Summary
Fosfoinositider signalerar lipider vars relativa överflöd snabbt ändras som svar på olika stimuli. I den här artikeln beskrivs en metod för att mäta förekomsten av fosfoinositider genom metaboliskt märknings celler med 3 H- myo-inositol, följt av extraktion och deacylering. Extraherade glycero-inositides separeras sedan genom HPLC och kvantifieras av flödes scintillation.
Protocol
Obs: Texten nedan beskriver i detalj en metod för att mäta PtdInsPs i jäst. Det ger experimentella detaljer för märkning av jästceller med 3 H- myo-inositol, utvinna och deacylera lipider och en HPLC-elueringsprotokollet att fraktionera och kvantifiera deacylerade PtdInsPs. Observera att märkning, deacylering, upplösning och kvantifiering av PtdInsPs i däggdjursceller kräver optimering och längre HPLC-elueringsprofiler. Dessa uppgifter kan hittas någon annanstans, även om vi diskutera några aspekter i diskussionen. Totalt sett den metod extrahera lipider, deacylera och extrahera den vattenlösliga Gro-InsPs från jäst är given och illustreras i figur 1.
1. Protokoll för Märkning och Analysera PtdInsPs i jäst
- Cellkultur och radiomärkning
- Odla en 20 ml flytande kultur av jäststammen SEY6210 vid 30 ° C med konstant skakning i kompletta syntetiskamedia till mitten av log-fas eller en optisk densitet vid 600 nm (OD 600) på ungefär 0,6 till 0,7.
Obs: Använd inte YPD media eftersom det kan påverka 3 H- myo-inositol inkorporering. Denna kultur storlek ska ge tillräckligt underlag för 2-3 HPLC körningar. - Pellets totalt 10-14 OD av jästceller (observera att en ml kultur med en OD 600 = 1 innehåller ~ 1x10 7 celler) genom centrifugering vid 800 x g under 5 min i en 12 ml rundbottnad röret. Resuspendera med 2 ml inositol fritt medium (IFM) (se tabell 1 för IFM komposition).
- Upprepa centrifugeringen och aspirera media. Återsuspendera pelleten med 440 | il av IFM och inkubera vid RT i 15 min.
- Tillsätt 60 | il 3 H- myo-inositol (1 ^ il = 1 ^ iCi) till varje prov och inkubera vid den växande temperatur av 30 ° C under 1 till 3 h med konstant skakning.
Varning: 3 H- myo-inositol är en radioaktiv kompisrial som bör hanteras efter lämplig utbildning. Dessutom bör alla förbruknings som gör kontakt med 3 H-innehållande material vara anordnade på lämpligt sätt och betecknades som radioaktivt avfall.
Obs: Tillväxttemperaturen kan ändras efter behov, så länge som alla stammar som skall jämföras odlas vid samma temperatur. - Överför cellsuspensionen (500 ^ il) till ett mikrocentrifugrör innehållande 500 | il 9% perklorsyra och 200 ul av syratvättade glaspärlor. Blanda genom att vända upp och inkubera på is i 5 minuter.
- Vortexa provet vid högsta hastighet under 10 minuter och överföra lysaten i ett annat mikrocentrifugrör med användning av en gel-laddning spets för att undvika glaspärlorna.
- Pellets provet vid 12 tusen xg under 10 min vid 4 ° C och aspirera supernatanten.
- Suspendera pelleten genom badet sonikering i 1 ml iskall 100 mM EDTA. Pellets igen som tidigare.
- Odla en 20 ml flytande kultur av jäststammen SEY6210 vid 30 ° C med konstant skakning i kompletta syntetiskamedia till mitten av log-fas eller en optisk densitet vid 600 nm (OD 600) på ungefär 0,6 till 0,7.
- Deacylering och utvinning
- Aspirera EDTA och sonikera pelleten i 50 pl vatten.
- Tillsätt 500 l av deacyleringen reagens och sonikera att blanda. Inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter.
- Värme lipider för 50 min vid 53 ° C i ett värmeblock. Torka proverna helt genom vakuumcentrifugering över tre timmar eller O / N.
- Se till att en kemisk fälla är installerad mellan vakuumcentrifug och vakuumpumpen för att hindra ångor från att inträda i luften.
- Återsuspendera pelleten med 300 ul av vatten genom badet sonikering och inkubera vid RT i 20 min. Torka proverna med vakuumcentrifugering under 3 h eller O / N. Upprepa det här steget en gång.
- Sonikera pelleten med 450 | il vatten. Detta är den vattenhaltiga fasen under extraktionen.
- Färskt förbereda 10 ml av extraction-reagens genom tillsättning av 8,0 ml 1-butanol, 1,6 ml etyl-eter och 0,40 ml etylformiat. Vänd att blanda.
- Tillsätt 300 ul av extraktionen reagens till den vattenhaltiga fasen. Vortex blandningen vid högsta hastighet under 5 minuter och skikten separerades genom centrifugering vid topphastighet (18 tusen xg) i 2 minuter.
- Samla det nedre vattenskiktet till ett nytt mikrofugrör och samtidigt undvika det övre organiska skiktet, gränssnittet, och pelleten. Upprepa extraktionen av vattenfasen ytterligare två gånger med färsk extraktion reagens.
- Helt torr den uppsamlade vattenskiktet genom vakuumcentrifugering. Dispergera pelleten i 50 pl vatten genom badet sonikering.
- Tillsätt 2 | j, l av varje prov till 4 ml scintillationsvätska i en 6 ml polyeten scintillationsflaska. Bestämma antalet räkningar (i CPM) i varje prov genom vätskescintillation med användning av ett öppet fönster.
- Lagra proverna vid -20 ° C tills redo för HPLC.
- Förbered buffert A genom att filtrera en L av ultrarent vatten med en flasktopp 0,22 fim vakuumfilter, följt av avgasning.
- Bered buffert B genom att göra en 1 L lösning av 1 M ammoniumfosfat dibasisk (APS, MW 132,06) i vatten och justera pH till 3,8 med fosforsyra. Filtrera ammoniumfosfat med en flasktopp 0,22 fim vakuumfilter, följt av avgasning.
- Montera injektionsflaska med utrusta en 2 ml injektionsflaska med en fjäderbelastad 250 pl liten volym insats. Load 10 miljoner CPM och tillsätt vatten för en total volym av 55 | il. Förbered en tom flaska med 55 l vatten.
- Förslut rören med skruvlock utrustad med en PTFE / silikon septa (röd sida vänd mot insidan av flaskan). Placera varje flaska i auto-provtagning facket på HPLC, som börjar med den tomma flaskan.
- Använd en HPLC och tillhörande programvara som styr buffertflöde, avgasar buffertar och kontroller prov injectipå. Använd en online-flöde scintillator och dess tillhörande mjukvara för att reglera scintillant flödet och övervaka 3 H-sönderfall signal.
- Använd en SAX vätskekolonnkromatografi med måtten 250 mm x 4,6 mm och som innehåller 5 pm kisel harts i HPLC. Utrusta kolonnen med en skyddskolonn för att förhindra injektion av föroreningar.
- Installera en 3 H-kompatibel 500 pl flödescell i flödes scintillator.
OBS: Fraktionering kan göras med en Agilent 1200 oändlighet serie HPLC-system som styrs av Chemstation mjukvara eller med andra kommersiellt tillgängliga HPLC-system. Flödes scintillation av HPLC-eluenten kan göras med en β-RAM-flödes scintillator styrs av Laura programvara eller en annan kommersiellt tillgänglig flödes scintillator eller kompatibel mjukvara.
- Initiera den kvaternära pump vid en flödeshastighet av 1,0 ml / min med 100% buffert A.
- Sätt upp en jämvikts profil på HPLCatt styra gradienten av buffertar A och B (kallar detta "protokoll A jämvikts"): 1% buffert B under 5 minuter, 1-100% B under 5 min, 100% B under 5 min, 100-1% B under 5 min, 1% B under 20 minuter. Ställ in tryckgränsen vid 400 bar, 1,0 ml / min flödeshastighet, och 30 min körtid.
- Sätt upp en elueringsprofil (figur 2) på HPLC för att styra gradienten hos Buffertar A och B (kallar detta "protokoll A"): 1% B under 5 minuter, 1-20% B under 40 minuter, 20-100% B under 10 min, 100% B under 5 min, 100-1% B under 20 minuter, 1% B under 10 minuter. Ställ in tryckgränsen vid 400 bar, 1,0 ml / min flödeshastighet, och 90 min körtid.
- Inrätta en detekteringsprotokoll på flödet scintillator (kalla detta "protokoll A detection") för att köra i 60 minuter, med en scintillationsvätska flödeshastighet av 2,5 ml / min och en 8,57 sek uppehållstid.
- Programmera en automatisk injektionssekvensen på HPLC till att börja med vatten tomt på "protokoll A jämvikt", följt av each radioaktivt prov på "protokoll A". Initiera sekvensen när du är klar.
- Medan körningen är fortfarande på jämvikts protokollet, skapa ett parti på flödet scintillator för att mäta alla prover med "protokoll A upptäckt." Injektion av varje nytt prov kommer att initiera "protokoll A" på HPLC samtidigt utlösa flödet scintillator för att börja "Protokoll En upptäckt."
- Vid slutförandet av alla körningar, spola HPLC kolonnen och flödes scintillatorn med 100% buffert A under 30 min vid 1,0 ml / min flödeshastighet.
- Använd Laura programvara eller annan programvara som kan kvantifiera kromatografi spektra. De steg som beskrivs i det här avsnittet visas i Figur 3.
- Öppna filerna genom att klicka på "File", "Open", och välj rådatafilen för varje prov.
- Under fliken "kromatogrammen", zoOm i att sträcka varje mindre toppar (ca 1000 räknar [y-axeln]) med bibehållen tidsupplösningen. Zooma in varje enskild topp vid behov.
- Markera vart och ett av topparna för analys med hjälp av "Lägg till ROI" verktyg. Identifiera toppar från tiden för eluering: Föräldra Gro-Ins på 10 minuter, Gro-Ins3P vid 18 min, Gro-Ins4P vid 20 min, Gro-Ins (3,5) P2 vid 29 min och Gro-Ins (4,5 ) P 2 vid 32 min.
- Under fliken "regioner tabeller", spela in "området (räknas)" för varje topp. Notera "start (mm: ss)" tid och "slutet (mm: ss)" tid för varje topp.
- För bakgrundssubtraktion markerar ett område intill toppen omspänner samma mängd tid. Subtrahera antalet räkningar från motsvarande topp.
- Normalisera området för varje topp mot föräldra Gro-Ins (uttryckt som "% av totala Ptdlns"). Sedan, normalisera var och en av topparna i varje experimentell betingelse mot kontrolltillstånd (uttryckt som "nfaldig ökning jämfört med kontroll ").
OBS: Normalisering av varje topp kan också göras mot totala pulser men eftersom den paren Gro-Ins är mycket mer rikligt förekommande än varje annan PtdInsPs resultaten tenderar att vara liknande. - Exportera data för kromatografer genom att trycka på "File", "Spara som ..." och välj "CSV (kommaseparerad)" filformat. Rita data på ett kalkylblad och presentera vid behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denna metod, har jäst PtdInsPs metaboliskt märkt med 3 H- myo-inositol. Efter märkning, har fosfolipiderna utfälldes med perklorsyra, följt av fosfolipid deacylering och extraktion av den vattenlösliga Gro-InsPs (Figur 1). I detta skede är det viktigt att kvantifiera det totala radioaktiva signalen associerad med den extraherade Gro-InsPs genom vätskescintillation för att säkerställa tillräcklig signal-brusförhållande för de låg-abundans PtdInsPs såsom Ptdlns (3,5) P2; sammanlagt 5-10 miljoner CPM ska injiceras. Eftersom jästceller uppvisar endast fyra PtdInsPs, kan upplösning åstadkommas med en 1 tim elueringsmetod som beskrivits (Figur 2).
Här, vildtyp, atg18 A och vac14 A jästmutanter märktes och behandlas för att analysera förändringar i Ptdlns (3,5) P2, the minst rikligt av PtdInsPs i jäst 16,19,27. Som observerats i figur 4A-C, elueringsprofilen för alla tre stammar producerade 3 H-associerade signaltoppar. Föräldra Gro-Ins topp eluerar först (8-9 min; visad i figur 3, men inte i fig 4 sedan Gro-Ins överskuggar signalen av de fosforylerade species), följt av Gro-Ins3P (~ 18 min), väx- Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P2 (~ 29 min) och Gro-Ins (4,5) P2 (~ 32: 00 min), vilka respektive motsvarar de acylerade fosfolipider Ptdlns, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P2 och Ptdlns (4,5) P2. Det finns ett par ytterligare mindre toppar vid 4 minuter och en som tenderar att omedelbart följa föräldern Gro-Ins (10 min); dessa utgör sannolikt inositol och en icke-glycerolsubstituerad inositide fosfater (Figur 3). Elueringsmönstret är konsekvent och egenskap, även om den exakta tiden kan variera vid användning av en diffehyra HPLC-system och / eller en ny kolumn.
Toppen associerad med Ptdlns (3,5) P2 (fig 4, röd pil) undergår de mest dramatiska förändringen mellan vildtyp, atg18 Δ och vac14 A jäststammar. I förhållande till celler av vildtyp (A), finns det en mycket stor Gro-Ins (3,5) P 2 -associated signal i atg18 A-celler och en mindre topp i vac14 ö jästceller. För att kvantifiera det totala radioaktiva signalen associerad med varje topp var räkningarna integrerats under det område av toppen (fig 3). Eftersom absoluta radioaktiva signalen varierar mellan prover var föräldra Gro-Ins arter som används som en intern kontroll genom att normalisera mot det (man kan också välja att normalisera mot totala räkningar). Genom att göra detta, de data tyder på att Ptdlns (3,5) P2 utgör endast 0,07% av Ptdlns i vildtyp jästceller, medan PtdIns (3,5) P 2 motsvarar 1,2% av de paren Ptdlns i atg18 ö-celler, eller en dramatisk 17-faldig ökning av Ptdlns (3,5) P2 relativt vildtypsceller (Figur 4A, B och D). I jämförelse, PtdIns (3,5) P 2 våningar var bara 0,01% av Ptdlns signalen i VAC14 -deleted jästceller, en förlust 85% i PtdIns (3,5) P2 (figur 4C och D). Sammantaget dessa mätningar är i överensstämmelse med publicerade resultat visar att Ptdlns (3,5) P2 är ca 0,1% av Ptdlns i vildtypceller, 90% lägre i vac14 D, och 10 till 20 gånger högre i atg18 D-celler i förhållande till vildtypsceller 27,29.
Figur 1. Deacylering och utvinning av 3 H-Gro-insp. Radiomärkt Lipid fällningen i perklorsyra tvättas med vattenlösning av EDTA. Detta är sedan aspireras och deacylering reagens tillsattes och inkuberades vid 53 ° C. Deacyleringen Reaktionsblandningen vakuumtorkades sedan och tvättades med vatten två gånger, följt av tillsats av extraktion reagens. Detta är sedan virvlades, centrifugerades och vattenfasen uppsamlas. Extraktionssteget upprepas tre gånger totalt för att avlägsna organiska och olösliga föroreningar. Den vattenlösliga fraktionen (blå), vilket inkluderar tre H-Gro-INSP, därefter vakuumtorkas och rehydratiseras med 60 pl vatten. Mängden radioaktivitet bestäms genom vätskescintillation (CPM) och lika räknas över prover laddas i HPLC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
<Br /> Figur 2. gradient av ammonium-fosfatbuffert för eluering av 3 H-Gro-insp. Resolution av Gro-INSP av stark anjonbytarkromatografi beror på tillämpningen av ammoniumfosfat dibasisk, pH 3,8 (buffert B). Valet av gradienten beror på blandningen av Gro-insp arter som separation. Är protokoll A används för jästprover, som besitter bara fyra PtdInsPs. Resolution av vart och ett av de fyra topparna räcker det med en snabb ökning av (NH 4) 2 HPO 4 koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Guidad instruktion för dataanalys av PtdInsP överflöd. Datafiler lastas på Laura software och utvärderades visuellt med hjälp av kromatograf (öppen som standard). Använda "zooma in" verktyg (a), förstora topparna (b). Välj distinkta toppar på kromatografen med "lägg till ROI" verktyg (c). I "områdestabell" -fliken (d) skall hela resulterande information från de markerade områden av intresse visas som en enda tabell (e). Exportera rå räknar av varje topp (f) och normalisera varje PtdInsP art mot föräldra fosfatidylinositol (g) eller mot totalräkningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ptdlns (3,5) P 2 nivåer i vildtypen och mutant jästceller. Representativa kromatografer visas för flödet scintillation av extrakteted 3 H-Gro-InsPs från vild-typ (A), atg18 Δ (B), och vac14Δ (C) jäststammar med hjälp av protokoll A. Rå räknas från regionerna av intresse motsvarande GRO-Ins (3,5) P 2 (pil) extraheras från kromatografen och bakgrunden subtraheras. De resulterande värdena jämförs med vildtypen och uttryckas som utfällbara förändring av Gro-Ins (3,5) P 2 våningar (D). Nivåerna och förändringar i Gro-Ins (3,5) P2 tolkas att visa nivåer och förändringar i den ursprungliga PtdIns (3,5) P 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Inositol fritt medium (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% Glukos |
| 0,01 mM KH2PO4 |
| 1X Aminosyror |
| 1X LPSM |
| 1X Spårelement |
| 5X Vitaminer |
| 10X Låga fosfat och sulfat media (LPSM) |
| 9 mM CaCl2 |
| 17 mM NaCl |
| 67 mM KCl |
| 1,000X Spårelement |
| 8 mM Borsyra |
| 250 | iM CUSO4 |
| 602 pM Kl |
| 1,23 mM FeCl3 |
| 2,65 mM MnSO4 |
| 971 pM Na-molybdat |
| 2,48 mM ZnSO4 |
| 500X Vitaminer |
| 4 ^ M biotin |
| 2,27 pM Folsyra |
| 1,62 mM Niacin |
| 729 | iM p-aminobensoesyra |
| 973 pM Pryidoxine-HCI |
| 266 pM Riboflavin |
| 593 pM Tiamin-HCl |
Tabell 1. Sammansättning av jäst inositol fria medier. Jästceller radioaktivt med IFM som basmedium kompletteras med 3 H- myo-inositol. Bered en 100 ml lösning av IFM med användning av de lösningar som anges, Filter sterilisera genom att använda en flaska topp 0,22 um vakuumfilter och förvara vid rumstemperatur. För att framställa låg fosfat och sulfat medier (LPSM), generera en 100 ml lösning med användning av de angivna salterna, filtersterilisera genom att använda en flasktopp 0,22 fim vakuumfilter och förvara vid RT. Lös de angivna salterna för att framställa en 1 L 1,000x lösning av spårelement. Blanda noggrant före användning och / eller lagra alikvoter vid -20 ° C. Lös de angivna vitaminer för att förbereda en 1 L 500x vitaminlösning. Blanda noga innan användning och förvara alikvoter vid -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln detaljer experimentprotokollet som krävs för att kvantifiera cellulära nivåer av PtdnsPs med HPLC kopplade flödes scintillation från jäst. Metodiken möjliggör den metaboliska märkningen av PtdInsPs med 3 H- myo-inositol, följt av lipid bearbetning och utvinning av vattenlösligt 3 H-Gro-InsPs, HPLC-fraktionering och analys. Med denna metod, kan de relativa nivåerna av PtdInsPs i celler under olika betingelser kvantifieras, som visas för PtdIns (3,5) P 2 i vild-typ, vac14 D och atg18 D jästceller (Figur 4).
Det finns ett antal kritiska steg och modifieringar som kan göras för att optimera resultat och / eller felsöka. En av de viktigaste parametrarna för att uppnå tillförlitlig kvantifiering av PtdInsPs är den totala radioaktiva signalnivån. Typiskt injicera 3-5 miljoner beräkningar i HPLC är ofta tillräckligt för att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera förändringar i hiGher överflöd PtdInsP arter såsom Ptdlns (4,5) P2. Emellertid kan injicering av upp till 10 miljoner beräkningar vara nödvändiga för kvantifiering av lägre förekomst arter såsom Ptdlns (3,5) P2. Det finns olika parametrar som kan påverka nivån på radioaktiva signalen uppnås bland annat det totala antalet celler som används för framställning av provet, tidsmärkning och temperatur, koncentrationen av 3 H- myo-inositol, omsättningshastigheten av PtdInsPs och den endogena syntesen inositol, som kommer att konkurrera med den radiomärkta inositol. Till exempel, radiomärkning jästceller för åtminstone en fördubbling tid medger metabolisk inkorporering av 3 H- myo- inositol i PtdInsPs, men förlängning av tiden för märkning av jästmutanter som växer långsammare eller har lägre metabolisk aktivitet kan bli nödvändiga. Dessutom det protokoll som beskrivs här använder en diauxic förskjutning av jästkultur, där celler odlades till mitten av log-fasen koncentreras sedan for märkning över en dubbleringstid. Däremot kan man minska diauxic skiftet genom märkning av celler under början och mitten av log-fasen och för längre tidsperioder som tidigare gjort 32. Genom att göra detta, dessa författare observerade högre nivåer av Ptdlns (3) P, Ptdlns (4) P och Ptdlns (4,5) P2 än celler som genomgår diauxic skift 32.
På samma sätt kan den period av däggdjursceller märkning kräver optimering eftersom vissa däggdjursceller som RAW 264.7 makrofager linje fördubblas varje 12 timmar, medan andra kan dela mycket långsammare, eller som i fallet av nervceller, inte alls 20,35,39. Dessutom kan en ökning av koncentrationen av 3 H-myo-inositol för att uppnå en idealisk radioaktiv signalnivå. Observera dock att vissa 3 H- myo-inositol är förpackad i 90% etanol, lägga alltför 3 H- myo-inositol kommer att öka etanolhalten i media och kan ha en oavsiktlig effect på cellerna. Slutligen kan långvarig radiomärkning också svälta cellerna i inositol. Detta är särskilt tydligt i däggdjurscellkultur där fullständig DMEM innehåller 40 iM myo-inositol, jämfört med 0,5 iM 3 H- myo-inositol när märkt med 10 Ci / ml. Således, om nödvändigt, att helt enkelt öka antalet däggdjursceller under etiketter rekommenderas.
De cellulära lys och lipid behandlingsstegen är också kritisk för att erhålla en optimalt utbyte, såväl som att bevara hälsan hos HPLC-kolonnen. Lys med perklorsyra möjliggör utfällning av lipider och andra makromolekyler, en metod som först användes för vävnadsodling och användes senare för jäst 28,33. Jämfört med utvinning av totala lipider med hjälp av traditionella metanol / HCl / kloroform-metoden, användning av perklorsyra förbättrar utvinningen av PtdInsPs, inklusive Ptdlns (3,5) P2, med mindre variation mellan experimenten 28. SubSequent tillämpning av metylamin bryter esterbindningar mellan glycerolhuvudkedjan och de två hydrofoba acylkedjor, lämnar den vattenlösliga Gro-INSP vara fasseparerad från fria fettsyror och intakta lipider 28,34. Särskild försiktighet måste vidtas för att undvika att bära fram oönskade organiska lösningsmedel och olösliga material under extraktionssteget. Detta kan täppa till systemet, orsaka tryckstötar och / eller kemiskt skada kolonnen. Dessutom måste kolonnen konditioneras vid början av varje dag genom att exponera kolonnen till en hög koncentration av ammoniumfosfat (buffert B) före användning; sålunda är en kort "jämvikts" protokoll som används innan du kör experimentella prover. Underlåtenhet att göra detta konditione steg resulterar i en fördröjd elueringsprofil av Gro-InsPs toppar i första experimentella provet som körs.
Det finns flera viktiga punkter i samband med analys och kvantifiering att överväga också. Först, quantification sig bör vara en integrering av signal och området för varje topp, inte bara topphöjden. Dessutom är vanligen nödvändigt en intern kontroll eftersom absolut signal integration för varje topp kan variera kraftigt mellan prover och experiment utan att reflektera en ändring i PtdInsP överflöd i en cell. Föräldra Gro-Ins topp typiskt används som intern kontroll genom att normalisera varje Gro-insp topp mot den. Den Gro-Ins topp håller vanligtvis nästan 90% av den radioaktiva signalen och inte tenderar att förändras mellan villkor. Alternativt kan man välja att normalisera mot totala räkningar, särskilt om man misstänker att föräldra Ptdlns lider en betydande förändring i de experimentella förhållanden. Slutligen, för låga förekomst PtdInsPs är bakgrundssubtraktion rekommenderas genom att definiera en närliggande icke-topp område med samma "tidsskala" som toppen av intresse (fig 3D).
En sista fråga avseranalys av däggdjursprover, som besitter sju PtdInsP arter, däribland tre mono-fosforylerade och tre bis-fosforylerade arter. Tyvärr är det svårt att helt lösa PtdIns4P från PtdIns5P och Ptdlns (3,5) P2 från Ptdlns (3,4) P2 i prover från däggdjur, vilket resulterar i conjoined dubbla toppar. Det finns flera metoder som tidigare publicerats som ökar upplösningen av dessa toppar. Typiskt involverar detta att modifiera längden av elueringen, utgångskoncentration av ammoniumfosfatbuffert, hastigheten och steg genom vilka förändringar under elueringsprofilen ammonium- fosfatbuffertkoncentration och pH-värdet för ammoniumfosfatbuffert 33,35-38. Kanske den mest framgångsrika metoden som utvecklats för att separera Ptdlns (4) P och Ptdlns (5) P har nyligen beskrivits av Sarkes och Rameh 39, som använde två-tandem SAX kolumner och ett ammoniumsalt fosfatbuffert vid pH 6,0.
Som med de flesta metoder, användning av HPLC-coupled flödes scintillation att kvantifiera PtdInsPs i celler har fördelar och nackdelar jämfört med andra tillgängliga metoder. Till exempel, online-flöde scintillation kopplad till HPLC erbjuder levande detektering av Gro-InsPs men begränsar scintillationsräkning tiden, vilket minskar känsligheten för denna metod. Alternativt kan HPLC-eluenten vara fraktion samlas in med en automatisk provtagare i stället för att mata in ett flöde scintillator. De manuella fraktionerna kan sedan läsas av en off-line-vätskescintillationsräknare under längre tidsperioder, vilket ger högre känslighet - icke desto mindre är denna metod mer tidskrävande och arbetsintensiv och gör upplösningen beroende på antalet fraktioner uppsamlades 38,40 . Dessutom, analys av hela celler mäter entydigt nivåerna av ett specifikt PtdInsP, men det kommer inte att informera om förändringar i subcellulära fördelningen av det PtdInsP, även om man kunde par flödes scintillation till sub-cellulära fraktioneringsmetoder som previously gjort 39. I jämförelse, FP-baserade PtdInsP-bindande domäner är användbara för att undersöka läget och dynamiken hos en PtdInsP art i en cell, men kan även binda till andra än målet PtdInsP faktorer. Även den här beskrivna metoden förenklar analysen av PtdInsP nivåer genom att eliminera acylkedjorna, vilket kraftigt ökar den molekylära mångfald PtdInsPs. Men på samma sätt är det också en viktig nackdel, eftersom deacylering av lipider leder till en förlust av strukturell information om acylkedjan, en underskattad aspekt av PtdInsP signalering 41,42. Om detta är ett stort bekymmer, sedan vätskekromatografi kopplat till masspektrometri (LC-MS) bör användas 14,17. Emellertid är det för närvarande svårt att samtidigt analysera alla PtdInsPs arter genom LC-MS 43. Således är en kombination av metoder det bästa sättet för att undersöka platsen, dynamik, molekylär mångfald och nivåer av alla sju PtdInsPs arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
