Summary
Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.
Protocol
Nota: El texto a continuación describe en detalle un método para medir PtdInsPs en la levadura. Proporciona los datos experimentales para las células de etiquetado de levadura con 3 H- myo -inositol, extrayendo y desacilante lípidos y un protocolo de HPLC-elución para fraccionar y cuantificar PtdInsPs desacilados. Tenga en cuenta que el etiquetado, desacilación, resolución y cuantificación de PtdInsPs en células de mamíferos requieren optimización y perfiles HPLC-elución más largos. Estos detalles se pueden encontrar en otros lugares, aunque se discuten algunos de los aspectos de la discusión. En general, la metodología para extraer los lípidos, desacilar y extraer el Gro-InsPs soluble en agua se da a partir de la levadura y se ilustra en la Figura 1.
1. Protocolo para el etiquetado y Análisis de PtdInsPs en levadura
- Cultivo de células y radiomarcaje
- Crecer un cultivo líquido de 20 ml de la SEY6210 cepa de levadura a 30 ° C con agitación constante en completa sintéticamedios de comunicación para la fase semilogarítmica o una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de aproximadamente 0,6-0,7.
Nota: No utilice medios YPD ya que esto puede afectar a 3 H- myo -inositol incorporación. Este tamaño de la cultura debe proporcionar material suficiente para 2-3 series de HPLC. - Sedimenten un total de 10-14 OD de las células de levadura (tenga en cuenta que 1 ml de cultivo con una DO 600 = 1 contiene ~ 1x10 7 células) mediante centrifugación a 800 xg durante 5 min en un tubo de 12 ml de fondo redondo. Resuspender con 2 ml de-inositol libre de los medios de comunicación (IFM) (véase la Tabla 1 para la composición IFM).
- Repetir la centrifugación y aspirar los medios de comunicación. Resuspender el precipitado con 440 l de IFM y se incuba a TA durante 15 min.
- Añadir 60 l de 3 H- myo -inositol (1 l = 1 Ci) a cada muestra y se incuba a la creciente temperatura de 30 ° C durante 1 a 3 horas con agitación constante.
Precaución: 3 myo H- -inositol es un compañero radiactivorial que debe ser manejado después de una formación adecuada. Además, todos los consumibles que hacen contacto con el material que contiene 3-H deben desecharse de manera adecuada y designados como residuos radiactivos.
Nota: La temperatura de crecimiento se puede cambiar según sea necesario, siempre y cuando todas las cepas que deben compararse se cultivan a la misma temperatura. - Transferir la suspensión celular (500 l) a un tubo de microcentrífuga que contiene 500 l de ácido perclórico 9% y 200 l de ácido lavó perlas de vidrio. Mezclar por inversión y se incuba en hielo durante 5 min.
- Vortex la muestra a la velocidad máxima durante 10 min y transferir los lisados a un nuevo tubo de microcentrífuga usando una punta de carga de gel para evitar las perlas de vidrio.
- Se precipitan la muestra a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado por sonicación baño en 1 ml de EDTA mM enfriado con hielo 100. Pellet de nuevo como antes.
- Crecer un cultivo líquido de 20 ml de la SEY6210 cepa de levadura a 30 ° C con agitación constante en completa sintéticamedios de comunicación para la fase semilogarítmica o una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de aproximadamente 0,6-0,7.
- La desacilación y la extracción
- Aspirar el EDTA y sonicar el precipitado en 50 l de agua.
- Añadir 500 l de reactivo de desacilación y sonicar para mezclar. Incubar a TA durante 20 min.
- Lípidos de calor durante 50 minutos a 53 ° C en un bloque de calor. Secar las muestras completamente por centrifugación al vacío durante 3 horas o O / N.
- Asegúrese de que una trampa química se instala entre el vacío de centrífuga y la bomba de vacío para evitar que los vapores entren en el aire.
- Resuspender el precipitado con 300 l de agua por sonicación baño y se incuba a TA durante 20 min. Secar las muestras mediante centrifugación al vacío durante 3 horas o O / N. Repita este paso una vez más.
- Sonicar el sedimento con 450 l de agua. Esta es la fase acuosa durante la extracción.
- Recién preparar 10 ml de la extraction reactivo mediante la adición de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml de éter etílico y 0,40 ml de formiato de etilo. Invertir para mezclar.
- Añadir 300 l de reactivo de extracción de la de la fase acuosa. Vortex la mezcla a velocidad máxima durante 5 min y se separan las capas mediante centrifugación a velocidad máxima (18.000 xg) durante 2 min.
- Recoger la capa acuosa inferior en un nuevo tubo de microcentrífuga evitando al mismo tiempo la capa superior orgánica, la interfaz, y el sedimento. Repetir la extracción de la fase acuosa dos veces más con reactivo de extracción fresco.
- Completamente seca la capa acuosa se recogió por centrifugación al vacío. Dispersar el precipitado en 50 l de agua por sonicación baño.
- Añadir 2 l de cada muestra a 4 ml de fluido de centelleo en un vial de centelleo de 6 ml de polietileno. Determinar el número de cuentas (en CPM) en cada muestra mediante centelleo líquido usando una ventana abierta.
- Almacenar las muestras a -20 ° C hasta el momento de HPLC.
- Preparar el tampón A mediante el filtrado de 1 L de agua ultrapura con una botella 0,22 micras parte superior del filtro de vacío, seguido por desgasificación.
- Preparar el tampón B al hacer una solución 1 L de 1 M de fosfato dibásico de amonio (APS, MW 132,06) en agua y ajustar el pH a 3,8 con ácido fosfórico. Filtrar el fosfato de amonio con una botella superior filtro de 0,22 micras de vacío, seguido de desgasificación.
- Montar el vial para inyección mediante el equipamiento de un vial de 2 ml con un pequeño volumen 250 l inserto de resorte. Carga de 10 millones de CPM y añadir agua para un volumen total de 55 l. Prepare un frasco blanco con 55 l de agua.
- Tapar los viales con tapones de rosca equipados con una septa de PTFE / silicona (lado rojo hacia el interior del vial). Coloque cada vial en la bandeja de auto-muestreo de la HPLC, comenzando con el vial de blanco.
- Utilice un HPLC y el software asociado que controla el flujo de amortiguamiento, desgasifica tampones y los controles de la muestra injectien. Utilice un centelleador de flujo en línea y su software asociado para regular el caudal de líquido de centelleo y para monitorizar la señal H-3 decadencia.
- Utilice una columna de cromatografía líquida SAX con unas dimensiones de 250 mm x 4,6 mm y que contiene 5 micras de resina de sílice en el HPLC. Equipar la columna con un guardia de la columna para evitar la inyección de contaminantes.
- Instalar una celda de flujo de 500 l compatible con H 3 en el centelleo de flujo.
NOTA: El fraccionamiento se puede hacer con un sistema de HPLC Agilent 1200 series infinito controlado por software Chemstation o con otros sistemas de HPLC disponibles comercialmente. De centelleo de flujo del eluyente de HPLC se puede hacer con un centelleador flujo β-RAM controlado por el software Laura u otro centelleador de flujo disponible comercialmente o software compatible.
- Inicialice la bomba cuaternaria con un caudal de 1,0 ml / min con tampón A. 100%
- Configurar un perfil de equilibrio en la HPLCpara controlar el gradiente de tampones A y B (llamar a este "Protocolo A equilibración"): 1% de tampón B durante 5 min, 1-100% de B durante 5 min, 100% de B durante 5 min, 100 a 1% de B durante 5 min, 1% de B durante 20 min. Establecer el límite de presión de 400 bar, 1,0 ml / min de caudal y 30 minutos el tiempo de ejecución.
- Configurar un perfil de elución (Figura 2) en el HPLC para controlar el gradiente de tampones A y B (llamar a este "Protocolo A"): 1% de B durante 5 min, 1.20% de B durante 40 min, 20 a 100% B durante 10 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 20 min, 1% de B durante 10 min. Establecer el límite de presión de 400 bar, 1,0 ml / min de caudal y 90 minutos el tiempo de ejecución.
- Establecer un protocolo de detección en el centelleo de flujo (llamar a este "Protocolo A de detección") para una duración de 60 minutos, con un caudal de fluido de centelleo de 2,5 ml / min y un tiempo de permanencia 8,57 seg.
- Programar una secuencia de inyección automatizada en el HPLC para comenzar con el blanco de agua en "Protocolo A equilibrado", seguido de correoada radiactivamente muestra sobre "Protocolo A". Inicialice la secuencia cuando esté listo.
- Mientras que la marcha todavía está en el protocolo de equilibrado, crear un proceso por lotes en el centelleador flujo para medir todas las muestras con "Protocolo de una detección." La inyección de cada nueva muestra inicializará "Protocolo A" en el HPLC, mientras que la activación de la centelleador flujo para comenzar "Protocolo A detección."
- A la finalización de todas las carreras, lave la HPLC, la columna y centelleador fluir con 100% de tampón A durante 30 min a 1,0 ml / min de caudal.
- Utilice software de Laura o cualquier otro software que pueda cuantificar los espectros de cromatografía. Los pasos descritos en esta sección se muestran en la Figura 3.
- Abrir los archivos haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y seleccione el archivo de datos brutos para cada muestra.
- En la pestaña "cromatogramas", una zoom en estirar cada uno de los picos menores (unos 1.000 recuentos [eje y]) mientras que conserva la resolución de tiempo. Zoom en cada pico individual si es necesario.
- Resalte cada uno de los picos para el análisis con la función "Añadir ROI". Identificar picos por el tiempo de elución: Parental Gro-ins a los 10 minutos, Gro-Ins3P a los 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 en 29 min y Gro-Ins (4,5 ) P 2 a los 32 min.
- En la pestaña de "mesas de las regiones", grabar el "área (cuenta)" de cada pico. Tenga en cuenta el "start (mm: ss)" el tiempo y "fin (mm: ss)" tiempo de cada pico.
- Para la sustracción del fondo, resalte una región adyacente al pico que abarca la misma cantidad de tiempo. Restar el número de cuentas desde el pico correspondiente.
- Normalizar el área de cada pico contra parental Gro-Ins (expresado como "% de PtdIns totales"). Entonces, normalizar cada uno de los picos en cada condición experimental contra la condición de control (expresado como "naumento -fold comparación con el control ").
NOTA: La normalización de cada pico también se puede hacer contra los recuentos totales pero ya que el parental Gro-Ins es mucho más abundante que todos los demás PtdInsPs los resultados tienden a ser similares. - Exportar los datos de los cromatógrafos pulsando en "Archivo", "Guardar como ..." y elija el "CSV (separados por comas)" formato de archivo. Trazar los datos en una hoja de cálculo y presentar, según sea necesario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando este método, PtdInsPs de levadura se marcaron metabólicamente con 3 H- myo -inositol. Después del marcaje, los fosfolípidos se precipitaron con ácido perclórico, seguido por desacilación fosfolípido y extracción de la Gro-InsPs soluble en agua (Figura 1). En esta etapa, es importante para cuantificar la señal radiactiva total asociado con el extraída Gro-InsPs por centelleo líquido para asegurar suficiente relación señal-ruido para los PtdInsPs muy baja abundancia como PtdIns (3,5) P 2; se debe inyectar un total de 5-10 millones de CPM. Dado que las células de levadura exhiben sólo cuatro PtdInsPs, la resolución se puede lograr con un método de elución 1 hr como se ha descrito (Figura 2).
Aquí, de tipo salvaje, atg18 delta y delta vac14 mutantes de levadura se marcaron y se procesaron para analizar los cambios en PtdIns (3,5) P 2, THe menos abundante de los PtdInsPs en 16,19,27 levadura. Como se observa en la Figura 4A-C, el perfil de elución para las tres cepas producidas 3 picos de señal H-asociado. El pico Gro-Ins parental eluye primero (8-9 min; muestra en la Figura 3, pero no en la Figura 4 desde Gro-Ins eclipsa la señal de las especies fosforiladas), seguido por Gro-Ins3P (~ 18 min), Gro Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P 2 (~ 29 min) y Gro-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 min), lo que corresponde respectivamente a los fosfolípidos acilados PtdIns, PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P2 y PtdIns (4,5) P2. Hay un par de picos menores adicionales en 4 min y una que tiende a seguir de inmediato el padre Gro-Ins (10 min); éstos probablemente representan inositol y un no glicerada inositide fosfatos (Figura 3). El patrón de elución es consistente y característico, aunque el tiempo exacto puede variar cuando se emplea un difealquilar sistema de HPLC y / o una nueva columna.
El pico asociado a PtdIns (3,5) P 2 (Figura 4, flecha roja) sufre el cambio más dramático entre los de tipo salvaje, atg18 Δ y cepas de levadura delta vac14. En relación con las células de tipo salvaje (A), hay una muy grande Gro-Ins (3,5) P2 señal -asociado en las células delta atg18 y un pico más pequeño en células de levadura delta vac14. Con el fin de cuantificar la señal radiactiva total asociado a cada pico, los conteos se integraron bajo el área del pico (Figura 3). Además, puesto que la señal radiactiva absoluta varía entre las muestras, los padres especies Gro-Ins se utilizó como control interno mediante la normalización en contra de ella (también se puede optar por normalizar contra cuentas totales). Al hacer esto, los datos sugieren que PtdIns (3,5) P 2 constituye sólo 0,07% de PtdIns en células de levadura de tipo salvaje, mientras que PtdIns (3,5) P 2 corresponde al 1,2% de los PtdIns parentales en las células delta atg18, o un incremento de 17 veces dramático en PtdIns (3,5) P 2 en relación con las células de tipo salvaje (Figura 4A, B y D). En comparación, PtdIns (3,5) P 2 niveles fue sólo 0,01% de la señal PtdIns en VAC14 -deleted células de levadura, una pérdida del 85% en PtdIns (3,5) P 2 (Figura 4C y D). En general, estas mediciones están de acuerdo con los resultados publicados que muestran que PtdIns (3,5) P 2 es de aproximadamente 0,1% de PtdIns en las células de tipo salvaje, 90% reduce en vac14 D, y de 10 a 20 veces mayor en las células atg18 D relación con las células de tipo salvaje 27,29.
Figura 1. La desacilación y la extracción de 3 H-Gro-InsP. Radiomarcado lipid precipitado en ácido perclórico se lava con solución acuosa de EDTA. Esto entonces se aspiró y se añadió reactivo de desacilación y se incubó a 53 ° C. La mezcla de reacción de desacilación a continuación se seca al vacío y se lavó con agua dos veces, seguido por la adición de reactivo de extracción. Esto entonces se agitó con vórtex, se centrifugó y se recogió la fase acuosa. La etapa de extracción se repite tres veces en total para eliminar los contaminantes orgánicos e insolubles. La fracción soluble en agua (azul), que incluye 3 H-Gro-InsP, a continuación, se seca al vacío y rehidrata con 60 l de agua. La cantidad de radiactividad se determina por centelleo líquido (CPM) y el recuento de la igualdad a través de las muestras se cargan en el HPLC. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<br /> Figura 2. Gradiente de tampón de fosfato de amonio para la elución de 3 H-Gro-InsP. Resolución de Gro-InsP por cromatografía de intercambio de aniones fuertes depende de la aplicación de fosfato dibásico de amonio, pH 3,8 (Tampón B). La elección de gradiente depende de la mezcla de especies Gro-INSP disponibles para la separación. Protocolo A se usa para las muestras de levadura, que poseen sólo cuatro PtdInsPs. La resolución de cada uno de los cuatro picos es suficiente con un rápido aumento de (NH 4) 2 HPO 4 concentración. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Guiados de instrucciones para el análisis de datos de PtdInsP abundancia. Los archivos de datos se cargan en la Laura software y evaluados visualmente utilizando el cromatógrafo (abierta por defecto). Utilizando el "zoom in" de la herramienta (a), ampliar los picos (b). Seleccione picos distintos en el cromatógrafo con la función "añadir ROI" (c). En la pestaña de "región de mesa" (d), toda la información resultante de las regiones resaltadas de interés se muestra como una sola tabla (e). Exportar los recuentos de primas de cada pico (f) y normalizar cada especie PtdInsP contra el fosfatidilinositol parental (g) o en contra de los recuentos totales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. PtdIns (3,5) P 2 niveles de tipo salvaje y las células de levadura mutante. Cromatógrafos representativos se muestran para el centelleo de flujo del extractoed 3 H-Gro-InsPs de tipo salvaje (A), atg18 Δ (B) y (C) vac14Δ cepas de levadura utilizando Protocolo A. Los recuentos en bruto de las regiones de interés correspondientes a Gro-Ins (3,5) P 2 (flecha) se extraen del cromatógrafo y antecedentes resta. Los valores resultantes se comparan con los de tipo salvaje y expresan como factor de cambio en Gro-Ins (3,5) P 2 niveles (D). Los niveles y los cambios en Gro-Ins (3,5) P 2 son interpretados para mostrar los niveles y cambios en los originales PtdIns (3,5) P 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios-inositol libre (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% de glucosa |
| 0,01 mM KH2PO4 |
| Ácidos 1X aminoácidos |
| 1X LPSM |
| Los oligoelementos 1X |
| 5X Vitaminas |
| 10X medios de fosfato y sulfato Bajos (LPSM) |
| 9 mM CaCl2 |
| NaCl 17 mM |
| 67 mM KCl |
| Elementos traza 1.000X |
| Ácido bórico 8 mM |
| 250 M CuSO4 |
| 602 M KI |
| 1,23 mM FeCl3 |
| 2,65 mM MnSO4 |
| 971 mM Na-molibdato |
| 2,48 mM ZnSO4 |
| 500X Vitaminas |
| 4 M biotina |
| 2,27 M de ácido fólico |
| 1,62 mM Niacina |
| Ácido 729 mM p-aminobenzoico |
| 973 M-HCl Pryidoxine |
| 266 M Riboflavina |
| 593 M Tiamina-HCl |
Tabla 1. Composición de la levadura-inositol libre de los medios de comunicación. Las células de levadura se radiomarcado con MFI como los medios de comunicación de base que se complementan con 3 H- myo -inositol. Preparar una solución de IFM utilizando las soluciones de 100 ml indicada, Filtro de esterilizar utilizando una botella superior del filtro de vacío de 0,22 micras y se almacena a temperatura ambiente. Para preparar baja fosfato y sulfato de medios (LPSM), generar una solución de 100 ml usando las sales indicadas, filtro de esterilizar utilizando una botella superior del filtro de vacío de 0,22 micras y se almacena a temperatura ambiente. Disolver las sales indicadas para preparar una solución 1 L 1,000x de oligoelementos. Mezclar bien antes de su uso y / o almacenar alícuotas a -20 ° C. Disolver las vitaminas indicadas para preparar una solución de vitamina 500x 1 L. Mezclar bien antes de usar y almacenar alícuotas a -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este artículo se detalla el protocolo experimental necesaria para cuantificar los niveles celulares de PtdnsPs por HPLC acoplado centelleo de flujo de la levadura. La metodología permite el etiquetado metabólico de PtdInsPs con 3 H- myo -inositol, seguido por el procesamiento de lípidos y la extracción de 3 H-Gro-InsPs, fraccionamiento HPLC soluble en agua y análisis. Usando este método, los niveles relativos de PtdInsPs en las células en diversas condiciones pueden ser cuantificados, tal como se muestra para PtdIns (3,5) P 2 de tipo salvaje, vac14 D y células de levadura atg18 D (Figura 4).
Hay una serie de pasos críticos y modificaciones que se pueden hacer para optimizar los resultados y / o solucionar problemas. Uno de los parámetros más importantes para lograr la cuantificación fiable de PtdInsPs es el nivel total de la señal radiactiva. Típicamente, la inyección de 3-5 millones de conteos en el HPLC es a menudo suficiente para cuantificar de forma fiable los cambios en la hiespecies Gher PtdInsP abundancia como PtdIns (4,5) P2. Sin embargo, la inyección de hasta 10 millones de recuento puede ser necesario para la cuantificación de especies de abundancia inferiores tales como PtdIns (3,5) P 2. Hay diversos parámetros que pueden afectar el nivel de señal radiactiva logra incluyendo el número total de células utilizadas para preparar la muestra, el tiempo de etiquetado y la temperatura, la concentración de 3 H- myo -inositol, la tasa de rotación de PtdInsPs y la síntesis endógena de inositol, que competirán con el inositol radiomarcado. Por ejemplo, células de levadura radiomarcaje para al menos un tiempo de duplicación permite la incorporación metabólica de 3 H- mio- inositol en PtdInsPs, pero extensión del tiempo de etiquetado para los mutantes de levadura que crecen más lentamente o que tienen actividad metabólica más lenta puede ser necesario. Además, el protocolo descrito aquí utiliza un diauxic cambio del cultivo de levadura, donde las células cultivadas hasta la fase semilogarítmica a continuación, se concentran for etiquetado más de un tiempo de duplicación. Sin embargo, se puede reducir el diauxic cambio por las células de etiquetado durante principios y mediados de la fase de registro y por largos períodos de tiempo que previamente hecho 32. Al hacer esto, estos autores observaron niveles más altos de PtdIns (3) P, PtdIns (4) P y PtdIns (4,5) P 2 que las células se someten a diauxic cambio 32.
Del mismo modo, el período de etiquetado de células de mamífero puede requerir la optimización, ya que algunas células de mamíferos como la línea de macrófagos RAW 264.7 se duplica cada 12 horas, mientras que otros pueden dividir mucho más lento, o como en el caso de las neuronas, en absoluto 20,35,39. Además, se puede aumentar la concentración de 3 H- myo -inositol para lograr un nivel ideal señal radiactiva. Sin embargo, tenga en cuenta que algunos 3 H- myo -inositol se envasa en 90% de etanol, añadiendo excesiva 3 H- myo -inositol aumentará el contenido de etanol en los medios de comunicación y puede tener un efe no deseadoct sobre las células. Por último, el radiomarcado prolongada también puede matar de hambre a las células de inositol. Esto es particularmente evidente en cultivos celulares de mamíferos donde DMEM completo contiene 40 mM de myo -inositol, en comparación con 0,5 mM 3 H- myo -inositol cuando se marcan con 10 Ci / ml. Por lo tanto, si es necesario, se recomienda simplemente aumentar el número de células de mamífero durante el etiquetado.
La lisis y procesamiento de lípidos pasos celulares también son críticos para la obtención de un rendimiento óptimo, así como el mantenimiento de la salud de la columna de HPLC. Lisis con ácido perclórico permite la precipitación de los lípidos y otras macromoléculas, un método primero empleado para el cultivo de tejidos y posteriormente utilizado para la levadura 28,33. En comparación con la extracción de lípidos totales utilizando el metanol tradicional / método / cloroformo HCl, el uso de ácido perclórico mejora la recuperación de PtdInsPs, incluyendo PtdIns (3,5) P 2, con menos variación entre los experimentos 28. Subsequent aplicación de metilamina rompe los enlaces éster entre el esqueleto de glicerol y las dos cadenas de acilo hidrófobas, dejando el agua soluble Gro-InsP ser a partir de ácidos grasos libres y lípidos intactos 28,34 fases separadas. Especial cuidado se debe tomar para evitar llevar disolventes orgánicos hacia adelante no deseados y material insoluble durante la etapa de extracción. Esto puede obstruir el sistema, provocar picos de presión y / o dañar químicamente la columna. Además, la columna debe estar condicionada al comienzo de cada día mediante la exposición de la columna a una alta concentración de fosfato de amonio (tampón B) antes de su uso; por lo tanto, un protocolo corto "equilibrado" se emplea antes de ejecutar muestras experimentales. El incumplimiento de esta etapa de acondicionamiento resultados en un perfil de elución tardía de los picos Gro-InsPs en la primera muestra experimental que se ejecutan.
Hay varios puntos clave relacionados con el análisis y cuantificación de considerar también. En primer lugar, la quantification sí debe haber una integración de la señal y el área de cada pico, no sólo la altura máxima. Por otra parte, un control interno suele ser necesario porque la integración de la señal absoluta para cada pico puede variar significativamente entre las muestras y experimentos sin reflejar un cambio en PtdInsP abundancia en una célula. El pico Gro-Ins padres se emplea típicamente como el control interno mediante la normalización de cada pico Gro-InsP contra. El pico Gro-Ins normalmente tiene casi el 90% de la señal radiactiva y no tiende a cambiar entre las condiciones. Alternativamente, uno puede elegir para normalizar contra los recuentos totales, especialmente si se sospecha que los PtdIns parentales sufre un cambio significativo en las condiciones experimentales. Por último, para PtdInsPs baja abundancia, sustracción de fondo es recomendado por la definición de una zona de no-pico cercano con el mismo "escala de tiempo", como el pico de interés (Figura 3D).
Una última consideración se refiere ael análisis de muestras de mamíferos, que poseen siete especies PtdInsP, incluyendo especies de tres mono-fosforilados y tres bis-fosforilados. Desafortunadamente, es difícil de resolver plenamente PtdIns4P de PtdIns5P y PtdIns (3,5) P 2 de PtdIns (3,4) P 2 en muestras de mamíferos, lo que resulta en dobles picos unidos. Hay varios métodos publicados anteriormente que incrementan la resolución de estos picos. Típicamente, esto implica la modificación de la longitud de la elución, la concentración de partida de tampón de fosfato de amonio, y la tasa de pasos por los que los cambios en la concentración de fosfato amónico tampón durante el perfil de elución y el pH de la solución tampón de fosfato de amonio 33,35-38. Quizá, el método más exitoso desarrollado para PtdIns separadas (4) P y PtdIns (5) P fue descrito recientemente por Sarkes y Rameh 39, que empleaba columnas SAX de dos tándem y un tampón de fosfato de amonio a pH 6,0.
Al igual que con la mayoría de los métodos, usando HPLC-coupled fluir de centelleo para cuantificar PtdInsPs en las células tiene ventajas y desventajas en comparación con otros métodos disponibles. Por ejemplo, el centelleo de flujo en línea acoplado a HPLC ofrece detección vivo de GRO-InsPs pero limita el tiempo de recuento de centelleo, la reducción de la sensibilidad de este método. Alternativamente, el eluyente HPLC puede ser fracción recogida con un auto-muestreador en lugar de alimentar en un centelleador de flujo. Las fracciones manuales pueden ser leídos por un contador de centelleo líquido fuera de línea por períodos más largos de tiempo, ofreciendo de este modo una mayor sensibilidad - sin embargo, este enfoque requiere mucho más tiempo y mucha mano de obra y reduce la resolución en función del número de fracciones recogidas 38,40 . Además, el análisis de células enteras mide de forma inequívoca los niveles de un PtdInsP específica, pero no va a informar sobre los cambios en la distribución subcelular de que PtdInsP, aunque uno podría centelleo de flujo de pareja a métodos de fraccionamiento subcelular como Previouastuta hecho 39. En comparación, FP-basan PtdInsP dominios de unión son útiles para investigar la ubicación y la dinámica de una especie PtdInsP en una célula, pero también puede unirse a otros factores distintos de la diana PtdInsP. Además, el método descrito aquí simplifica el análisis de los niveles PtdInsP mediante la eliminación de las cadenas de acilo, lo que aumenta en gran medida la diversidad molecular de PtdInsPs. Pero por la misma razón, esta es también una desventaja clave, ya que la desacilación de lípidos conduce a una pérdida de información estructural con respecto a la cadena de acilo, un aspecto underappreciated de PtdInsP señalización 41,42. Si esto es de gran preocupación, entonces cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) se debe emplear 14,17. Sin embargo, actualmente es difícil de analizar simultáneamente todas las especies PtdInsPs por LC-MS 43. Por lo tanto, una combinación de métodos es el mejor enfoque con el fin de investigar la ubicación, la dinámica, la diversidad molecular y los niveles de las siete especies PtdInsPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
