Summary
该协议的目的是演示如何监测荧光标记蛋白动力学上的植物细胞表面与可变角荧光显微镜，表示闪烁GFP标记PATROL1，一个膜运输蛋白质的点，在所述气孔络合物在细胞皮质拟南芥。
Protocol
1.准备幼苗
- 消毒的种子。
- 和1μl10％的Triton X-100，以500微升无菌水：通过添加500微升的NaClO（5.0％有效氯）制备灭菌溶液。
- 广场约 10株转基因A.拟南芥种子携带的GFP-PATROL1 8成 1.5毫升管中。
- 加入1毫升70％的乙醇溶液，并通过反转五次拌匀。离开1分钟。
- 观察种子沉到试管底部。在洁净层流柜，轻轻取出使用微量的70％的乙醇，并加入1毫升消毒液。颠倒五次拌匀，离开5分钟。
- 洗净的种子。在无菌条件下仍然工作在一个干净的长椅，轻轻取出使用微量的解决方案，并加入1毫升无菌水。重复此五次。所述灭菌的种子可以被存储在无菌水中，在4℃下2天。
- 所以瓦特上的0.5％吉兰糖胶凝固1/2 MS培养基板（pH为5.8）9的消毒的种子。胶带盖到使用外科带的两层板。
- 孵育板在黑暗中，在4℃冷库室，O / N。
- 板转移到生长室设定在23.5℃，用100微摩尔米-2秒 -1白色灯12小时/ 12小时光照-黑暗周期，并培育7天。幼苗具有约1mm长子叶然后可以收获。
2.天空跌落安装子叶标本
注：在试样准备VAEM观测的一个重要因素是避免检体和盖玻璃之间的包含气泡。气泡通过使折射率差大大降低VAEM的图像质量。一个简单的方法，我们称之为“天上降”的安装，可以用来避免泡沫在A之间拟南芥子叶和盖玻璃。这应做之前立即观察。
- 放置30微升基础缓冲液[5mM的2-（N-吗啉代） -乙磺酸三（MES-TRIS）在pH 6.5，50mM的氯化钾，100μM的氯化钙 2]在载玻片上的中心（尺寸：76 ×26毫米，厚度：1.0-1.2毫米）。
- 从7日龄幼苗用解剖剪刀取出一个子叶。浮在子叶与观察侧朝上的基础缓冲器下降（图1，步骤1）。
- 放置30微升缓冲基底的上玻璃盖的中心（尺寸：18×18毫米，厚度：0.12-0.17毫米）（图1，步骤2）。打开玻璃盖倒挂平缓。表面张力将防止脱落缓冲器降。握住玻璃盖用镊子在一个边缘。将相对的边缘上的载玻片，使得缓冲器降是约高于子叶。
- 与盖玻璃载玻片上的边缘仍然，并仍然保持与镊子相对边缘，调整的玻璃盖下的缓冲器下降的位置，使得它直接子叶样品（图1，步骤3）的上方。放开玻璃盖。安装在导致制剂无气泡样本的下降。
- 擦去使用无绒毛组织中多余的缓冲区。立即观察的制备（见步骤3）。
注意：没有必要密封样品。
3. VAEM观察与电影采集
注：TIRF显微镜系统9在本研究中使用的描述如下：一个倒置显微镜配备有TIRF单元和TIRF物镜具有1.49的数值孔径。为激光入射角的计算机化的控制，控制盒被使用。绿色荧光蛋白（GFP）是激发488nm的光泵浦半导体激光器，和叔他荧光通过510-550纳米的带通滤波器检测，以防止自体荧光从叶绿体中。光纤输出功率实测最大值为13.0-13.5毫瓦。进行检测，电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）照相机头系统和一个C型相机放大率改变单元被使用。
- 校准根据制造商的说明将激光定心和聚焦。
注意：此步骤是为精确VAEM观测至关重要。强烈推荐的激光光路调整程序定期检查，适当的显微镜下，进行了。- 确定照射在显微镜房间的天花板的物镜无光路的中心位置。为了纪念中央位置，将彩色圆封在天花板上（ 图2，第1步，2）。
- 照亮带有物镜（图2，步骤3，4）的上限。动第illuminated区域的中心位置（图2，步骤5）。聚焦激光（图2，步骤6）。微调聚焦激光中心（ 图2，第7步）的位置。
- 设置一个标本在显微镜的阶段，选择单元格观察用明视场照明。
- 检查荧光蛋白可以在细胞中可以观察到，并设置的 Z轴位置上使用表面荧光照明（图3A）的细胞表面上。
- 执行VAEM意见。
- 与控制器箱倾斜的激光束的进入角逐渐。同时，仔细查看实时图像。最初，该图像会模糊（图3B）。
- 作为激光角度越大，VAEM图像将变得模糊少，最终产生一个清晰的图像（图3C 和 D）。在这一点上，停止increa唱激光角。如果荧光信号消失，减少到一浅角度。
- 微调的激光入射的角度，以获得更好的形象。微调的 Z轴位置的也可以提高图像。如果有必要，调整光学参数（激光功率，波长和过滤器设置）和图像传感器参数[图像尺寸，曝光时间，增益，数字化仪和电子倍增（EM）增益。
注意：在上述的TIRF显微镜设备的情况下，有代表性的参数如下。镜头只是在镜头前的放大倍率：2倍;激光输出：1.0毫瓦;图像尺寸：512×512像素;曝光时间：100毫秒;增益：5×;数字化仪：11兆赫;和EM增益：100。
- 获取电影如使用商业软件显微镜多页TIFF图像文件。这里，电影是GFP标记点闪烁气孔细胞的表面上的。
注：代表图像采集条件为FOL低点。采集模式：流到RAM;帧数：600;和多页TIFF文件大小：〜302 MB。
绿色荧光蛋白标记点停留时间4 Kymograph分析定量使用斐济软件
- 安装斐济（“斐济是仅有的ImageJ”）的软件10使用作者的指令（http://fiji.sc/Fiji）。
- 运行斐济和使用斐济菜单“文件- 打开 ”打开采集的多页TIFF文件。
- 将感兴趣的站点线路，使用斐济的工具栏菜单中的“ 直线选择工具 ”。或者，用“ 分段线路选择工具 ”或“ 写意线路选择工具 ”。在此处呈现的结果，为100像素（对应于8.0微米）的直线放置的附属小区（图4A）上。
- 请使用斐济菜单“图像-栈，动态一个重新分区图像kymograph 图4B）。任选地，在一个复选框窗口“垂直翻转 ”和“90度旋转”也可（在此处呈现的结果未使用）在kymograph图像的x轴和y轴表示线位置（相当于100像素8.0微米）和观测时间（相当于600个像素至60秒），分别如果kymograph图像不令人满意，位置和类型（直的，分割和多页图像上线的徒手）可被改变。作为线变化，kymograph图像动态变化，保存kymograph形象使用斐济菜单“文件- 另存为页TIFF”TIFF文件。
- 测量在时间轴的方向的斑点的长度。
- 要进行降噪处理，应用高斯滤波器使用斐济菜单“过程滤镜-高斯模糊 ”的kymograph图像。在“西格玛（拉德IUS）“参数是可调的（1个像素的半径被用于所提出的结果）。
- 段由阈值信号的区域，利用斐济菜单“图像-调整-阈值 ”。
注：有几个阈值的算法可供选择。在提出的结果中，“颜”算法被选择（图4C）。 - 准备使用菜单来测量时间（Y）的斑点的轴长“分析，集测量”。检查“ 设置测量”窗口中的“ 矩形边框 ”。理想的是，区域集应当尽可能小，以排除噪声。这里，最小面积设定在50个像素。测量时间（Y）的BLOB的使用菜单轴长度“分析-分析粒子”。要获得的结果值，证明了测量区域的信誉，勾选“ 显示结果 ”和“ 添加到管理器</ em>的“框。
- 在“高度”的列值的时间（y）的a轴的长度为所测量的斑点（图4D）。保存使用结果表菜单“文件- 另存为 ”的价值计算和处理团块图像的持续时间使用的统计数据包和/或电子表格软件（ 图4E）的数据集。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在这个视频文章，为VAEM A中观察GFP-PATROL1的协议提供了拟南芥子叶气孔复杂的细胞。天空降安装是一个简单的制备方法，可以帮助减少在 A中的VAEM制剂气泡的发生拟南芥子叶（ 图1）。 Overtilting条目激光和/或标本VAEM z定位将提供的图像不清晰。如果出现这种情况，则建议立即从样品上方的位置重新开始，作为判断通过荧光照明。后的VAEM观察几天的经验，应该有可能获得VAEM电影成功和常规，如这里所示的GFP-PATROL1的斑点闪烁之一。使用kymograph分析在图4中，185的GFP-PATROL1点从12个独立的副卫细胞在A中的停留时间呈现拟南芥子叶进行了测量。拟合密度功能显示，大部分GFP-PATROL1点的子公司小区居住的人，为2至10秒，大约3.5秒（ 图4E）的峰值，这表明快速胞吐/质子泵内吞作用的子公司细胞表面。
图1示意图的天空下降安装方法：步骤1：试样拟南芥子叶浮在基底缓冲器的载玻片上的下降。步骤2：将一滴基础缓冲器滴被放置在盖玻璃上。步骤3：玻璃盖与降上下翻转并且液滴被置于上述载玻片上的标本。步骤4：盖玻璃被释放，并且降落在到试样。 （上）鸟瞰图。 （底部）横向和放大图。PLEASE点击此处查看该图的放大版本。
图2.校准激光的定心和聚焦步骤 1：在显微镜左轮手枪的空位置被选择为激光光发送到显微镜上面的天花板。步骤2：中央位置用在天花板上的着色圆圈密封标示。第3步：客观选择。步骤4：检查通过物镜照射的激光光线的位置。步骤5：照明被调整到标记的中心位置。步骤6：激光聚焦。第七步：将聚焦激光移动到标记的中心位置请点击此处查看该图的放大版本。
图3.比较荧光显微镜和可变角度荧光显微镜（VAEM）的。（A）激光在荧光显微镜的光路示意图。 （B）中的GFP-PATROL1在拟南芥的7天龄的幼苗的子叶表面代表萤光图像。比例尺为5微米。激光在VAEM的光路的（C）的示意图。注意，激光的条目是倾斜的，并且它照亮试样的表面与可变深度。同一区域的（D）的VAEM图像，如图（B）中。比例尺为5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. Kymograph分析，以量化GFP-PATROL1点的停留时间。（A）VAEM图像直线放置做出kymograph。比例尺为5微米。 （二） 沿 （a）所示的A线kymograph图像。 （二）（ 三）二值图像的基础上甄子丹的算法，在斐济的软件生成。黄线显示GFP-PATROL1信号的自动检测到的区域。 （四）截图斐济的结果表“分析粒子”的功能。 （E）的子公司细胞GFP-PATROL1点的停留时间柱状图。红线显示密度函数。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这个视频文章，方案给出了监测和测量GFP-PATROL1点对拟南芥的气孔复杂的动态行为。如图所示，VAEM观察是一个强大的工具，用于植物细胞表面的实时成像。下这里使用的GFP-PATROL1监测实验条件下，有用于视频捕捉1分钟的样品中很少荧光光漂白，因为高度敏感的EM-CCD的允许使用在VAEM光学相对弱激发激光的。激光定心和聚焦，每次实验开始前，对于成功VAEM观察重要。用户应该由专业的工作人员从选择的显微镜公司使用VAEM前培训。
VAEM表明GFP-PATROL1具有动态定位与不动的点状隔室上闪烁质膜。荧光标记质膜的质子泵AHA1误升在patrol1突变保卫细胞和辅助细胞，ocalizes如先前报道8,9。因此，VAEM-可视GFP-PATROL1点动力学可表示输送质子泵入质膜。 GFP-PATROL1这种动态行为很难想象使用常规电反射镜型共聚焦激光扫描显微镜，表示VAEM在植物细胞表面露出实时蛋白动力学的有用性。 GFP-PATROL1观测是在植物细胞生物学VAEM应用的一个例子。 VAEM将适用于众多的事件在细胞质中的植物细胞的薄皮层的监视（例如，酶分泌细胞壁合成或修饰11,12，质膜蛋白动力学7,13,14，皮质微管动力学4，微丝4,15的重排和细胞器移动6）。种类繁多的植物细胞的科学家应该获益适合从VAEM技术。
生物图像数据的定量评价近来已成为重要的是，在显微镜设备和计算技术进步推动的。含512（x）的×512（y）的600×（t）的像素VAEM电影数据可以在只有几分钟容易地获得。图像分析有助于不仅在测量荧光标记的蛋白质的寿命或运动，而且在从大型，多维图像数据集挖掘的生物信息。甲kymograph是一个基本的，但有价值的，办法来确定靶蛋白运动从VAEM电影数据，如图由蛋白质的连续募集到质膜2。所述kymograph允许的GFP-PATROL1点'的停留时间的可视化，以及它们对质膜低蠕动， 如图4，反之，一个kymograph已经用于评估更复杂的运动，如胞质流效果有限。欲了解更多complicated运动，其他的图像分析方法，如光流16将是有益的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者有没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
