Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man kan övervaka fluorescerande-märkta proteinet dynamik på växtcellytor med variabel vinkel epifluorescensmikroskopi, visar blinkande prickar av GFP-märkta PATROL1 ett membran handel protein i cellen cortex av stomata komplex i Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Framställning av Plantor
- Sterilisera frön.
- Förbered sterilisering lösningen genom att tillsätta 500 | il NaClO (tillgängligt klor: 5,0%) och 1 | il 10% Triton X-100 till 500 | il sterilt vatten.
- Placera ca 10 transgen A. thaliana frön bär GFP-PATROL1 8 i ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt 1 ml 70% etanollösning, och blanda väl genom att vända fem gånger. Låt stå i 1 min.
- Beakta fröna sjunka till botten av röret. I en ren laminärt flöde skåp, försiktigt bort 70% etanol med hjälp av en mikropipett, och tillsätt 1 ml steriliseringslösning. Blanda väl genom att vända fem gånger och låt stå i 5 minuter.
- Tvätta fröna. Fortfarande arbetar under aseptiska förhållanden på en ren bänk, försiktigt bort lösningen med en mikropipett, och tillsätt 1 ml sterilt vatten. Upprepa detta fem gånger. De steriliserade fröna kan förvaras i sterilt vatten vid 4 ° C under 2 dagar.
- Såw de steriliserade frön på en 0,5% gellangummi stelnade 1/2 Murashige och Skoog-medium platta (pH 5,8) 9. Tejpa fast locket på plattan med användning av två skikt av kirurgisk tejp.
- Inkubera plattan i mörker vid 4 ° C med en kall lagringskammare, O / N.
- Överför plattan i en tillväxtkammare inställd på 23,5 ° C med en 12-timmars / 12-timmars ljus-mörker cykel med 100 fimol m -2 s -1 vita lampor, och inkubera i 7 dagar. Plantor med hjärtblad på cirka 1 mm långa kan sedan skördas.
2. Sky Drop Montering av Cotyledon Prover
OBS: En viktig faktor vid provberedning för VAEM observationen är att undvika inkluderandet av luftbubblor mellan provet och täckglaset. Bubblor kraftigt minska bildkvaliteten hos VAEM genom att orsaka skillnader i brytningsindex. En enkel metod, som vi har kallat "himmel släpp" montering, kan användas för att undvika bubblormellan A. thaliana hjärtbladen och täckglaset. Detta bör ske omedelbart före observation.
- Placera 30 il basal buffert [5 mM 2- (N morfolino) -etansulfonsyra-Tris (MES-Tris) vid pH 6,5, 50 mM KCl, 100 iM CaCl2] i mitten av en glasskiva (storlek: 76 × 26 mm, tjocklek: 1,0-1,2 mm).
- Ta en cotyledon från en 7-dagars gamla plantor med hjälp av dissekera sax. Float kotyledonet med observationssidan uppåt på den basala buffert droppe (figur 1, steg 1).
- Placera 30 pl basal buffert i mitten av ett skyddsglas (storlek: 18 x 18 mm, tjocklek: 0,12-0,17 mm) (Figur 1, steg 2). Vrid täckglaset upp och ned försiktigt. Ytspänning förhindrar buffertdroppe från att falla av. Håll täckglaset med pincett på en kant. Placera den motsatta kanten på glasplatta så att buffertfallet är ungefär ovanför kotyledonet.
- Med kanten av täckglaset fortfarande på bilden, och fortfarande håller den motsatta kanten med pincett, justera läget för buffert droppe under täckglaset så att det är direkt ovanför prov hjärtbladsnod (Figur 1, steg 3). Släpp täckglaset. Montera en droppe på provet resulterar i en beredning utan luftbubblor.
- Torka bort överflödig buffert med hjälp av luddfria vävnader. Observera beredningen omedelbart (se steg 3).
OBS: Det finns inget behov att försegla proverna.
3. VAEM Observation och Movie Acquisition
OBS: TIRF mikroskopsystem 9 som används i föreliggande studie beskrivs på följande sätt: Ett inverterat mikroskop utrustat med en TIRF enhet och en TIRF objektivlins med en numerisk apertur på 1,49. För datoriserad kontroll av laseringångsvinkeln, är en styrbox som används. Grönt fluorescerande protein (GFP) exciteras med en 488 nm optiskt pumpad halvledarlaser, och than fluorescens detekteras genom ett 510-550 nm bandpassfilter för att förhindra autofluorescens från kloroplaster. Det uppmätta maximala värdet på fiber uteffekten är 13,0-13,5 mW. För detektion, (EM-CCD) kamerahuvud system och en C-fäste kamera förstoring förändring enhet en elektron multiplicera charge-coupled device används.
- Kalibrera lasern centrering och fokusering enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Detta steg är avgörande för exakt VAEM observationer. Det rekommenderas starkt att regelbundna kontroller av förfarandena justerings laser väg, passar din mikroskop, genomförs.- Bestäm centralt läge belyses med en objektiv fritt ljus stig på taket av mikroskopi rummet. För att markera det centrala läget, sätta en färgad cirkel sigill på taket (Figur 2, steg 1, 2).
- Belysa taket med en objektiv (Figur 2, steg 3, 4). Flytta den i:lluminated regionen i mittläget (fig 2, steg 5). Fokusera lasers (fig 2, steg 6). Finjustera positionen för den fokuserade laser till centrum (Figur 2, steg 7).
- Ställ ett prov på scenen av mikroskopet och välj celler för observation med hjälp av ljusa fält belysning.
- Kontrollera att det fluorescerande proteinet kan observeras i cellerna, och ställ in z -axeln position vid cellytan med hjälp av epifluorescence belysning (figur 3A).
- Utför VAEM observationer.
- Luta ingångsvinkeln för laserstrålen gradvis med styrenheten rutan. Samtidigt, övervaka den aktiva bilden noggrant. Initialt kommer bilden suddig (Figur 3B).
- När laservinkeln ökar, kommer VAEM bilden blir mindre suddig, så småningom ger en klar bild (Figur 3C och D). Vid denna punkt, sluta ökat sjsjunger laservinkeln. Om fluorescenssignalen går förlorad, minska till en grundare vinkel.
- Finjustera laseringångsvinkeln för att få en bättre bild. Finjustering av z -axeln ställning kan också förbättra bilden. Om det behövs, justera de optiska parametrarna (laser makt, våglängd och filter set) och bildsensor parametrar [bildstorlek, exponeringstid, förstärkning, digitizer och elektron multiplicera (EM) GAIN].
OBS: I fallet med TIRF mikroskoputrustning som beskrivs ovan, representativa parametrar är följande. Förstoring av linsen precis framför kameran: 2X; Lasereffekt: 1,0 mW; Bildstorlek: 512 × 512 pixlar; Exponeringstid: 100 ms; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; och EM vinst: 100.
- Skaffa en film som en flersidig TIFF-bildfil med hjälp av kommersiella mikroskop mjukvaran. Här är filmen med GFP-märkta punkter blinkar på ytan av stomatala celler.
OBS: representativ bild förvärvs villkor som foldalar. Förvärv Läge: Stream till RAM; Antal bilder: 600; och flersidig TIFF filstorlek: ~ 302 MB.
4. kymograph Analys för kvantifiering av GFP-märkt Dot Residence tid med hjälp Fiji Software
- Installera Fiji (Fiji är precis ImageJ) programvara 10 användning av författarnas instruktioner (http://fiji.sc/Fiji).
- Kör Fiji och öppna den förvärvade flersidig TIFF-fil med hjälp av Fiji menyn "File-Open".
- Placera en linje på stället av intresse, med hjälp av Fiji verktygsfältet menyn "Straight linjeval Tool". Du kan också använda "Segmented linjeval Tool" eller "Freehand linjeval Tool". I resultaten som presenteras här, var en rak linje på 100 pixlar (motsvarande 8,0 | am) placerades på ett dotterbolag cell (Figur 4A).
- Gör en kymograph bild med Fiji menyn "Image-Stacks-Dynamic Reslice (Figur 4B). Eventuellt "Flip vertikalt" och "Rotera 90 grader" i en kryssruta fönster finns också (används inte i de resultat som presenteras här). Den x- och y-axeln i kymograph bilden indikerar linjeposition (100 pixlar som motsvarar 8,0 pm) och observationstiden (600 pixlar vilket motsvarar 60 sek), respektive. Om kymograph bilden inte är tillfredsställande, läge och typ (rak, segmenteras och frihand) av linjen på den flersidig bild kan ändras. Som raden ändras, ändras kymograph bilden dynamiskt. Spara en kymograph bild som en TIFF-fil med hjälp av Fiji menyn "File-Save As-Tiff".
- Mät längden av fläcken i orienteringen av tidsaxeln.
- För att utföra brusreducering, tillämpa ett Gaussfiltret till kymograph bilder med Fiji menyn "Process-Filter-Gaussian Blur". Den "Sigma (Radius) "parameter är avstämbara (1 pixel radie används för de presenterade resultat).
- Segment signal regioner enligt tröskel, med hjälp av Fiji menyn "Image-Adjust-gräns".
OBS: Det finns flera tröskel algoritmer för att välja mellan. I presenterade resultat, var "Yen" algoritm valts (Figur 4C). - Förbered dig på att mäta tid (y) -axeln längd klump med hjälp av menyn "Analysera-Set Measurements". Kontrollera "avgränsande rektangeln" i "Set Measurements" fönstret. Helst området set bör vara så liten som möjligt, för att utesluta buller. Här var det minsta område som på 50 pixlar. Mät tiden (y) -axeln längd klump med hjälp av menyn "Analyze-analysera partiklar". För att erhålla resultatvärden och bevisa trovärdighet mätnings regionerna kontrollera "Visa resultat" och "Lägg till chef </ em> "lådor.
- Värden i "höjd" kolumnen är tiden (y) -axeln längder för den uppmätta blob (Figur 4D). Spara värdena med resultattabellen menyn "Arkiv-Spara som" och beräkna och bearbeta dataset av blob bild löptider med hjälp av en statistisk paket och / eller kalkylprogram (Figur 4E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna video artikeln, protokollen för VAEM observation av GFP-PATROL1 i A. thaliana cotyledon stomatala komplexa celler tillhandahålls. Sky droppe montering är en enkel framställningsmetod som kan bidra till att minska förekomsten av luftbubblor i VAEM beredningar av A. thaliana hjärtbladen (Figur 1). Overtilting av posten laser och / eller z-positionering av prover för VAEM kommer att ge en oklar bild. Om det händer, rekommenderas att börja om från ett läge omedelbart ovanför provet, att döma av epifluorescence belysning. Efter några dagars erfarenhet av VAEM observation, bör det vara möjligt att förvärva VAEM filmer framgångsrikt och rutinmässigt, såsom den som visas här av GFP-PATROL1 dot blinka. Med den analysmetod kymograph presenteras i Figur 4, de uppehållstider av 185 GFP-PATROL1 prickar från 12 oberoende dotterceller i A. thaliana kotyledoner mättes. Den monterade densitetfunktion visade att de flesta GFP-PATROL1 prickar var bosatta i ett dotterbolag cell för mellan 2 och 10 sekunder, med en topp på cirka 3,5 sekunder (Figur 4E), vilket tyder på snabb exocytos / endocytos av protonpumpar på dotterbolaget cellytan.
Figur 1. Schematisk av himlen droppe monteringsmetod Steg 1:. Prov Arabidopsis thaliana kotyledoner flotteras på en droppe av basal buffert på ett objektglas. Steg 2: En droppe av basal buffertdroppe placeras på ett täckglas. Steg 3: Täckglas med droppen vänds upp och ned och droppen placeras ovanför provet på objektglas. Steg 4: Täckglaset frigörs och droppe faller på provet. (Top) fågelperspektiv. (Längst ned) Lateral och förstorad vy. Pleas klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kalibrering av lasercentrering och fokusering Steg 1:. Den tomma positionen av mikroskop revolvern är vald för att sända laserljus mot taket ovanför mikroskop. Steg 2: Det centrala läget är markeras med en färgad cirkel sigill på taket. Steg 3: Ett mål är vald. Steg 4: Kontrollera positionen belyses med laserljuset genom objektivlinsen. Steg 5: Belysningen justeras till den markerade mittläge. Steg 6: Laserljuset fokuseras. Steg 7:. Den fokuserade laserljuset flyttas till den markerade mittläget Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämförelse av epifluorescensmikroskopi och variabel vinkel epifluorescensmikroskopi (VAEM). (A) Schematisk bild av strålgången för lasern i epifluorescensmikroskopi. (B) representant epifluorescence bild av GFP-PATROL1 på Cotyledon ytor i 7 dagar gamla plantor av Arabidopsis thaliana. Skala bar indikerar 5 pm. (C) Schematisk bild av ljusstrålen av lasern i VAEM. Observera att lasern inträde lutar, och den belyser provet yta med varierande djup. (D) VAEM bilder av samma region som visas i (B). Skala bar indikerar 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. kymograph analys för att kvantifiera en GFP-PATROL1 prick s uppehållstid. (A) VAEM avbildar med en rak linje placerad för att göra en kymograph. Skala bar indikerar 5 pm. (B) En kymograph bild längs linjen som visas i (A). (C) En binär bild av (B) baserad på Yen algoritm, som genereras i Fiji programvara. Gula linjer visar automatiskt detekterade region av GFP-PATROL1 signal. (D) Skärmdump av resultattabell i Fiji "analysera partiklar" -funktion. (E) Ett histogram av GFP-PATROL1 dot uppehållstid i dotterceller. Den röda linjen visar täthetsfunktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video artikeln är protokoll ges för övervakning och mätning av dynamiska beteende GFP-PATROL1 punkter på stomata komplex av Arabidopsis thaliana. Som visas här, är VAEM observation ett kraftfullt verktyg för levande avbildning av växtcellytor. Under de experimentella betingelser som används här för GFP-PATROL1 övervakning, det fanns mycket lite fluorescens fotoblekning i provet som används för en min av videoinspelning, eftersom den mycket känsliga EM-CCD möjliggör användning av en relativt svag excitation laser i VAEM optik. Laser centrering och fokusering, före början av varje försök, är viktiga för en framgångsrik VAEM observation. Användare bör utbildas av professionell personal från den valda mikroskop företaget innan du använder VAEM.
VAEM visar att GFP-PATROL1 har en dynamisk lokalisering med en orörlig punktliknande fack blinkar på plasmamembranet. De fluorescensmärkta plasmamembranprotonpumps AHA1 mis-localizes i patrol1 mutant vaktceller och dotterbolag celler, som tidigare rapporterats 8,9. Således kan VAEM-visualiseras GFP-PATROL1 punkt dynamik representerar leverans av protonpumps i plasmamembranet. Denna dynamiska beteende av GFP-PATROL1 är svårt att visualisera med konventionell galvanometerspegel-typ konfokala laserskanning mikroskopi, vilket indikerar användbarheten av VAEM att avslöja realtid proteindynamik på växtcellytor. GFP-PATROL1 observation är bara ett exempel på VAEM tillämpning i växtcellbiologin. VAEM skulle vara tillämplig på övervakningen av många händelser i det tunna kortikala lager av cytoplasman i växtceller (t.ex. enzymsekretion i cellväggssyntes eller modifiering 11,12, plasmamembranprotein dynamik 7,13,14, kortikala mikrotubuli dynamik 4, ombildning av aktin microfilaments 4,15 och organell rörelse 6). Ett brett utbud av växtceller forskare bör benepassar från VAEM tekniker.
Kvantitativ utvärdering av biologiska bilddata har nyligen blivit viktigt, drivet av utvecklingen i mikroskop utrustning och datorer. VAEM filmdata innehållande 512 (x) x 512 (y) x 600 (t) pixlar kan lätt erhållas på bara några minuter. Bildanalys hjälper inte bara att mäta livslängden eller förflyttning av en fluorescensmärkt protein, men också i gruv biologisk information från stora, multidimensionella bilddatamängder. En kymograph är en grundläggande, men värdefull, metod för att fastställa målproteinet rörelse från VAEM filmdata, såsom visas av den sekventiella rekrytering av proteiner på plasmamembran 2. Den kymograph tillät visualisering av GFP-PATROL1 prickar 'uppehållstider, och deras låga motilitet på plasmamembran, såsom visas i fig 4. Omvänt har en kymograph begränsad effektivitet för att utvärdera mer komplicerade rörelser, såsom cytoplasmisk strömning. För mer kostnadsfrirade rörelse, andra bildanalys metoder såsom optisk flöde 16 skulle vara till hjälp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
