し、画像センサパラメータ[画像サイズ、露出時間、ゲイン、デジタイザと電子増倍（EM）ゲイン]。
注：以下のように上述のTIRF顕微鏡装置の場合には、代表的なパラメータです。ちょうどカメラの前でレンズの倍率：2倍。レーザー出力：1.0 mWの。画像サイズ：512×512ピクセル。露光時間：100ミリ秒。ゲイン：5×を。デジタイザ：11 MHzの。 EMゲイン：100。
- 商用顕微鏡ソフトウェアを使用して、複数ページのTIFF画像ファイルとして映画を取得します。ここでは、映画は、気孔細胞の表面上の点滅GFP標識されたドットです。
注：代表画像取得条件はFOLの通りであります安値。取得モード：ストリームは、RAMに。フレームの数：600;マルチページTIFFファイルサイズ：〜302メガバイト
フィジーソフトウェアを使用したGFP標識ドット滞留時間の定量化のための4カイモグラフ分析
- 著者の命令（http://fiji.sc/Fiji）を使用して、フィジー（ 'フィジーはちょうどImageJのである'）ソフトウェア10をインストールします 。
- フィジーを実行し、フィジーメニュー「 ファイルを開く」を使用して取得したマルチページTIFFファイルを開きます。
- フィジーツールバーメニュー「 直線選択ツール」を使用して 、目的の部位に線を配置します。必要に応じて、「 セグメント化されたライン選択ツール 」または「 フリーハンドライン選択ツール」を使用します。ここに提示した結果では、100ピクセル（8.0ミクロンに相当する）の直線を子会社細胞（ 図4A）の上に置きました。
- フィジーメニューの 「画像・スタックダイナミックResliceを使用してカイモグラフイメージを作ります図4B）。カイモグラフイメージで必要に応じて、「垂直フリップ 」とチェックボックスウィンドウで「90度回転」も（ここで提示された結果では使用されません）があり、x軸とy軸線位置に対応する（100画素を示しそれぞれ8.0μm）とし、観測時間（600ピクセルが60秒に相当）、。カイモグラフイメージが満足できない場合は、複数ページの画像上の線の位置と種類は（ストレート、セグメント化され、フリーハンド）のよう。変更することができますラインの変更、カイモグラフイメージが動的に変化します。フィジーメニュー「ファイルとして保存-TIFF」を使用して、TIFFファイルとしてカイモグラフ画像を保存します。
- 時間軸の向きにブロブの長さを測定します。
- ノイズリダクションを実行するには、フィジーメニュー「 プロセス・フィルタ-ぼかし（ガウス）」を使用してカイモグラフ画像にガウスフィルタを適用します。 「 シグマ（ラッドIUS）」パラメータが調整可能（1ピクセル半径が提示された結果のために使用される）です。
- セグメントフィジーメニューを使用して、しきい値による信号領域、「イメージ・調整・しきい値を 」。
注：選択可能ないくつかの閾値化アルゴリズムがあります。提示された結果では、「円」のアルゴリズムは、（ 図4C）を選択しました。 - メニューを使用してブロブの-軸の長さを時間（y）を測定するための準備」 を分析・セットの測定を 」。 「 セット測定」ウィンドウの「 境界の矩形」を確認してください。理想的には、領域セットは、ノイズを排除するために、可能な限り小さくすべきです。ここでは、最小面積は50ピクセルに設定しました。時間（y）を測定し、メニュー「 分析・解析粒子」を使用してブロブの長さを-axis。結果の値を取得し、測定領域の信頼性を証明するために、「 結果の表示」をチェックし、「Managerへの追加</ em>の "ボックス。
- 「 高さ 」の欄の値は、（y）が測定されたブロブ（ 図4D）のための長さを-axis時間です。結果テーブルメニュー「ファイルとして保存」を使用して値を保存し、計算し、統計パッケージ、および/ または表計算ソフト（ 図4E）を使用してブロブ画像期間のデータセットを処理します。
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Representative Results
このビデオの記事では、Aの GFP-PATROL1のVAEM観測のためのプロトコルシロイヌナズナ子葉気孔複雑な細胞が提供されています。空ドロップ実装はA.のVAEM調製物中の気泡の発生を減らすことができ、簡単な製造方法でありますシロイヌナズナ子葉（ 図1）。エントリーレーザーおよび/またはVAEMのための検体のz位置決めOvertiltingは不明画像を提供します。その場合、それは落射蛍光照明によって判断されるように、すぐにサンプル上の位置から再スタートすることをお勧めします。 VAEM観測の数日経験した後、それが成功し、日常VAEMムービーを取得することが可能であるべきで、GFP-PATROL1のここに示したような点滅が点在しています。 A.で12の独立した補助セル185からのGFP-PATROL1ドットの滞留時間は、 図4に示すカイモグラフ分析を使用してシロイヌナズナ子葉を測定しました。フィット密度関数は、ほとんどのGFP-PATROL1ドットは補助細胞表面上のプロトンポンプの高速エキソサイトーシス/エンドサイトーシスを示唆し、約3.5秒（ 図4E）のピークと、2〜10秒間の補助セルに常駐することが明らかになりました。
空ドロップ実装方法の概略図1.ステップ1：検体シロイヌナズナ子葉は、スライドガラス上の基底バッファのドロップに浮かべています。ステップ2：基礎緩衝液滴の滴をカバーガラス上に配置されます。ステップ3：ドロップとカバーガラスは、逆さまにして、ドロップがスライドガラス上の試料の上方に配置されています。ステップ4：カバーガラスが解除され、液滴が試料へ落ちます。 （トップ）鳥瞰図。 （下）横と拡大図。PLEASEこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.レーザーセンタリングのキャリブレーションおよび集束ステップ1：顕微鏡リボルバーの空の位置を顕微鏡上の天井にレーザ光 を送信するために選択されます。ステップ2：中央位置が天井に色付きの円シールを使用してマークされます。ステップ3：目的が選択されています。ステップ4：対物レンズを介してレーザ光を照射位置を確認してください。ステップ5：照明は、マークされた中心位置に調整されます。ステップ6：レーザ光が集光されます。ステップ7：集束レーザ光 がマーク中心位置に移動される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
落射蛍光顕微鏡と角度可変落射蛍光顕微鏡（VAEM）の図3の比較。（A）落射蛍光顕微鏡でのレーザーの光路の概略図。 （B） シロイヌナズナの7日齢の苗における子葉表面でのGFP-PATROL1の代表的なエピ蛍光画像。スケールバーは5μmで示しています。 （C）VAEMにおけるレーザの光路の概略図。レーザーのエントリが傾いていることに注意してください、そして、それは、可変深度で試料の表面を照明します。 （B）に示すように、同じ領域の（D）VAEM画像。スケールバーは5μmでことを示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.カイモグラフ分析は、GFP-PATROL1ドットの滞留時間を定量化する。（A）VAEMイメージをカイモグラフを作るために置い直線で。スケールバーは5μmで示しています。 （B）（A）に示される線に沿ってカイモグラフ画像。 （C）フィジーソフトウェアで生成された円のアルゴリズムに基づいて、（B）の二値画像、。黄色の線は、GFP-PATROL1信号の自動検出された領域を示しています。 （D）フィジー」粒子を分析し、「関数の結果テーブルのスクリーンショット。 （E）の子会社細胞におけるGFP-PATROL1ドットの滞留時間のヒストグラム。赤い線は密度関数を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このビデオの記事では、プロトコルは、 シロイヌナズナの気孔複合体上のGFP-PATROL1ドットの動的挙動を監視し、測定するために与えられています。ここに示されているように、VAEM観測は、植物の細胞表面のライブイメージングのための強力なツールです。高感度EM-CCDはVAEM光学系では比較的弱い励起レーザの使用を可能にするため、GFP-PATROL1の監視のためにここに使用した実験条件下では、ビデオキャプチャの1分間使用したサンプルはほとんど蛍光退色がありました。レーザーを中心と各実験の開始前に、焦点を当て、成功VAEM観測のために重要です。ユーザーがVAEMを使用する前に選択した顕微鏡会社から専門のスタッフによって訓練されるべきです。
VAEMは、GFP-PATROL1が原形質膜に点滅不動のドット状の区画とダイナミックな局在を持っていることが明らかになりました。蛍光標識された原形質膜プロトンポンプAHA1ミスLpatrol1変異孔辺細胞と子会社細胞でocalizes、以前に8,9を報告したように。したがって、VAEM可視化GFP-PATROL1ドットダイナミクスは、原形質膜へのプロトンポンプの送達を表すことができます。 GFP-PATROL1のこの動的挙動は、植物細胞の表面上のリアルタイムのタンパク質ダイナミクスを明らかにVAEMの有用性を示し、従来のガルバノミラー型共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて可視化することは困難です。 GFP-PATROL1観察は、植物細胞生物学におけるVAEMアプリケーションのほんの一例です。 VAEMは（植物細胞における細胞質の薄い表層における多数の事象のモニタリングに適用可能で、例えば、酵素の細胞壁合成の分泌または修飾11,12、原形質膜タンパク質のダイナミクス7,13,14、皮質微小管動態4アクチンミクロフィラメント4,15の再配列および細胞小器官の動き6）。植物細胞の科学者の広い範囲が恩恵を受ける必要がありますVAEM技術からフィット。
生物学的な画像データの定量的評価は、最近、顕微鏡装置およびコンピューティングの進歩によって駆動、重要になってきました。 600（T）画素×512（Y）×512（X）を含むVAEM動画データを容易にわずか数分で得ることができます。画像解析は、蛍光標識されたタンパク質の寿命や移動を測定するだけでなく、大規模な、多次元画像データセットからの生体情報をマイニングしていないだけに役立ちます。カイモグラフは、原形質膜2上に 、タンパク質の連続的補充によって示されるように、VAEM動画データから対象のタンパク質の移動を決定する基本的な、しかし有益なアプローチです。 図4に示すようにカイモグラフは、GFP-PATROL1ドット'滞留時間、および原形質膜へのそれらの低運動性の可視化を可能にした。逆に、カイモグラフは、細胞質のストリーミングなどのより複雑な動きを評価するための限られた有効性を有しています。もっとcompliについてcated動きは、このようなオプティカルフローなどの他の画像解析手法16が参考になります。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
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