Summary
Phosphoinositider signalerer lipider hvis relative overflod hurtigt skifter som reaktion på forskellige stimuli. Denne artikel beskriver en metode til at måle den overflod af phosphoinositider ved metabolisk mærkning celler med 3 H- myo-inositol, efterfulgt af ekstraktion og deacylering. Ekstraherede glycero-inositides adskilles derefter ved højtydende væskekromatografi og kvantificeres ved flow scintillation.
Protocol
Bemærk! Teksten nedenfor beskriver i detaljer en metode til at måle PtdInsPs i gær. Det giver de eksperimentelle detaljer til mærkning gærceller med 3 H- myo-inositol, der udvinder og deacylere lipider og en HPLC-eluering protokollen til at fraktionere og kvantificere deacylerede PtdInsPs. Bemærk venligst, at mærkning, deacyleringen, opløsning og kvantificering af PtdInsPs i pattedyrceller kræver optimering og længere HPLC-elueringsprofiler. Disse oplysninger kan findes andre steder, selvom vi diskutere nogle af aspekter i diskussionen. Samlet set til den metodologi udtrække lipider, deacylere og udtrække det vandopløselige Gro-InsPs fra gær er angivet, og er illustreret i figur 1.
1. Protokol til mærkning og Analyse PtdInsPs i gær
- Cellekultur og radiomærkning
- Vokse en 20 ml flydende kultur af gærstammen SEY6210 ved 30 ° C under konstant omrystning i fuldstændig syntetiskemedier til midten af logaritmisk fase eller en optisk densitet ved 600 nm (OD600) på ca. 0,6-0,7.
Bemærk: Brug ikke YPD medier, da dette kan påvirke 3 H- myoinositol inkorporering. Denne kultur størrelse bør give tilstrækkelig materiale til 2-3 HPLC kørsler. - Pellet alt 10-14 OD af gærcellerne (bemærk at 1 ml kultur med en OD600 = 1 indeholder ~ 1x10 7 celler) ved centrifugering ved 800 xg i 5 minutter i en 12 ml rundbundet rør. Resuspender med 2 ml inositol-frie medier (IFM) (se tabel 1 for IFM sammensætning).
- Gentag centrifugering og aspireres medierne. Pelleten resuspenderes med 440 pi IFM og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tilføj 60 pi 3H-myoinositol (1 pi = 1 uCi) til hver prøve og inkuberes ved stigende temperatur på 30 ° C i 1 til 3 timer med konstant omrystning.
Forsigtig: 3 H- myo-inositol er et radioaktivt materiale, der skal håndteres efter passende uddannelse. Desuden bør alle forbrugsvarer, der gør kontakt med 3H-holdigt materiale være anbragt på passende vis og betegnes som radioaktivt affald.
Bemærk: Temperaturen vækst kan ændres efter behov, så længe alle stammer, der skal sammenlignes dyrkes ved samme temperatur. - Overfør cellesuspensionen (500 pi) til et mikrocentrifugerør indeholdende 500 pi 9% perchlorsyre og 200 pi syrevaskede glasperler. Bland ved inversion og inkuber på is i 5 minutter.
- Vortex prøven ved tophastighed i 10 minutter og overføre lysaterne til et nyt mikrocentrifugerør ved anvendelse af en gel-loading tip for at undgå glasperlerne.
- Pelletere prøven ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten aspireres.
- Resuspender pellet ved badsonikering i 1 ml iskold 100 mM EDTA. Pellet igen som før.
- Vokse en 20 ml flydende kultur af gærstammen SEY6210 ved 30 ° C under konstant omrystning i fuldstændig syntetiskemedier til midten af logaritmisk fase eller en optisk densitet ved 600 nm (OD600) på ca. 0,6-0,7.
- Deacylering og udvinding
- Aspirer EDTA og sonikeres pellet i 50 pi vand.
- Der tilsættes 500 pi af deacylering reagens og lydbehandling for at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Heat lipider til 50 minutter ved 53 ° C i en varmeblok. Tør prøverne helt ved vakuumcentrifugering løbet 3 timer eller O / N.
- Sikre, at en kemisk fælde er installeret mellem vakuum-centrifuge og vakuumpumpen for at forhindre dampene i at komme ind i luften.
- Pelleten resuspenderes med 300 pi vand ved badsonikering og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. Tør prøver ved vakuum centrifugering i 3 timer eller O / N. Gentag dette trin en gang mere.
- Sonikeres pellet med 450 pi vand. Dette er den vandige fase under ekstraktionen.
- Frisk forberede 10 ml af extraction reagens ved tilsætning af 8,0 ml 1-butanol, 1,6 ml ethylether og 0,40 ml ethylformiat. Vend for at blande.
- Der tilsættes 300 pi udvinding reagens til den vandige fase. Vortex blandingen ved tophastighed i 5 minutter, og lagene adskilles ved centrifugering ved tophastighed (18.000 xg) i 2 minutter.
- Opsaml nederste vandige lag i et nyt mikrofugerør og samtidig undgå det øverste organiske lag, grænsefladen og pillen. Gentag ekstraktion af den vandige fase yderligere to gange med frisk ekstraktion reagens.
- Helt tørre den opsamlede vandige lag ved vakuumcentrifugering. Dispergere pellet i 50 pi vand ved badsonikering.
- Tilsæt 2 pi af hver prøve til 4 ml scintillationsvæske i en 6 ml polyethylen scintillationshætteglas. Bestemme antallet af tællinger (i cpm) i hver prøve ved væskescintillation ved anvendelse af et åbent vindue.
- Opbevar prøverne ved -20 ° C indtil den er klar til HPLC.
- Forbered buffer A ved at filtrere 1 l ultrarent vand med en flaske top 0,22 um vakuumfilter, efterfulgt af afgasning.
- Forbered buffer B ved at en 1 L opløsning af 1 M ammoniumphosphat dibasisk (APS, MW 132,06) i vand, og pH justeres til 3,8 med phosphorsyre. Foretage ammoniumphosphat med en flaske top 0,22 um vakuumfilter, efterfulgt af afgasning.
- Saml hætteglasset injektion ved udrustning et 2 ml hætteglas med en fjederbelastet 250 pi lille volumen insert. Load 10 mio CPM og tilsæt vand til et samlet volumen på 55 pi. Forbered en tom hætteglas med 55 pi vand.
- Cap hætteglassene med skruelåg udstyret med en PTFE / silikone septa (rød side mod indersiden af hætteglasset). Placer hvert hætteglas i auto-prøveudtagning bakke af HPLC, begyndende med den tomme hætteglas.
- Brug en HPLC og tilhørende software, der styrer buffer flow, afgasser buffere og kontroller prøve plast propå. Brug en online flow scintillator og dens tilhørende software til at regulere scintillanten flow og til at overvåge de 3 H-henfald signal.
- Brug en SAX væskekromatografisøjle med dimensionerne 250 mm x 4,6 mm, og som indeholder 5 um silica harpiks i HPLC. Udstyre søjlen med en kolonne vagt for at forhindre injektion af kontaminanter.
- Installere en 3H-kompatibel 500 pi flowcelle i strømmen scintillatoren.
BEMÆRK: Fraktionering kan gøres med en Agilent 1200 uendelighedsrække HPLC-system kontrolleres af Chemstation software eller med andre kommercielt tilgængelige HPLC-systemer. Flow scintillation af HPLC eluent kan gøres med en β-RAM flow scintillator kontrolleres af Laura software eller anden kommercielt tilgængelig flow scintillator eller kompatibel software.
- Initialiser den kvaternære pumpe ved en strømningshastighed på 1,0 ml / min med 100% puffer A.
- Oprette en ligevægt profil på HPLCat kontrollere gradient af Buffer A og B (kalde dette "protokol A ækvilibrering"): 1% puffer B i 5 minutter, 1-100% B i 5 min, 100% B i 5 minutter, 100-1% B for 5 min, 1% B i 20 minutter. Indstil trykket loft på 400 bar, 1,0 ml / min strømningshastighed, og 30 minutter køretid.
- Oprette en elueringsprofil (figur 2) på HPLC for at kontrollere gradient af Buffer A og B (kalde dette "protokol A"): 1% B i 5 minutter, 1-20% B i 40 min, 20-100% B i 10 minutter, 100% B i 5 minutter, 100-1% B i 20 minutter, 1% B i 10 minutter. Indstil trykket loft på 400 bar, 1,0 ml / min strømningshastighed, og 90 min køretid.
- Opsætning af en afsløring protokol på strømmen scintillator (kalder dette "protokol A afsløring") til at køre i 60 min, med en scintillationsfluid flowhastighed på 2,5 ml / min og en 8,57 sek opholdstid.
- Program en automatiseret injektion sekvens på HPLC til at begynde med vandet blank på "Protokol En ligevægt" efterfulgt af eACH radioaktivt mærket prøve på "Protokol A". Initialiser rækkefølge, når klar.
- Mens kørslen er stadig på ækvilibreringen protokollen, skal du oprette et parti på strømmen scintillator til at måle alle prøverne med "Protokol En afsløring." Indsprøjtning af hver ny prøve vil initialisere "Protokol A" på HPLC, mens udløse strømmen scintillator til at begynde "Protokol En afsløring."
- Ved afslutningen af alle kørsler, skylle HPLC kolonnen og flow scintillator med 100% puffer A i 30 minutter ved 1,0 ml / min strømningshastighed.
- Brug Laura software eller enhver anden software, der kan kvantificere kromatografi spektre. De beskrevet i dette afsnit trin er afbildet i figur 3.
- Åbne filerne ved at klikke på "File", "Open", og vælg den rå datafil for hver prøve.
- I fanebladet "kromatogrammer", zoabout i at strække hver af de mindre toppe (ca. 1000 tællinger [y-aksen]), mens fastholde den tid opløsning. Ind i hver enkelt top evt.
- Fremhæv hver af toppene til analyse ved hjælp af "Tilføj ROI" værktøj. Identificer toppe ved tidspunktet for eluering: Parental Gro-Ins på 10 min, Gro-Ins3P på 18 min, Gro-Ins4P ved 20 min, Gro-Ins (3,5) P2 på 29 min og Gro-Ins (4,5 ) P 2 ved 32 min.
- I fanebladet "regioner tabeller", optage "område (tæller)" af hver top. Bemærk "start (mm: ss)" tid og "ende (mm: ss)" tid af hver top.
- For baggrundssubtraktion fremhæve et område der støder op til den top, der spænder over den samme mængde tid. Fratræk antallet af tællinger fra den tilsvarende top.
- Normalisere området af hver top mod forældrenes Gro-Ins (udtrykt som "% af de samlede Ptdlns"). Derefter normalisere hver af toppene i hver forsøgsgruppe stand mod kontrol tilstand (udtrykt som "nfold stigning i forhold til at styre ").
BEMÆRK: Normalisering af hver top kan også ske mod totale tællinger, men da den parentale Gro-Ins er meget mere hyppigt forekommende end alle andre PtdInsPs resultaterne tendens til at være ens. - Eksportere data for de chromatografer ved at trykke på "Filer", "Gem som ...", og vælg "CSV (kommasepareret)" filformat. Plot data på et regneark og præsentere som nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne fremgangsmåde, blev gær PtdInsPs metabolisk mærket med 3H-myoinositol. Efter mærkning blev phospholipiderne udfældes med perchlorsyre, efterfulgt af phospholipid deacylering og ekstraktion af vandopløselige Gro-InsPs (figur 1). På dette stadium er det vigtigt at bestemme den samlede radioaktive signal associeret med den ekstraherede Gro-InsPs ved væskescintillation at sikre tilstrækkelig signal-til-støj-forholdet for de meget lav tæthed PtdInsPs som Ptdlns (3,5) P2; i alt 5-10 millioner CPM bør injiceres. Da gærceller udviser kun fire PtdInsPs, kan opnås opløsning med 1 times eluering som beskrevet (figur 2).
Her vildtype, atg18 A og vac14 A gærmutanter blev mærket og behandlet for at analysere ændringer i PtdIns (3,5) P2, the mindst rigelige af PtdInsPs i gær 16,19,27. Som anført i figur 4A-C, elueringsprofilen for alle tre stammer fremstillet 3 H-associeret signalspidser. Den parentale Gro-Ins peak eluerer først (8-9 min; vist i figur 3, men ikke i figur 4, da Gro-Ins overskygger signalet af phosphorylerede arter), efterfulgt af Gro-Ins3P (~ 18 min), Gro Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P2 (~ 29 min) og Gro-Ins (4,5) P2 (~ 32: 00 min), der henholdsvis svarer til de acylerede phospholipider Ptdlns, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P2 og Ptdlns (4,5) P2. Der er et par yderligere mindre toppe ved 4 min og en, der har tendens til at følge umiddelbart efter den forælder Gro-Ins (10 min); disse sandsynligvis repræsenterer inositol og en ikke-glycerineret inositide fosfater (figur 3). Elueringsmønsteret er konsekvent og karakteristisk, selvom det nøjagtige tidspunkt kan variere, når der anvendes en diffeleje HPLC-system og / eller en ny kolonne.
Toppen forbundet med PtdIns (3,5) P2 (figur 4, rød pil) gennemgår den mest dramatiske skift mellem vildtype, atg18 Δ og vac14 A gærstammer. I forhold til vildtypeceller (A), der er en meget stor Gro-Ins (3,5) P2-associeret signal i atg18 A celler og en mindre top i vac14 A gærceller. For at bestemme den samlede radioaktive signal associeret med hver top blev tællingerne integreres under arealet af den top (figur 3). Eftersom absolut radioaktive signal varierer mellem prøver blev den parentale Gro-Ins arter anvendes som en intern kontrol ved at normalisere imod det (man kan også vælge at normalisere mod totale tællinger). Ved at gøre dette, tyder dataene på, at PtdIns (3,5) P2 kun udgør 0,07% af PtdIns i vildtype gærceller, mens PtdIns (3,5) P 2 svarer til 1,2% af de parentale Ptdlns i atg18 A celler, eller en dramatisk 17-fold stigning i PtdIns (3,5) P2 i forhold til vildtypeceller (figur 4A, B og D). Til sammenligning PtdIns (3,5) P 2 niveauer var kun 0,01% af PtdIns signal i VAC14 -deleted gærceller, en 85% tab i PtdIns (3,5) P2 (figur 4C og D). Samlet set disse målinger er i overensstemmelse med offentliggjorte resultater viser, at Ptdlns (3,5) P 2 er ca. 0,1% af Ptdlns i vildtypeceller, 90% reduceret i vac14 D, og 10 til 20-gange højere i atg18 D-celler i forhold til vildtypeceller 27,29.
Figur 1. Deacylering og udvinding af 3H-Gro-Insp. Radioaktivt mærket Lipid bundfald i perchlorsyre vaskes med vandig opløsning af EDTA. Dette er så aspireret, og deacylering reagens tilsat og inkuberet ved 53 ° C. Deacyleringen Reaktionsblandingen vakuumtørres derefter og vaskes to gange med vand, efterfulgt af tilsætning af ekstraktion reagens. Dette derpå vortexes, centrifugeret, og den vandige fase opsamles. Ekstraktionen gentages tre gange i alt for at fjerne organiske og uopløselige urenheder. Den vandopløselige fraktion (blå), som omfatter 3 H-Gro-INSP, vakuumtørres derefter og hydreret med 60 pi vand. Mængden af radioaktivitet bestemmes ved væskescintillation (CPM) og lige tællinger på tværs af prøverne er indlæst i HPLC. Klik her for at se en større version af dette tal.
<br /> Figur 2. gradient af ammoniumphosphatpuffer til eluering af 3H-Gro-Insp. resolution af Gro-Insp af stærk anionbytningschromatografi afhænger af anvendelsen af ammonium dibasisk, pH 3,8 (puffer B). Valget af gradient afhænger af blanding af Gro-Insp arter rådighed for separation. Er protokol A anvendes til gær prøver, som besidder kun fire PtdInsPs. Opløsning af hver af de fire toppe er tilstrækkeligt med en hurtig stigning i (NH 4) 2 HPO 4 koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Guidet instruktion til dataanalyse af PtdInsP overflod. Datafiler er indlæst på Laura software og evalueres visuelt ved hjælp kromatografen (åben som standard). Brug af "zoome ind" værktøj (a), forstørre toppene (b). Vælg tydelige toppe på kromatografen ved hjælp af "tilføj ROI" værktøj (c). I fanebladet "region tabellen" (d), er alle resulterende oplysninger fra de fremhævede områder af interesse vises som en enkelt tabel (e). Eksportere de rå tællinger af hver top (f) og normalisere hver PtdInsP art mod forældrenes phosphatidylinositol (g) eller mod alt tæller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. PtdIns (3,5) P2 niveauer i vildtype og mutant gærceller. Repræsentative chromatografer er vist for strømmen scintillation af ekstrakteted 3 H-Gro-InsPs fra vildtype (A), atg18 Δ (B), og vac14Δ (C) gærstammer hjælp protokol A. De rå tæller fra regionerne af interesse svarende til gro-Ins (3,5) P 2 (pil) er udvundet fra kromatografen og baggrunden fratrukket. De resulterende værdier sammenlignes med vildtype og udtrykt som fold-ændring i Gro-Ins (3,5) P 2 niveauer (D). Niveauerne og ændringer i Gro-Ins (3,5) P2 fortolkes til at vise niveauer og ændringer i de oprindelige Ptdlns (3,5) P 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Inositol-frit medium (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% glukose |
| 0,01 mM KH2PO4 |
| 1X Aminosyrer |
| 1X LPSM |
| 1X Sporstoffer |
| 5X Vitaminer |
| 10X Lav fosfat og sulfat medier (LPSM) |
| 9 mM CaCl2 |
| 17 mM NaCl |
| 67 mM KCI |
| 1.000X Sporstoffer |
| 8 mM Borsyre |
| 250 uM CuSO4 |
| 602 uM KI |
| 1.23 mM FeCl3 |
| 2,65 mM MnSO4 |
| 971 uM Na-molybdat |
| 2,48 mM ZnSO4 |
| 500X Vitaminer |
| 4 uM biotin |
| 2,27 uM Folinsyre |
| 1.62 mM Niacin |
| 729 pM p-aminobenzoesyre |
| 973 uM Pryidoxine-HCI |
| 266 uM Riboflavin |
| 593 uM thiamin-HCI |
Tabel 1. Sammensætning af gær-inositol-frie medier. Gærceller radiomærkes med IFM som basismediet suppleres med 3H-myoinositol. Forbered en 100 ml opløsning af IFM ved hjælp af løsninger angivet, Filtersteriliser ved anvendelse af en flaske top 0,22 um vakuumfilter og opbevares ved stuetemperatur. For at fremstille lav phosphat og sulfat medier (LPSM), generere en 100 ml opløsning under anvendelse af de angivne salte, Filtersteriliser ved anvendelse af en flaske top 0,22 um vakuumfilter og opbevares ved stuetemperatur. Opløs de angivne salte til at forberede en 1 L 1.000 x opløsning af sporstoffer. Bland grundigt før brug og / eller gemme portioner ved -20 ° C. Opløs de angivne vitaminer for at fremstille en 1 L 500x vitamin opløsning. Bland grundigt før brug og gemme portioner ved -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver forsøgsprotokollen kræves for at kvantificere cellulære niveauer af PtdnsPs ved HPLC-koblede strøm scintillation fra gær. Den metode giver den metaboliske mærkning af PtdInsPs med 3H-myoinositol, efterfulgt af lipid forarbejdning og udvinding af vandopløselige 3H-Gro-InsPs, HPLC fraktionering og analyse. Ved hjælp af denne metode, kan de relative niveauer af PtdInsPs i celler under forskellige betingelser kvantificeres, således som det er vist for PtdIns (3,5) P 2 i vildtype, vac14 D og D atg18 gærceller (Figur 4).
Der er en række kritiske trin og modifikationer, der kan gøres for at optimere resultaterne og / eller fejlfinding. En af de vigtigste parametre for at opnå pålidelig kvantificering af PtdInsPs er den samlede radioaktivt signalniveau. Typisk injektion 3-5 millioner tællinger i HPLC ofte tilstrækkelig til på pålidelig kvantificere ændringer i hiGher overflod PtdInsP arter såsom PtdIns (4,5) P2. Injektion af op til 10 millioner tællinger, kan imidlertid være nødvendig for kvantificering af lavere tæthed arter som Ptdlns (3,5) P2. Der er forskellige parametre, der kan påvirke niveauet af radioaktive signal opnået herunder det samlede antal celler anvendes til fremstilling af prøven, mærkning tid og temperatur, koncentrationen af 3H-myoinositol, omsætningstakten PtdInsPs og den endogene syntese inositol, som kan konkurrere med den radiomærkede inositol. For eksempel radiomærkning gærceller for mindst en fordoblingstid muliggør metabolisk inkorporering af 3H-myo- inositol i PtdInsPs, men forlængelsen af mærkningen tid til gærmutanter, der vokser langsommere eller har langsommere metabolisk aktivitet kan være nødvendig. Desuden protokollen beskrevet her anvender en diauxic forskydning af gærkultur, hvor celler dyrket til midt-log-fase koncentreres derefter foR mærkning over en fordoblingstid. Men man kan reducere diauxic skift ved mærkning celler under tidlig og midt-log-fase og i længere perioder af tid som tidligere gjort 32. I at gøre dette, disse forfattere observerede højere niveauer af PtdIns (3) P, PtdIns (4) P og PtdIns (4,5) P2 end celler, der undergår diauxic skift 32.
Ligeledes kan den periode, pattedyrceller mærkning kræver optimering, da nogle pattedyrceller som RAW 264.7 makrofag linjen fordobles hver 12 timer, mens andre kan opdele meget langsommere, eller som i tilfælde af neuroner, slet ikke 20,35,39. Desuden kan man øge koncentrationen af 3H-myoinositol for at opnå en ideel radioaktivt signalniveau. Vær dog opmærksom på, at nogle 3 H- myo-inositol er pakket i 90% ethanol, tilføjer overdreven 3 H- myoinositol vil øge ethanol indholdet i medierne og kan have en utilsigtet effect på cellerne. Endelig kan forlænges radiomærkning også sulte cellerne i inositol. Dette er især tydeligt i pattedyrcellekultur når fuldstændige DMEM indeholder 40 pM myoinositol, sammenlignet med 0,5 uM 3H-myoinositol når de er mærket med 10 uCi / ml. Således, hvis nødvendigt, anbefales blot at øge antallet af pattedyrceller under mærkning.
De cellelysis og lipid forarbejdningstrin er også kritisk for at opnå en optimalt udbytte, samt at opretholde sundheden af HPLC-søjle. Lysis med perchlorsyre muliggør udfældning af lipider og andre makromolekyler, en fremgangsmåde først anvendes til vævskultur og senere anvendt for gær 28,33. I forhold til udvinding af totale lipider ved hjælp af den traditionelle methanol / HCI / chloroform metode, brug af perchlorsyre forbedrer inddrivelsen af PtdInsPs, herunder Ptdlns (3,5) P 2, med mindre variation mellem eksperimenter 28. Subgende anvendelse af methylamin bryder esterbindinger mellem glycerolgrundskelettet og de to hydrofobe acylkæder og efterlod vandopløselige Gro-Insp at være fase-adskilt fra frie fedtsyrer og intakte lipider 28,34. Skal der udvises særlig omhu for at undgå overførsel uønskede organiske opløsningsmidler og uopløseligt materiale under ekstraktionstrinnet. Dette kan tilstoppe systemet, forårsage trykspidser og / eller kemisk skade kolonnen. Desuden kolonnen skal konditioneres ved begyndelsen af hver dag ved at udsætte kolonnen til en høj koncentration af ammoniumphosphat (puffer B) før brug; Således er en kort "Ækvilibrering" anvendte protokol, før du kører eksperimentelle prøver. Undladelse af at gøre dette condition trin resulterer i en forsinket elueringsprofil af Gro-InsPs toppe i første eksperimentelle prøve, der køres.
Der er flere vigtige punkter i forbindelse med analyse og kvantificering til at overveje så godt. For det første quantification selv bør være en integration af signalet og areal af hver top, ikke kun tophøjden. Desuden er normalt nødvendigt en intern kontrol, fordi det absolutte integration signal for hver top kan variere betydeligt mellem prøver og eksperimenter uden afspejler en ændring i PtdInsP overflod i en celle. Forældrenes Gro-Ins peak typisk ansat som den interne kontrol ved at normalisere hver Gro-Insp højdepunkt imod det. Gro-Ins peak besidder typisk næsten 90% af det radioaktive signal og ikke har tendens til at skifte mellem tilstande. Alternativt kan man vælge at normalisere mod totaltællinger, især hvis man har mistanke om, at de parentale PtdIns lider af en væsentlig ændring i de eksperimentelle betingelser. Endelig for lav hyppighed PtdInsPs, er baggrundssubtraktion anbefales ved at definere en nærliggende ikke-topareal med samme "tidsskala" som toppen af interesse (figur 3D).
En sidste overvejelse vedrøreranalyse af prøver fra pattedyr, som besidder syv PtdInsP arter, herunder tre mono-phosphorylerede og tre bis-phosphorylerede arter. Desværre er det vanskeligt fuldt ud at løse PtdIns4P fra PtdIns5P, og Ptdlns (3,5) P 2 fra Ptdlns (3,4) P 2 i prøver pattedyr, hvilket resulterer i konjunktion dobbelt-toppe. Der er flere metoder tidligere offentliggjorte der øger opløsningen på disse toppe. Typisk indebærer dette at ændre længden af eluering startkoncentration ammoniumphosphatpuffer, hastigheden og trin, hvorved ammoniumphosphatpuffer koncentration ændringer i elueringsprofilen og pH af ammoniumphosphatpuffer 33,35-38. Måske den mest succesfulde metode udviklet til at adskille Ptdlns (4) P og PtdIns (5) P blev for nylig beskrevet af Sarkes og Rameh 39, der beskæftigede to tandem SAX kolonner og et ammoniumsalt phosphatpuffer ved pH 6,0.
Som med de fleste metoder, under anvendelse af HPLC-coupled flow scintillation at kvantificere PtdInsPs i celler har fordele og ulemper i forhold til andre tilgængelige metoder. For eksempel online flow scintillations koblet til HPLC tilbyder levende-detektering af Gro-InsPs men begrænser scintillationstælling tid, hvilket reducerer følsomheden af denne metode. Alternativt kan HPLC eluenten være fraktion indsamlet med en auto-sampler i stedet for at fodre i et flow scintillator. De manuelle fraktioner kan derefter læses af en off-line væskescintillationstæller for længere perioder, hvilket giver højere følsomhed - alligevel denne fremgangsmåde er mere tidskrævende og arbejdskrævende og mindsker opløsningen afhængigt af antallet af fraktioner opsamles 38,40 . Derudover analyse af hele celler entydigt måler niveauerne af en bestemt PtdInsP, men det vil ikke oplyse om ændringer i den subcellulære fordeling af denne PtdInsP, selvom man kunne parret flow scintillation til sub-cellulære fraktioneringsmetoder som previousnu gjort 39. Til sammenligning FP-baserede PtdInsP-bindende domæner er anvendelige til at undersøge placeringen og dynamik en PtdInsP arter i en celle, men kan også binde til andre end målet PtdInsP faktorer. Også den her beskrevne fremgangsmåde forenkler analyse af PtdInsP niveauer ved at fjerne de acylkæder, hvilket i høj grad forøger den molekylære mangfoldighed PtdInsPs. Men af samme grund, det er også en vigtig ulempe, da deacylering af lipider fører til et tab af strukturel information om acylkæden, en underappreciated aspekt af PtdInsP signalering 41,42. Hvis dette er til stor bekymring, da væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) bør anvendes 14,17. Det er imidlertid i øjeblikket vanskeligt at samtidigt analysere alle PtdInsPs arter ved LC-MS 43. Således er en kombination af metoder er den bedste fremgangsmåde for at undersøge placeringen, dynamik, molekylær diversitet og omfang af alle syv PtdInsPs arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
