Summary
نحن تصف مجموعة من البروتوكولات التي توفر معا bioink هيدروجيل-محاكاة الأنسجة التي يبني أنسجة 3-D وظيفية وقابلة للحياة ويمكن bioprinted لاستخدامها في تطبيقات في المختبر فحص.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبحت مجموعة متنوعة من التقنيات المتاحة التي تتناول الحاجة إلى مصادر بديلة للأعضاء وأنسجة وظيفية من خلال السعي لتصنيع، أو biofabricate، لهم. وقد برزت Bioprinting باعتبارها واحدة من أكثر واعدة من هذه التقنيات. Bioprinting يمكن النظر إليها على أنها شكل من أشكال تلفيق المضافة الروبوتية قطع البيولوجية، والتي يمكن استخدامها لبناء أو نمط قابل للتطبيق الهياكل الجهاز تشبه أو الأنسجة تشبه في 3 أبعاد. (1) في معظم الحالات، bioprinting توظف 3-الأبعاد (3 -D) جهاز الطباعة التي يتم توجيهها بواسطة جهاز كمبيوتر لإيداع الخلايا والحيوية في مواقع محددة، وبالتالي تلخص تشريحيا-يقلد أبنية الفسيولوجية. 2 هذه الأجهزة طباعة "bioink"، والتي يمكن أن تتخذ شكل مجاميع الخلايا، والخلايا مغلفة في الهلاميات المائية أو سوائل لزجة، أو ناقل دقيق خلايا المصنف، وكذلك البوليمرات خالية من الخلايا التي توفر هيكل ميكانيكي أو بمثابة جيش التحرير الشعبى الصينى خالية من الخلاياceholders. 3،4 في أعقاب عملية bioprinting، وهيكل الناتج يمكن نضجت في هياكل النسيج أو العضو وظيفية، واستخدامها لتطبيق نهاية المعد له. 5،6 وحتى الآن، لم يتم طباعتها جهاز بحجم الإنسان تعمل بكامل طاقتها كاملة، ولكن يبقى الهدف الرئيسي على المدى الطويل bioprinting البحث والتطوير. 2 ومع ذلك، على نطاق صغير يجري تنفيذ "عضي" يبني أنسجة حاليا في عدد من التطبيقات، بما في ذلك النمذجة علم الأمراض، وتطوير الأدوية، وفحص السموم.
واحدة من العقبات الرئيسية التي واجهت الباحثين في مجال تطبيق تكنولوجيا bioprinting هو أن عدد قليل جدا من المواد قد وضعت لغرض واضح وهو bioprinting. أن تنجح بشكل فعال في bioprinting، يجب أن مادة بيولوجية تلبية 4 المتطلبات الأساسية. وبيولوجية تحتاج الى 1) الخواص الميكانيكية المناسبة لتمكين ترسب (سواء كان ذلك البثق من خلال فوهة كما هلام أو طnkjet كما قطرات)، 2) القدرة على الاحتفاظ بشكلها كعنصر من عناصر هيكل 3-D بعد الترسيب، 3) القدرة على التحكم المستخدم من الخصائص السابقة 2 و 4) صديقة للبيئة وداعمة خلية في كل مراحل الإجراء bioprinting 7 تاريخيا، bioprinting العمل وكثيرا ما حاولت أن توظف الحيوية التقليدية الموجودة في أجهزة bioprinting دون النظر لمدى توافقها، بدلا من تصميم مادة بيولوجية لديها خصائص اللازمة لbioprinting وتطبيقات ما بعد الطباعة اللاحقة.
وقد وضعت مجموعة متنوعة من bioinks مؤخرا إلى واجهة أفضل مع الأجهزة ترسب وتلفيق. نظم هيدروجيل القياسية تثير مشاكل كبيرة لأنها موجودة عموما إما السلائف حلول السوائل مع خصائص ميكانيكية كافية، أو الهلاميات المائية بلمرة أنه إذا المطبوعة يمكن أن تسد فوهات أو تصبح تفككت على عملية قذف. فريق العمل لدينا، وكذلك تنقية المياهالتمرير، واستكشفت الصيغ المختلفة هيدروجيل لمعالجة هذه المشاكل bioprinting، بما في ذلك الطباعة خلية كروي إلى ركائز هيدروجيل، 5،8 الخلية وخيوط هيدروجيل قذف من الأنابيب microcapillary، 9-11 extrudable حمض الهيالورونيك (HA) الهلاميات المائية جسيمات متناهية الصغر -gold مع خصائص ديناميكية يشابك 12 مراقبة الزمنية للصلابة هيدروجيل باستخدام photopolymerizable methacrylated HA والجيلاتين، 13 يشابك أساس الفيبرينوجين-الثرومبين، 14،15 التبادل الأيوني المواد الهلامية الجينات الكولاجين و 16 و مؤخرا تبلمر السريع الأشعة فوق البنفسجية (UV) يشابك -initiated، 17
هذه الأمثلة توضح جدوى من المواد التي يمكن أن تولد من قبل bioprinted على نحو فعال. ومع ذلك، بالإضافة إلى التكامل مع الأجهزة، لتوليد بنجاح يبني أنسجة 3-D قابلة للحياة وظيفية، يجب الحيوية تحتوي على منبهات الكيميائية الحيوية والميكانيكية التي تساعد في الحفاظ على الخلويسلامة وظيفة. هذه العوامل الإضافية، وملامح الكيمياء الحيوية والميكانيكية، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على وظيفة ناجحة ليبني أنسجة bioprinted.
كل من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية الأم (ECM) هي المسؤولة عن تقديم مجموعة واسعة من الجزيئات يشير مثل عوامل النمو وغيرها من السيتوكينات إلى خلايا أخرى. الجمع بين هذه الإشارات تختلف من الأنسجة إلى الأنسجة، ولكن يمكن أن تكون فعالة للغاية ومؤثر في تنظيم الخلايا والأنسجة السلوك. 18 توظيف مكونات ECM الأنسجة محددة من الأجهزة المختلفة وتنفيذ كما هيدروجيل أو كجزء من هيدروجيل تم استكشافها مع نجاح 19-21 هذا النهج، الذي يتألف من decellularizing نسيج معين، تحطيم ذلك، وحلها، ويمكن استخدامها لإنتاج الإشارات البيوكيميائية الأنسجة محددة من أي نوع من الأنسجة، ويمكن إدراجها في 3-D بنيات هيدروجيل 22
بالإضافة إلى،تم توثيقه على نطاق واسع أن الأنسجة في الجسم تحتل مجموعة واسعة من التصلب. 23 وعلى هذا النحو، والقدرة على ضبط الخواص الميكانيكية للمواد حيوية، مثل مرونة معامل E 'أو القص مرونة معامل G'، هو أداة مفيدة في هندسة الأنسجة . كما هو موضح أعلاه، السيطرة على الخواص الميكانيكية bioink تسمح biofabrication القائم على قذف باستخدام هلام لينة، والتي يمكن بعد ذلك التلاعب مزيد من يشابك الثانوي في مرحلة لاحقة، والذي لا يمكن أن يتحقق مستويات معامل مرنة أن يتطابق مع نوع الجهاز المستهدف. على سبيل المثال، يمكن تخصيص المواد الحيوية لتتناسب مع صلابة من 5-10 كيلو باسكال مثل الكبد الأصلي، 23 أو تتطابق مع صلابة من 10-15 كيلو باسكال مثل الأنسجة القلبية الأم، 24،25 في نظرية زيادة قدرة هذه organoids للعمل في بطريقة مماثلة لنظرائهم الأنسجة الأصلية الخاصة بهم. وكان تأثير صلابة البيئية على النمط الظاهري خلية إكسبlored في السنوات الأخيرة، وخاصة فيما يتعلق الخلايا الجذعية. أظهرت إنجلر وآخرون أن مرونة الركيزة ساعد في قيادة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) نحو الأنساب مع مرونة الأنسجة مطابقة أن الركيزة. 25 هذا المفهوم قد مواصلة استكشاف للتمايز في العضلات، وظيفة القلب، والنمط الظاهري الكبد، الجذعية المكونة للدم تكاثر الخلايا ، والحفاظ على الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية. 24،26-29 أن تكون قادرة على ضبط هيدروجيل إلى الرجوعية المرنة المختلفة هو سمة هامة من مادة بيولوجية التي سيتم استخدامها لbiofabricate بنيات الأنسجة. 30
نحن هنا وصف البروتوكول الذي يمثل نهج متعدد الاستعمالات يستخدم في مختبرنا لصياغة نظام هيدروجيل التي يمكن قذف bioprinted، ومصممة خصيصا ل1) تحتوي على الشخصية الكيمياء الحيوية من نوع الأنسجة معين و 2) تقليد معامل مرونة من هذا النوع الأنسجة . من خلال معالجة هذه الاحتياجات، ونحن نهدف إلى provide المواد التي يمكن تلخيص الخصائص الفيزيائية والبيولوجية في الجسم الحي الأنسجة. 31 نظام مركب هيدروجيل حدات الموصوفة هنا يستفيد من نهج يشابك متعددة لانتاج bioinks extrudable، ويسمح يشابك الثانوي لتحقيق الاستقرار ويزيد من تصلب المنتجات النهائية لمباراة مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. والتقى التخصيص الكيمياء الحيوية باستخدام مكونات ECM الأنسجة محددة. كما مظاهرة، ونحن توظيف مجموعة متنوعة الكبد محددة من هذا النظام هيدروجيل إلى bioprint الكبد وظيفي يبني عضي. يستخدم بروتوكول صفها مخصص 3-D جهاز bioprinting. بشكل عام، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمعظم الطابعات القائم على قذف، والمعلمات الطباعة محددة تختلف بشكل كبير لكل نوع من الجهاز وتتطلب اختبار من قبل المستخدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. هيدروجيل Bioink صياغات والتحضير
- من أجل تقديم لمحات الحيوية أنسجة محددة، وإعداد الأنسجة محددة ECM هضم الحلول كما هو موضح سابقا للكبد. 20
ملاحظة: بشكل عام، وهذا ECM هضم تشكل 40٪ من حجم bioink هيدروجيل النهائي الذي يعمل. عدة مئات من مل من محلول ECM هضم يمكن إعداد، aliquoted، وتجميد في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. - قبل هيدروجيل صياغة، بحل photoinitiator، 2-هيدروكسي-4 "- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone، في المياه عند 0.1٪ ث / ت.
ملاحظة: أحجام التداول في نطاق 50-100 مل يمكن إعداد في وقت سابق وتخزينها محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر. - لتشكيل bioinks هيدروجيل، أولا بحل مكونات المادة الأساسية من مجموعات هيدروجيل حمض الهيالورونيك (ها) في حل المياه photoinitiator.
- حل الجيلاتين thiolated HA و thiolated بشكل منفصل في الماء فhotoinitiator الحل (الخطوة 1.2) لجعل 2٪ ث / حلول الخامس.
- حل diacrylate البولي ايثيلين جلايكول (PEGDA)، وcrosslinker في مجموعات هيدروجيل، في حل المياه photoinitiator (الخطوة 1.2) لجعل 8٪ ث / ت حل.
- حل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) آلكاين 8 ذراع (10 كيلو دالتون ميغاواط) في المياه photoinitiator الحل (الخطوة 1.2) لجعل 8٪ ث / ت حل.
- بشكل عام، تشكل الهلاميات المائية باستخدام نظام التالية، على الرغم من أن التخصيص الإضافي ممكن.
- الجمع بين 4 أجزاء 2٪ thiolated HA، 4 أجزاء 2٪ thiolated الجيلاتين، 1 جزء crosslinker 1، 1 جزء crosslinker 2 مع 8 أجزاء ECM الأنسجة حل و2 أجزاء وسائل الإعلام ثقافة الكبدية (HCM) (أو 10 أجزاء من الماء باعتباره غير الأنسجة عامة هيدروجيل -specific).
ملاحظة: معدلة إضافية HA أو الجيلاتين يمكن أن تضاف إلى جعل قذف bioink أكثر سلاسة. يوصف هذا أدناه.
- الجمع بين 4 أجزاء 2٪ thiolated HA، 4 أجزاء 2٪ thiolated الجيلاتين، 1 جزء crosslinker 1، 1 جزء crosslinker 2 مع 8 أجزاء ECM الأنسجة حل و2 أجزاء وسائل الإعلام ثقافة الكبدية (HCM) (أو 10 أجزاء من الماء باعتباره غير الأنسجة عامة هيدروجيل -specific).
- دوامة الخليط الناتج على ارتفاع (سرعة 10 من أصل 10) لمدة 10 ثانية لخلط قبل الاستخدام. </ لى>
- استخدام bioink هيدروجيل
- البثق أو اختبار bioprinting، ونقل الخليط في المحاقن أو الطابعة خرطوشة والسماح لها تشعبي من تلقاء أنفسهم لمدة 30 دقيقة (المرحلة 1 يشابك) عند 37 درجة مئوية.
- لقياس الانسيابية، ونقل الخليط إلى 35 مم طبق بيتري والسماح لها تشعبي لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: الخليط يبدأ على الفور إلى تشعبي من خلال تشكيل ثيول-اكريليت السندات وسوف تبدأ في الزيادة في اللزوجة. يجب نقل الخليط إلى حقنة، خرطوشة طباعة، أو موقع الهدف في غضون 10 دقيقة لتجنب انسداد ماصة أو حقنة أثناء النقل. - عندما يكون المطلوب يشابك الثانوي (المرحلة 2)، أشرق المرحلة الهلام 1-crosslinked مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 18 واط / سم 2) لبدء تفاعل البلمرة-ثيول آلكاين.
ملاحظة: مدة إشعاع تعتمد على المساحة السطحية للمادة. بشكل عام، سنتيمتر مربع من المواد يتطلب سوى 1-2 ثانية من التعرض للأشعة فوق البنفسجية في هذه السلطة للأشعة فوق البنفسجية.
2. طابعة اختبار التوافق
- قبل اختبار التكامل مع أجهزة bioprinting، وخصائص اختبار قذف على مقاعد البدلاء المختبر مع الاختبارات قذف بسيطة باستخدام الحقن القياسية والصغيرة نصائح إبرة قياس (20-30 قياس).
- دفع bioink من خلال حقنة القياسية لتحقيق خيوط مقذوف بسلاسة من هيدروجيل مع عدد قليل أو أي عقبات. البثق خطوط أو أنماط بسيطة غير كافية لتحديد النجاح.
- للتكامل bioprinter، تحميل bioink الاستعدادات من قبل pipetting لهم في الطابعة خراطيش، والسماح 30 دقيقة لbioink للخضوع عفوية المرحلة 1 يشابك داخل خرطوشة.
ملاحظة: حجم bioink يعتمد على تطبيق معين وينبغي أن تحدد من قبل المستخدم. خراطيش الطابعة قد تشبه أو أن يكون الحقن التي تتوافق مع الجهاز bioprinter. - تقييم التوافق قذفلbioprinting عن طريق طباعة نمط بسيط باستخدام bioink. على سبيل المثال، طباعة نمط 7 × 7 مم تتألف من خطوط متوازية. الضغط (على سبيل المثال، 20 كيلو باسكال ضغط هوائي) في حين أن تحركات رأس الطباعة في الطائرة XY في سرعة ما يقرب من 300 مم / دقيقة.
ملاحظة: قطر فوهة رأس الطباعة من مختلف الأحجام يمكن استخدامها، ولكن فوهات المخروطية مع فتحات بقطر 400-500 ميكرومتر هي الأمثل لطباعة الكروية في نطاق 250-350 ميكرون.- إذا كانت المواد مقذوف هي العقدي أو غير منتظمة، راجع الخطوة 2.4، أو تقليل كمية PEGDA لتليين المواد crosslinked المرحلة 1. تركيبات bioink أعدت بشكل صحيح قذف بسلاسة، والسماح ترسب الدقيق في أنماط المطلوب أو أبنية.
ملاحظة: الإجراءات bioprinting استخدام وصف مخصص 3-D جهاز bioprinting مصممة في منزل خصيصا للأنسجة بناء الطباعة 32 وهذه المعالم الطباعة ومحددة تختلف بشكل كبير لكل نوع من الجهاز وتتطلب testin.ز من قبل المستخدم.
- إذا كانت المواد مقذوف هي العقدي أو غير منتظمة، راجع الخطوة 2.4، أو تقليل كمية PEGDA لتليين المواد crosslinked المرحلة 1. تركيبات bioink أعدت بشكل صحيح قذف بسلاسة، والسماح ترسب الدقيق في أنماط المطلوب أو أبنية.
- لتحسين خصائص البثق، تكملة معدلة HA والجيلاتين إلى bioinks (1.5 ملغ / مل و 30 ملغ / مل، على التوالي).
3. التحقق من Bioprinting مع الكبد التركيبات الابتدائية
- إعداد 3-D الكروية الأساسي خلايا الكبد شنقا أساليب انخفاض باعتبارها العنصر الخلوي 33
ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها Bioprinting دون الكروية، ولكن بدلا من ذلك مع الخلايا الفردية معلقة في bioinks هيدروجيل كذلك. ويعمل الكروية هنا لتسريع التفاعلات خلية خلية وبناء وظيفة. يعتمد عدد الكروية أو خلايا يعملون على تطبيق معين وينبغي أن تحدد من قبل المستخدم. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات تحت ظروف معقمة، وذلك باستخدام مواد معقمة.- إعداد HCM بإضافة محتويات إذابة للHCM عدة عنصر مكمل لوسائل الإعلام الكبدية القاعدية (HBM) وتصفية العقيمة.
- ذوبان الجليد في الامم المتحدة مكونات الملحقسمسم السائل.
- إضافة مكونات ملحق (حمض الاسكوربيك، 0.5 مل، ألبومين المصل البقري [الأحماض الدهنية الحرة]، 10 مل، جنتاميسين سلفات / الأمفوتريسين B، 0.5 مل، الهيدروكورتيزون 21 hemisuccinate، 0.5 مل، الانسولين، 0.5 مل، عامل نمو البشرة المؤتلف الإنسان 0.5 مل، نقل، 0.5 مل) إلى HBM 500 مل.
- تصفية العقيمة من خلال 0.45 ميكرون أو 0.22 ميكرون تصفية باستخدام زجاجة أعلى وحدة تصفية أو تصفية حقنة طرف.
- تحديد كثافة خلية من خلايا الكبد الأولية الإنسان، خلايا كوبفر، والخلايا النجمية التي تعول على عدادة الكريات بعد أن تم إذابة كل نوع من الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- الجمع بين خلايا الكبد الأولية الإنسان، خلايا كوبفر، والخلايا النجمية في نسبة 80:10:10 بواسطة عدد الخلايا في وسائل الإعلام HCM التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي الشكل.
ملاحظة: حجم وسائل الاعلام لاستخدامها يعتمد على عدد الخلايا الإجمالي المحدد للتطبيق ويجب ان يحدده عشرالبريد المستخدم. - الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 520 x ج عند 20 درجة مئوية.
- نضح طاف، وترك وراء بيليه الخلية.
- resuspend الكرية خلية في وسائل الإعلام HCM لتسفر عن التعليق الخلية التي تحتوي على 1000 خلية لكل ميكرولتر 40 وسائل الإعلام. اجمالى حجم يعتمد على عدد من الأجسام الشبه الكروية التي يتم إنتاجها.
- نقل تعليق خلية لوحات قطرة شكل اعدام 96-جيدا. إضافة ما مجموعه حوالي 1000 خلايا إلى كل بئر في الرابع والحفاظ على 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2 لمدة 3 أيام خلالها تشكل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا.
- جمع الكروية الكبد من لوحة قطرة شنقا باستخدام pipettor. نقل إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إعداد HCM بإضافة محتويات إذابة للHCM عدة عنصر مكمل لوسائل الإعلام الكبدية القاعدية (HBM) وتصفية العقيمة.
- الكروية الكبد Bioprint في الكبد محدد هيدروجيل bioink
- إعداد صياغة الكبد التي تحتوي على ECM هيدروجيل bioink كما هو موضح في الخطوة 1، وتوظيف 8٪ PEGDA و 8٪ 8-الذراع PEG آلكاين كما crosslinkers. استخدام هذا المزيج لقدرتها في دورة الفتشوبlting في هيدروجيل وثيق في معامل مرونة القص لأنسجة الكبد الأم.
- دع الكروية تترسب في قاع الأنبوب المخروطية التي تم وضعها في الخطوة 3.1.7. يختلف هذا استنادا إلى حجم كروي وكثافة، ولكن يحدث عادة في غضون 1-2 دقيقة. إزالة كافة وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية أو مع pipettor.
- نقل حجم المطلوب من الطازجة حل هيدروجيل bioink إلى أنبوب مخروطي يحتوي على الأجسام الشبه الكروية. عموما، حجم مناسب هو 10٪ -25٪ أكبر من حجم بناء 3-D المراد طباعتها. ماصة بعناية صعودا وهبوطا ل resuspend الكروية في حل هيدروجيل bioink. نقل على خرطوشة bioprinter باستخدام pipettor أو ماصة المصلية.
- داخل خرطوشة bioprinter، والسماح للحل للخضوع المرحلة الأولى يشابك (ثيول-اكريليت رد فعل) لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: اعتمادا على حجم كروي، قد يحتاج خرطوشة أن يكون ببطء استدارة أو قد تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع محتوياتملعقة معقمة للحفاظ على الكروية توزع في جميع أنحاء bioink خلال يشابك المرحلة 1. وهذا هو أقل من ضرورة لbioinks أعدت مع خلايا مع وقف التنفيذ بدلا من الكروية.
ملاحظة: بعد مرحلة 1 يشابك، يكون لدى المستخدمين نافذة التشغيل لعدة ساعات. ومع ذلك، فمن المستحسن لتنفيذ عملية bioprinting بسرعة لتحسين بقاء الخلية. - وبعد مرحلة 1 يشابك، استخدام جهاز bioprinting إلى إنشاء هياكل هيدروجيل المرجوة التي تحتوي على الأجسام الشبه الكروية الكبد الأولية (أو الخلايا الأخرى).
ملاحظة: توفر هذه التقنية نظام لbiofabricating مجموعة واسعة من الهياكل. المعلمات مثل إجمالي حجم وعدد الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية، هندسة هيكل المطبوعة، والركيزة التي تطبع يبني تعتمد اعتمادا كبيرا على أهداف للمستخدم. - بعد الترسيب في تكوين المطلوب، إدارة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2-4 ثانية لبدء آلية يشابك الثانوية، وتحقيق الاستقرار والتعاونnstructs وزيادة صلابة إلى المستوى المطلوب.
ملاحظة: إن تركيز PEG-آلكاين، وبالتالي فإن كثافة يشابك النهائية الشاملة، يتحكم في المقام الأول على صلابة بناء النهائية. - كرر الخطوات 3.2.4 و3.2.5 من أجل إنشاء بنيات متعددة الطبقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما يتم اتباع الإجراءات المذكورة أعلاه بشكل صحيح، يجب أن تحتوي الهلاميات المائية لمحة البيوكيميائية محددة لنوع النسيج المستهدف، 20 تسمح للحصول على درجة عالية من السيطرة على bioprinting ومعامل المرونة النهائي، 34 ودعم خلايا وظيفية قابلة للحياة في بنيات الأنسجة.
هيدروجيل التخصيص
إلى أفضل الكبد الأصلي المقلد، استكمل bioink هيدروجيل من قبل حلول ECM الكبد وصفيف عامل النمو، 20 حلول ECM تحتوي على مجموعة متنوعة واسعة من عوامل النمو والسيتوكينات (كما هو موضح في جزء من الغرام / مل، الشكل 1A). وتشمل هذه المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF)، bFGF، البروتين مخلق العظام 5 (BMP-5)، جمعية جيل المستقبل-4، وعامل النمو الذي يشبه الانسولين بروتين 2 (IGFBP-2)، TGF- B1، BMP-7، EGF ، جمعية جيل المستقبل-7، وهرمون النمو (GH)، عامل النمو EGF مثل ملزم الهيبارين (HB-EGF)، HGF و neurotrophin 3 (NT-3). بالإضافة إلى ذلك، حلول إدارة المحتوى في المؤسسة تحتوي على المكونات الهيكلية إضافية، التي يتم تحليلها من قبل المقايسات اللونية. 20 لحلول ECM الكبد، بلغ إجمالي محتوى الكولاجين حلول ECM الكبد 91.33 ± 0.58 ملغ / مل، وكان محتوى الإيلاستين 189.33 ± 48.40 ملغ / مل، و كان غلكسمينوغلكن] (GAG) محتوى 86.00 ± 53.45 ملغ / مل (الشكل 1B).
bioink هيدروجيل الخواص الميكانيكية يمكن أن توصف باستخدام اختبار القص الإجهاد الاجتياح (0،6 حتي 10 با، تردد التذبذب 1 هرتز) على مقياس غلفاني. 10،12،13،34 من خلال السماح عفوية المرحلة 1 ثيول-اكريليت الكيمياء تحدث في الرقم الهيدروجيني محايدة، يتم تشكيل هيدروجيل لينة مع G 'من 113.66 ± 22.59 بنسلفانيا. بعد بدء مرحلة 2-ثيول آلكاين يشابك بواسطة بلمرة ضوئية المنشأ للأشعة فوق البنفسجية، G 'الزيادة إلى ما يقرب من 10 كيلو باسكال (10637 ± 113.83 بنسلفانيا، فيقوإعادة 1C)، ومحاكاة الكبد مرونة الأنسجة. التلاعب إضافي للتركيز، والأوزان الجزيئية، وهندستها من crosslinkers يمكن أن يحقق مجموعة واسعة من القيم المرحلة 2 G ". 34
جودة هيدروجيل bioprinted
يوصف استراتيجية الكيميائية وتنفيذ المرحلة 1 والمرحلة 2 يشابك من bioinks هيدروجيل في الشكل (2). وبشكل عام، crosslinkers مثل Extralink، والتي تقوم على البوليمرات PEG acrylated، رد فعل عفوي مع مجموعة ثيول على HA وسلاسل الجيلاتين في محايدة الرقم الهيدروجيني (المرحلة 1) في وجود خلايا لتشكيل هيدروجيل extrudable لينة. هذا هيدروجيل لينة يمكن bioprinted باعتباره bioink، وبعد ذلك يتم استخدام الأشعة فوق البنفسجية لبدء بلمرة ضوئية المنشأ من التجولات غير المتفاعل وcrosslinkers الثانوي على أساس البوليمرات PEG المعدلة آلكاين. الأوزان الجزيئية معينة وهندستها من crosslinkers تذهبفيرن صلابة نهاية التركيب bioprinted. وتم تنفيذ ملم نمط 7 × 7 لأغراض الاختبار (الشكل 3A). وأظهرت الاختبارات الأولية أن الصياغات الأولية كانت extrudable، ولكن يبدو غير النظامية وتجمعت أثناء وبعد البثق (الشكل 3B). لتحسين خصائص البثق، واستكملت معدلة HA والجيلاتين إلى bioinks (1.5 ملغ / مل و 30 ملغ / مل). يظهر تحسن هيكل المطبوعة على نحو سلس في الشكل 3C.
سلامة وظيفة أساسية من bioprinted يبني الكبد الإنسان الأساسية
باستخدام-D 3 bioprinter تم استخدام النشطة بيولوجيا الكبد محدد bioink هيدروجيل لتغليف وإيداع الكروية الكبد الإنسان الأساسية، شنقا الثقافات قطرة، على coverslips بلاستيكية معدة مسبقا. تتم طباعتها coverslips على البلاستيك يسمح للتعامل مع القوي ونقل إلى مجموعة متنوعة من بيئات زراعة الخلايا. بعد bioprinting، مرحباوقد لوحظ بقاء الخلية غ في بنيات الكبد بعد ايف / الميت الجدوى / تلطيخ السمية الخلوية والفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 4A). تحت الظروف البيئية المثلى يجب أن تكون الجدوى فوق 85٪. تعتبر خلايا الكبد البشرية الأولية عموما حساسة للضغوط الميكانيكية والكيميائية، الأمر الذي يتطلب بعض التحسين من المتغيرات البيئية.
بعد bioprinting والتحقق من الجدوى، يبني الكبد الإضافية التي يتم وضعها في الثقافة يمكن تقييم حصول على وظائف من خلال تحليل قسامات وسائل الاعلام إزالتها في اليوم 3، يوم 7، يوم 10، ويوم 14 لتحليل اليوريا يفرز والزلال. المقايسات اليوريا اللونية تكشف عن وجود مستوى ثابت نسبيا من إفراز اليوريا من يبني الكبد على مدار الساعة لمدة 14 يوما، وتبقى ما بين 15 و 20 نانوغرام / مل (الشكل 4B). وكانت مستويات اليوريا الكشف لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض في أوقات مختلفةنقاط. فحص الإنسان الزلال إليسا يكشف عن أن إنتاج الألبومين من يبني لا يزال أيضا ثابت نسبيا مع مرور الوقت، وتبقى مستقرة بين 125 و 140 نانوغرام / مل (الشكل 4C). بالإضافة إلى ذلك، عندما ملطخة عن علامات تدل على أنسجة الكبد والتعبير الإيجابي من الزلال داخل الخلايا، CYP3A4 (أ الإسوي السيتوكروم P450 تشارك في التمثيل الغذائي)، كادهيرين E (وهي الظهارية خلية خلية بروتين التصاق)، وdipeptidyl ببتيداز-4 (بروتين أعرب عالية في الكبد) ويلاحظ (الشكل 4D-F). أخذت معا، وهذا الجدوى والبيانات الوظيفية تشير إلى أن المساعدات هيدروجيل bioink الأنسجة محددة في الحفاظ على سلامة وظيفة bioprinted يبني الكبد خلية القاعدة الأولية.
الشكل 1. هيدروجيل توصيف عنصر وتقييم صلابة. أ) عامل النمو وتحليل خلوى من البروتينات المصفوفات لحلول إدارة المحتوى في المؤسسة أعدت من الكبد. ب) اللونية الكمي فحص الكولاجين، غلكسمينوغلكن]، ومحتوى الإيلاستين في مجال حلول إدارة المحتوى في المؤسسة الكبد. C) مظاهرة من القدرة على التحكم في صلابة bioink. بعد مرحلة 1 يشابك، وهلام لينة نسبيا وقادرة على أن تكون مقذوف على نحو سلس. بعد مرحلة 2 يشابك بواسطة الأشعة فوق البنفسجية، ويزيد من معامل المرونة من قبل أكثر من أمر من حجم، ومحاكاة أنسجة الكبد معامل المرونة. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. توظيف متعددة crosslinkers أساس الربط بين لbioprinting قذف والسيطرة على الأنسجة بناء الخواص الميكانيكية. Strategy من صياغة bioinks للطباعة تتألف من crosslinkers القائم على اكريليت (crosslinker 1)، crosslinkers القائم على آلكاين (crosslinker 2)، thiolated HA، الجيلاتين thiolated والمواد ECM الأنسجة، ومعدلة HA و الجيلاتين. وأعدت صياغة bioink وcrosslinks بشكل عفوي من خلال ثيول-اكريليت ملزمة، مما أدى إلى مادة لينة، extrudable. يتم تنفيذ Bioprinting. وأخيرا، وتنصهر الطبقات bioprinted، استقرت، وتقديمهم إلى الكبد معامل المرونة. ويمكن تكرار هذه العملية لتوليد هياكل متعددة الطبقات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. Bioprinting اختبار bioinks. أ) تم استخدام 7 × 7 ملم نمط لف لbioink اختبار قذفأدى جي في bioprinter. ب) صياغة أولية لPEGDA و 8 الذراع PEG bioink آلكاين في عدم انتظام ترسب. C) إضافة HA الخام والجيلاتين تحسنت قذف، مما أدى إلى قذف السلس للbioink. شريط النطاق - 1 ملم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. مظاهرة الحيوية وظيفة الكروية الكبد bioprinted في الكبد محدد هيدروجيل bioink. أ) تنفيذ bioink الكبد لbioprinting، أسفرت عن ثوابت قابلية عالية. الأخضر - calcein AM-ملطخة خلايا قابلة للحياة. الأحمر - إيثيديوم الملون homodimer الخلايا الميتة ب) اليوريا وC) الألبومين التي يفرزها الكبد يبني أكثر من 14 د.آيس في الثقافة وكميا عن طريق فحوصات اللونية وإليسا، على التوالي. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. المناعية من علامات المرتبطة بأنسجة الكبد: D) CYP3A4، E) الزلال داخل الخلايا، وF) DPP4 وE-كادهيرين. أخضر أو أحمر - أشار وصمة عار. الزرقاء - دابي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من المكونات التي تعتبر حاسمة في الاعتبار عند محاولة biofabricate 3-D بنيات الأنسجة، لاستخدامها في نهاية المطاف في البشر أو في المختبر تطبيقات الفرز. توظيف المكونات الخلوية المناسبة يحدد وظيفة محتملة نهاية، في حين أن جهاز biofabrication نفسه يحدد منهجية عامة للوصول إلى بناء النهاية. أما العنصر الثالث، وبيولوجية، هو نفس القدر من الأهمية، لأنه يحقق الأدوار المزدوجة. على وجه التحديد، يجب أن يكون عنصر بيولوجية متوافق مع كل من الأجهزة biofabrication (أي bioprinters)، وكذلك دعم مكونات الخلية البيولوجية قد تكون هشة. يمكن الاستفادة المثلى من كل هذه المتطلبات من الصعب، كما تحتاج المواد bioprintable لتلبية العديد من المعلمات رئيسية هي: 1) تمتلك خصائص الكيميائية المناسبة، الميكانيكية، والزمانية لتسهيل الطباعة فعالة وغير مقيدة. 2) بقاء الخلية الدعم خلال مراحل إعداد وbioprinالإجراء تينغ. 3) وتوفير بيئة مضيافة أن أفضل يعزز بقاء الخلية وفي نهاية المطاف وظيفة بناء الأنسجة بعد bioprinting. ونحن توظيف النظام هيدروجيل bioink حدات موضح في منهجية الموصوفة هنا لتلبية هذه الاحتياجات. أولا، من خلال دمج عوامل النمو، الكولاجين، الكمامات، والمرنين المستمدة من ECM من نوع الأنسجة معين، يمكننا تحقيق الشخصية البيوكيميائية التي تذكر نوع النسيج المستهدف. ثانيا، من خلال توظيف 2 مماثلة، ولكن مستقلة ردود الفعل يشابك ونحن قادرون على تحقيق مادة extrudable الناعمة والذي يتوافق مع معظم القائم على قذف، والتي يمكن زيادة تتغير مع الخطوة يشابك الثانية للوصول إلى معامل المواد مصممة المرنة التي تتوافق مع هدف نسيج من الاختيار. 34
السمة الهامة لهذا النظام أن يجعل من المفيد هي القدرة على دعم التفاعلات الكيميائية المتعددة التي يمكن تسخيرها لمعالجة البوليمرحركية rization والخواص الميكانيكية للنظام bioink. من خلال توظيف 2 أنواع رد الفعل مستقلة، ثيول-اكريليت وثيول-آلكاين، نحقق القدرة على تنفيذ المرحلة 1-ثيول أكريليت رد فعل ينتج عنه مادة لينة يمكن مقذوف من خلال حقنة أو bioprinting الجهاز، وثيول المرحلة 2 رد فعل -alkyne، الذي يبدأ فقط عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية في وجود photoinitiator، والذي يحدد معامل المرونة للبناء bioprinted النهائي. هذه خطوات متعددة ينتج عنها مادة bioprintable. على هذا النحو، من أجل تحقيق bioink مستقر يدعم قذف ولاحق التخصيص معامل المرونة، والحفاظ على هذه الأنواع رد فعل منفصلة هو المهم.
القرعة الأولية لاستخدام نظام biofabrication هو سهولة التخصيص، والتي تتم إما عن طريق التلاعب في معامل مرونة نهاية من خلال crosslinker الثانوي، أو من خلال إدراج مواد مختلفة ECM المستمدة من الأنسجة أو الكوكتيلات عامل النمو. إدارة المحتوى في المؤسسة في الأنسجة يحتوي على مجموعة متنوعة من عوامل النمو والسيتوكينات الأخرى، والتي غالبا ما تختلف في التوزيع الشامل بين أنواع الأنسجة. ونحن نعتقد أن هذه العوامل هي جزء لا يتجزأ للحفاظ على وظيفة من أنواع الخلايا معينة، مثل خلايا الكبد البشرية الأساسية. وقد تجلى تنفيذ هذا المفهوم من قبل لزيادة سلامة وظيفة خلايا الكبد البشرية الأساسية في heparinized الثقافات حمض شطيرة الهيالورونيك. 20 عن طريق الجمع بين سلاسل الهيبارين في هيدروجيل مع عوامل النمو ملزم الهيبارين وكذلك مكونات ECM أخرى من ECM الكبد، تمكنا لعرض هذا الملف الكيمياء الحيوية الكبد محددة لخلايا الكبد البشرية الأساسية، والحفاظ على سلامة وظيفة في المختبر لفترة طويلة من الزمن. يمكن بسهولة أن يمتد هذا النهج إلى أنواع الأنسجة الأخرى، مما يسمح للباحثين لتحقيق خلاصة هذه العوامل الأنسجة محددة من قبل decellularizing والانحلال الأنسجة الأخرى.
خيمة "> يجب أن يكون المستخدمون على علم أنه في حين تم تنفيذ المكونات الأساسية لهذا النظام bioink في bioprinting سابقا، 10،12،17 ولكن في ونهج أقل مختلفة بعض الشيء الأنسجة محددة، فضلا عن مجموعة متنوعة من التطبيقات الأخرى الطب التجديدي، 35- لم يحاول 45 biofabrication لجميع أنواع الأنسجة. وعلى هذا النحو، قد يكون هناك بعض مزيد من التطوير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المطلوبة من أجل إنشاء هذه بنيات الأنسجة الإضافية. ومع ذلك، فإن نظام وحدات مثل التي وصفت هنا قد يكون جيدا جدا للتكيف. إمكانات أخرى وتشمل القيود الانتماءات الطبيعية التي قد يكون لها بعض أنواع الخلايا تجاه المواد الحيوية المحددة. وبشكل عام، فقد وجدنا أن المكونات الأساسية حامض، استنادا PEG-الجيلاتين، والهيالورونيك من هذا الدعم نظام هيدروجيل ثقافات قابلة للحياة من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، ولكن هناك قد يكون بعض أنواع الخلايا التي تؤدي بشكل أفضل في البيئات هندسيا من تركيبات مختلفة، مثل الكولاجين، التي لديها ليفي الأصيل غتلح، أو الإيلاستين، الذي هو بطبيعته أكثر مرونة. على هذا النحو، والنظر للمادة الأمثل لنوع نسيج معين وتطبيق حد مهم، ونظام هيدروجيل bioink الموصوفة هنا قد لا تكون كافية لجميع الاستخدامات. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم النظر في الظروف البيئية التي يتم تنفيذ bioprinting. خلال تطوير هذا البروتوكول، ونحن انتقلت من المحيط القريب (درجة حرارة الغرفة) شروط استخدام bioinks دون أي وسائل الإعلام الخلية، مما يؤدي إلى بقاء الفقيرة إذا كان الوقت اللازم لإعداد وطباعة رسمها جدا من والبروتوكولات لأكثر السريع تحت 37 درجة مئوية باستخدام bioinks مع مكون سائل الإعلام، والتي زادت بشكل كبير بقاء الخلية.حتى وقت قريب، وقد وضعت بعض المواد أو الأنظمة المواد تحديدا على التفاعل مع أنظمة bioprinting. ونتيجة لذلك، فإن معظم المواد هي في التبسيط، والاستفادة إما الخصائص البيولوجية لدعم خلايا، أو توافقها مع biofabricationالمعدات. عدد قليل من المواد هي الأمثل في الدارين. النظام المذكور في هذه المنهجية على فصل هذه الخصائص، مما يتيح التخصيص من توصيف البيولوجي، مع تسهيل الخواص الميكانيكية اللازمة لbioprinting قذف. ثمة ميزة أخرى إضافية لهذا النظام هيدروجيل bioink هو أنه يمكن أن تحاكي كل من القياسات البيوكيميائية والفيزيائية للالأنسجة المستهدفة يتم استخدامه لbiofabricating. وهذا يدعم مستوى هائل من المرونة، مما يسمح خلاصة من العوامل الحيوية في أي نوع من الأنسجة تقريبا، وكذلك مطابقة معامل مرونة من أي نوع من الأنسجة اللينة. ونادرا ما استكشاف الانتباه إلى كل هذه الجوانب من الأنسجة في وقت واحد.
طبيعة وحدات من هذه التكنولوجيا تتيح مرونة التي سيتم تنفيذها في طائفة واسعة من التطبيقات. القدرة على تقليد أنواع الأنسجة المختلفة وتوفر القدرة على biofabricate ليس فقط يبني الكبد تستخدم كمثال في هذا العمل، ولكن يخدعالبنيات يمثلون العديد من الأنسجة الأخرى في الجسم. ولعل تطبيق واسع النطاق الأكثر وضوحا باستخدام هذه المعايير هو القدرة على المباراة كلا الجانبين لأنسجة معينة لتحسين وظيفة نهاية يبني هندسيا لتطبيقات حقيقية مثل زرع أو المخدرات وفحص السموم. بينما جيل من الأنسجة الحجم البشرية لزرع في المرضى هو الهدف النهائي لكثير من الباحثين، بسبب العقبات التنظيمية، وتوفير المصادر خلية، والقيود المفروضة على القدرة على تصنيع الأوعية الدموية الوظيفي في الأجهزة الأنسجة المهندسة، وهذا الهدف السامي يحتاج إلى مزيد من التطوير والوقت أن تتحقق. ومع ذلك، تقنيات مثل منهجية الموصوفة هنا بدأت حاليا لتنفيذها لتوليد "organoids" لفي المختبر المنصات. فريق العمل لدينا، فضلا عن غيرهم، والاستفادة حاليا عضي biofabrication لخلق أنظمة النموذج الذي يتم تنفيذ دراسات علم السموم. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا organoids يمكن استخدامها لدراسة الأمراض وتطور المرض، مثل السرطان و 46 و اختبار العلاجات المحتملة. وأخيرا، كما يدعم هذا النظام استخدام آخر مهم. عن طريق التلاعب هذه المعايير بشكل مستقل، يمكن للباحثين إجراء التجارب العلمية الأساسية لتحديد الأهمية النسبية للالبيوكيميائية في مقابل العوامل الميكانيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
والكتاب الامتنان التمويل من قبل وكالة خفض التهديد الدفاع (اثناء اجتماع السلطة) تحت الفضاء والأنظمة البحرية الحروب مركز المحيط الهادئ (SSC PACIFIC) العقد رقم N6601-13-C-2027. لا يشكل نشر هذه المواد موافقة الحكومة للنتائج أو استنتاجات هنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
