Summary
我们描述一组一起提供组织模仿水凝胶生物油墨与官能的和可行的3-D组织构建可bioprinted在体外筛选应用中使用的协议。
Introduction
近年来，各种各样的技术已经变得可用，通过谋求制造，或biofabricate，他们解决了对功能的器官和组织的替代来源的需求。生物印刷已成为最有希望的，这些技术中的一个。生物印刷可以被认为是生物份的机器人添加剂制造的一种形式，可以使用3维建立或图案上可行的器官样或组织样结构。1在大多数情况下，生物印刷采用3维（3 -D），其由计算机涉及细胞和生物材料存入的精确位置，从而扼要打印装置解剖学-模仿生理结构。2这些设备打印“生物油墨”，它可以采取细胞聚集体的形式，包封在水凝胶的细胞或粘性流体或细胞接种微载体，以及无细胞聚合物，其提供机械结构或作为无细胞PLAceholders 3,4继生物印刷过程中，所得到的结构可以成熟为功能性的组织或器官的结构，并用于其预期的最终应用。5,6-迄今为止，一个完整的全功能人大小器官尚未印制，但它仍然是生物印刷的研究和开发的主要长期目标。2然而，小规模的，目前正在在许多应用，包括病理学建模，药物开发和毒理学筛选实施“类器官”组织构建。
一位研究人员在生物印刷应用技术已经遇到的主要障碍是，很少有材料已用于生物印刷的明确目的开发的。要有效地生物印刷成功，生物材料必须符合4个基本要求。生物材料需要有1）的适当的机械性能，以允许沉积（无论是通过一个喷嘴作为凝胶或一个i-挤出nkjet作为液滴），2），以保持它的形状作为淀积后的3-D结构的一个组成部分的能力，3）的能力为的2现有特征的用户控制，以及4）一个细胞友好和支持的环境在所有生物印刷的过程的阶段。7历史上，工作生物印刷已经常常试图在雇用生物印刷设备现有的传统生物材料而不考虑其兼容性，而不是设计的生物材料有必要与生物印刷后续印刷后的应用程序的性能。
各种bioinks的最近研制与沉积和制造硬件更好的界面。标准水凝胶系统造成显著的问题，因为他们一般既可以是前体的力学性能不足，或者如果可以打印喷嘴堵塞或变成打散在挤压过程中聚合水凝胶流体解决方案。我们的团队，以及行吟诗人RS，已经探索各种水凝胶制剂，以解决这些生物印刷问题，包括细胞球体印刷成水凝胶基质，从微毛细管5,8-细胞和凝胶长丝挤出，9-11挤出透明质酸（HA）-gold纳米颗粒的水凝胶用动态交联的属性使用光聚合的水凝胶刚度的12时间控制甲基丙烯酸HA和明胶，13为基础的纤维蛋白原凝血酶交联，14,15离子交换海藻胶原凝胶，16日和最近的快速聚合紫外线（UV） -引发交联，17
这些例子表明，可以通过有效地bioprinted生成材料的可行性。然而，除了与硬件集成，以成功地产生可行的和功能性的3-D组织构建，生物材料必须包含生物化学和机械线索在维持细胞援助生存力和功能。这些额外的因素，生物化学和机械型材，可以对bioprinted组织构建成功函数显著影响。
两个小区和本机外基质（ECM）是负责呈现宽范围的信号分子如生长因子和其它细胞因子的其他细胞。这些信号的组合从组织到组织而变化，但也可以是在调节细胞和组织的行为非常有效和有影响。18从不同器官用人组织特异性细胞外基质成分和实施为水凝胶或水凝胶的一部分已探索与成功。19-21这种方法，它包括脱细胞的给定组织，粉碎它，并且将其溶解的，可用于从任何组织产生组织特异性生化信号，并且可以在三维水凝胶构建体并入。22
另外，它被广泛记载，在身体组织占据了广泛刚度。23这样，能够调整生物材料，如弹性模量E'或剪切弹性模量G'的机械性能，是在组织工程的有用工具。如上所述，在生物油墨机械性能控制允许使用一个软的凝胶，然后可以通过二次交联在后一点上，可以实现的弹性模量的水平在哪些进一步操作基于挤出的生物制造匹配的靶器官类型的那个。例如，生物材料可定制以满足5-10千帕的刚度本地人一样肝脏，23或匹配10-15千帕的刚度像原生心脏组织，理论上24,25增加这些组织体发挥作用的能力以类似的方式，以它们的天然组织对应物。环境刚度对细胞表型的影响已经EXPlored在近年来，特别是相对于干细胞。恩氏等人证实在驾驶间充质干细胞（MSC）朝向与组织弹性匹配的衬底的谱系计算机辅助该基板的弹性。25这一概念已进一步探索分化成肌肉，心脏功能，肝表型，造血干细胞的增殖和维护的干细胞的治疗潜力的。24,26-29如果能够调谐的水凝胶，以不同的弹性模量是将用于biofabricate组织构建的生物材料的一个重要特征。30
在这里，我们描述了代表在我们的实验室用于配制可挤出bioprinted水凝胶系统中的通用方法，和自定义为1）包含特定的组织类型的生物化学轮廓和2）模仿组织类型的弹性模量的协议。通过解决这些需求，我们的目标是为provide可以概括在体内的生理化学和生物特性的材料的组织。31本文中所描述的模块化的水凝胶的复合系统利用多交联的方法，以得到可挤出bioinks，并允许二次交联，以稳定和增加的刚度高端产品来匹配一系列的组织类型。生化定制是通过组织特异性细胞外基质成分满足。作为示范，我们聘请了肝脏特异性品种这水凝胶系统来的BioPrint功能性肝类器官结构。描述的协议，使用自定义的3-D设备生物印刷。在一般情况下，该协议可以适应大多数基于挤出的打印机，具体印刷参数显着变化对于每种类型的设备，并且需要由用户测试。
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Protocol
1.水凝胶生物油墨配方及制备方法
- 为了提供组织特异性生化型材，制备如前对肝所述组织特异性的ECM消化的解决方案。20
注意：一般来说，此ECM摘要将包括被使用的最终水凝胶生物油墨体积的40％。的ECM的消化溶液数百毫升可以制备，等分，并在-80℃下以供将来使用冷冻。 - 到水凝胶制剂，溶解光引发剂，2-羟基-4'前 - 在0.1％的（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮，水重量/体积。
注意：卷在50-100毫升范围可提前制备，并在4℃避光保存屏蔽几个月。 - 为了形成水凝胶bioinks，首先溶解在水中，光引发剂溶液的透明质酸（HA）的水凝胶的试剂盒的基材组件。
- 分别溶解巯基HA和硫醇盐明胶在水净化hotoinitiator溶液（步骤1.2），以使2％w / v的溶液。
- 溶解聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），在水凝胶的试剂盒的交联剂，在水 - 光引发剂溶液（步骤1.2），以使8％w / v的溶液。
- 在水 - 光引发剂溶液（步骤1.2）溶解聚乙二醇（PEG）8-臂炔（10 kDa的MW），以使8％w / v的溶液。
- 在一般情况下，形成使用下面的方案水凝胶，虽然附加的定制是可能的。
- 结合4份2％的硫醇化的HA，4份2％的硫醇化明胶，1份交联剂1，1份交联剂2与8份组织的ECM溶液和2份肝细胞培养基（HCM）（或10份水作为一种通用的非组织特异性水凝胶）。
注：其他未修饰的HA或明胶可以被添加以使生物油墨挤出更加顺畅。这在下面描述。
- 结合4份2％的硫醇化的HA，4份2％的硫醇化明胶，1份交联剂1，1份交联剂2与8份组织的ECM溶液和2份肝细胞培养基（HCM）（或10份水作为一种通用的非组织特异性水凝胶）。
- VORTEX高所得的混合物（速度10满分10分），持续10秒前混合使用。</ LI>
- 水凝胶生物油墨使用
- 用于挤出或生物印刷测试，将混合物转移到一个注射器或打印盒，并允许它在37℃下自发交联30分钟（第一阶段交联）。
- 为流变学测量的混合物转移到35毫米的培养皿中，并允许其交联30分钟。
注：混合物立即开始通过硫醇 - 丙烯酸酯键形成交联，并将开始粘度提高。该混合物应转移到注射器，墨盒或目标位置在10分钟内，以避免传输期间吸液管或注射器的堵塞。 - 当二次交联（阶段2）是理想的，照射第1阶段的交联凝胶用紫外光（365纳米，18瓦/厘米2）以引发硫醇炔聚合反应。
注意：照射时间是依赖于材料的表面积。在一般情况下，材料的一个平方厘米只要求1-2秒在这个UV功率的紫外线照射。
2.打印机兼容性测试
- 之前与生物印刷设备，测试挤出特性使用标准的注射器和小规格针头（20-30表压）简单挤压试验的实验台上集成测试。
- 通过标准注射器推生物油墨实现与很少或没有颠簸水凝胶的顺利挤出长丝。线条或图案简单的挤压足以确定成功。
- 对于生物印刷器集成，通过吹打他们入打印机的墨盒装载生物油墨制剂，并允许在生物油墨30分钟到暗盒内自发阶段1的交联。
注：生物油墨的体积取决于具体的应用和应该由用户来确定。打印机墨盒可能类似于或者是注射器是与生物印刷设备兼容。 - 评估挤压兼容性通过印刷使用生物油墨简单的生物印刷图案。例如，打印由平行线7×7毫米形状。施加压力（ 例如，20千帕的气压），而在约300mm /分钟的速度在XY平面中的打印头移动。
注意：各种尺寸的打印头喷嘴的直径都可以使用，但具有400-500微米直径的开口的锥形喷嘴是最佳的在250-350微米范围内打印的球体。- 如果被挤出的材料是块状或不规则，见步骤2.4，或者降低PEGDA的量以软化阶段1交联材料。准备妥当生物油墨配方中挤出顺利，允许期望的图案或结构的精确沉积。
注：生物印刷步骤中所述使用在内部设计的专门用于组织构造打印的定制的3-D生物印刷装置32这样，特定的打印参数而变化显着地为每种类型的设备和需要TESTIN。由用户克
- 如果被挤出的材料是块状或不规则，见步骤2.4，或者降低PEGDA的量以软化阶段1交联材料。准备妥当生物油墨配方中挤出顺利，允许期望的图案或结构的精确沉积。
- 以提高挤出性能，补充未修饰的HA和明胶的bioinks（1.5毫克/毫升和30毫克/毫升，分别）。
3.验证生物印刷由原发性肝癌构造
- 通过悬滴法作为细胞成分33 准备的3-D原代细胞肝癌球体
注：生物印刷可以在不球体悬浮在水凝胶bioinks以及单个细胞中进行，而是。球状体在这里用来加速细胞 - 细胞相互作用和构造的功能。采用球状体或细胞的数量取决于特定的应用和应该由用户来确定。这些步骤应在无菌条件下使用无菌用品中进行。- 通过将HCM补充组分试剂盒的解冻内容到肝细胞基础培养基（HBM）和无菌过滤制备的HCM。
- 解冻的补充成分未直到液体。
- 添加补充部件（抗坏血酸，0.5毫升，牛血清白蛋白[无脂肪酸]，将10毫升;硫酸庆大霉素/两性霉素B，0.5毫升，氢化可的松21-半琥珀酸酯，0.5毫升，胰岛素，0.5毫升，人重组表皮生长因子，0.5毫升，转移，0.5毫升）以500毫升的HBM。
- 通过使用的瓶顶过滤器单元或一个注射器尖端过滤0.45微米或0.22微米的过滤器无菌过滤。
- 通过后的各细胞类型已根据制造商的说明被解冻上血球计数确定原代人肝细胞，库普弗细胞，星形细胞的细胞密度。
- 结合原代人肝细胞，库普弗细胞，星形细胞在HCM中媒体的80:10:10的比例由细胞数目已经加热到37℃的锥形管中。
注意：要使用的介质的体积取决于整个细胞数量特定于应用程序，并应通过第被确定E用户。 - 离心细胞悬浮液5分钟，在520 xg离心20℃。
- 吸出上清液，留下细胞团块的后面。
- 重悬在HCM媒体细胞沉淀，得到含有每40微升媒体1000细胞的细胞悬浮液。对正在生产的球状体的数量总成交量依赖。
- 细胞悬液转移到96孔格式悬滴板。总共约1,000个细胞添加到每个孔中HCM和在37℃下保持，在5％CO 2 3天期间，多细胞球状体形成。
- 收集使用移液器从悬滴板肝球体。转移到无菌的15毫升锥形管中。
- 通过将HCM补充组分试剂盒的解冻内容到肝细胞基础培养基（HBM）和无菌过滤制备的HCM。
- 在肝特异性的水凝胶生物油墨的BioPrint肝球状体
- 如步骤1中描述的，采用8％PEGDA和8％8臂PEG炔作为交联剂制备肝脏含有ECM的水凝胶生物油墨的制剂。使用该组合其在地区环境部门一道能力lting密切剪切弹性模量，以原生肝组织水凝胶。
- 让球体沉降到它们被放置在步骤3.1.7的锥形管的底部。这种变化的基础上球体的大小和密度，但一般1-2分钟内发生。通过仔细地吸或用移液器取出所有介质。
- 转移新鲜制备的水凝胶生物油墨溶液的所需体积含有该球状体的锥形管中。通常，一个合适的体积为10％，比3-D构建体的体积要打印更大-25％。仔细吸取上下悬浮球体在水凝胶生物油墨溶液。传送到使用移液器或血清吸管一个生物印刷盒。
- 的生物印刷器盒内部，使溶液经受第一次交联阶段（硫醇 - 丙烯酸酯反应）30分钟。
注意：根据球体大小，盒可能需要缓慢地旋转或内容可能需要与混合无菌刮刀，以保持整个生物油墨分布在球体的第一阶段交联时。这是少悬浮细胞，而不是球体准备bioinks的必需品。
注：按照第1阶段的交联，用户有几个小时的操作窗口。然而，建议快速执行生物印刷过程中提高细胞生存力。 - 继第一阶段的交联，使用设备生物印刷来创建一个包含原发性肝癌球体（或其他细胞）所需的水凝胶结构。
注意：此技术提供了一种系统，用于biofabricating各种各样的结构。参数，如总体积，细胞或球状体，印刷结构几何的数量，以及基板，其上印刷的结构是高度依赖于用户的目标。 - 沉积成所需配置后，辖紫外光2-4秒以引发二次交联机理，稳定的共nstructs和增加刚度至期望的水平。
注：PEG-炔的浓度，并且因此整体最终的交联密度，主要控制最终的构建刚度。 - 重复步骤3.2.4和3.2.5以便创建多层构建体。
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Representative Results
当上述过程被正确执行，水凝胶应包含特异于靶组织类型的生物化学信息，20允许对生物印刷和最终弹性模量，34的高度控制和支持存活功能性细胞中的组织构建。
水凝胶定制
到最 好的模拟天然肝，水凝胶生物油墨是由肝脏ECM解决方案和生长因子阵列补充 20 ECM解决方案包含多种生长因子和细胞因子（以pg / ml时， 图1A示出）。这些包括脑源性神经营养因子（BDNF）和bFGF，骨形态发生蛋白5（BMP-5），FGF-4，胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2），TGF-B1，BMP-7，EGF ，FGF-7，生长激素（GH），肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF），肝细胞生长因子和neurotrophin -3（NT-3）。此外，ECM解决方案包含其他结构部件，其通过比色测 定法进行分析。20对于肝ECM解决方案，肝脏ECM解决方案总胶原含量为91.33±0.58毫克/毫升，弹性蛋白含量为189.33±48.40毫克/毫升，并且糖胺聚糖（GAG）含量为86.00±53.45毫克/毫升（ 图1B）。
水凝胶生物油墨的机械性能可以利用剪切应力扫描试验（0.6-10帕，振荡频率1赫兹）的流变仪。10,12,13,34被表征通过允许自发阶段1硫醇丙烯酸酯化学来在中性pH发生，与113.66±22.59 Pa的G'软质水凝胶形成。通过UV光聚合阶段2硫醇炔交联开始后，G'增加至约10千帕（10,637±113.83帕，Figu重新1C），模拟肝组织的弹性。的浓度，分子量，和交联剂的几何形状的额外的操作可实现大范围的第2阶段G'的值。34
bioprinted水凝胶的质量
化学策略和实施水凝bioinks的阶段1和阶段2的交联的在图2中进行说明。通常，交联剂如Extralink，其基于丙烯酸酯化PEG聚合物，自发地与在HA上硫醇基和明胶链在中性反应pH值（阶段1）在细胞的存在下，以形成软挤出水凝胶。这种软质水凝胶可以bioprinted作为生物油墨，之后，UV光用于启动基于炔改性的PEG聚合物的未反应的硫醇和第二交联剂的光聚合。交联剂的特定的分子量和几何去韦恩的bioprinted构造末尾刚度。 7×7毫米形状区域是为测试目的（ 图3A）来实现。初步测试表明，初始的配方是可挤出的，但在和挤出（ 图3B）后出现不规则和结块。以提高挤出性能，未修饰的HA和明胶中补充到bioinks（1.5毫克/毫升和30毫克/毫升）。改进的光滑印刷结构示于图3C。
活力和bioprinted初级人类肝脏结构的基本功能
使用的3-D生物印刷器的生物活性肝特异性的水凝胶生物油墨被用于封装并沉积原代人肝球体，先前由悬滴培养物，在塑料盖玻片制备。正在打印允许强大的处理和传输各种细胞培养环境的塑料盖玻片。经过生物印刷，喜活/死活力/细胞毒性染色和共聚焦显微镜（ 图4A）之后，没有观察到肝构建GH细胞生存力。在最佳的环境条件下生存力应该是85％以上。原代人肝细胞通常被认为机械和化学应力，这需要环境变量的一些优化敏感。
下列生物印刷和生存能力的验证后，被放置在培养额外肝构建体可以通过分析在第3天，第7天，第10天，第14天为分泌尿素和白蛋白的分析去除培养基等分试样进行评估功能。尿素比色法揭示尿素分泌从肝脏构建体在14天的时间过程相对一致的水平，15和20纳克/毫升（ 图4B）之间残留。检测尿素水平没有彼此显著不同在不同的时间点。人类白蛋白ELISA分析表明，从该构建体白蛋白生产也随时间保持相对一致，125和140纳克/毫升（ 图4C）之间保持稳定。此外，染色指示肝组织，细胞内白蛋白阳性表达，CYP3A4（涉及对新陈代谢的细胞色素P450同种型），E-钙粘蛋白（上皮细胞 - 细胞粘附蛋白），和二肽基标记物时肽酶-4（蛋白质表达高度在肝）中观察到（ 图4D-F）。两者合计，此生存力和功能数据表明，组织特异性的水凝胶生物油墨助剂在保持活力和bioprinted初级基于细胞的肝构建体的功能。
图1. 水凝胶成分鉴定和刚度评估。 A）生长因子和从肝脏。B制备ECM解决方案）的胶原蛋白，粘多糖的比色测 定量化，并在肝脏ECM解决方案弹性含量细胞因子分析蛋白质组学阵列。C）来控制生物油墨刚度能力的示范。阶段1的交联后，将凝胶相对较软，并且能够顺利地挤出。后通过UV光，通过弹性模量的增加超过一个数量级，模仿肝组织的弹性模量2阶段的交联。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.为用人生物印刷挤压和控制多个基于PEG的交联剂在组织构造的力学性能：S包括基于丙烯酸酯交联剂（交联剂1），根据炔交联剂（交联剂2）打印bioinks制定的战略研究，巯基HA，巯基化明胶，组织ECM材料，且未经修改的HA和明胶。该生物油墨配方制备并通过硫醇 - 丙烯酸酯自发交联结合，产生了柔软的，可挤出材料。生物印刷被执行。最后，bioprinted层熔合的，稳定的，并带来对肝脏弹性模量。这个过程可以重复生成多层结构。 请点击此处查看该图的放大版本。
A）bioinks 图 3. 测试生物印刷用于生物油墨挤压测试7×7毫米绕组模式ING在生物印刷器。B）一种PEGDA和8臂PEG炔生物油墨的初始制剂导致不规则沉积。C）的添加原料HA和明胶改进挤压，导致生物油墨的平滑挤出。比例尺- 为1mm ，请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 活力和在肝特异性水凝胶生物油墨A）的肝脏生物油墨为生物印刷的执行bioprinted肝球状体的功能的示范 ，导致高生存能力构建体。绿色 - 钙黄绿素AM染色的活细胞;红色-乙锭同型二聚体染色死细胞B）尿素和C），白蛋白肝脏结构超过14天的分泌。AYS在文化，用比色法和酶联免疫吸附试验，分别量化。误差线表示标准偏差。 D）CYP3A4，E）细胞内白蛋白和F）DPP4和E-cadherin：与肝组织相关标志物免疫染色。绿色或红色 - 表示污点;蓝- DAPI 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
有几个部件是当试图biofabricate三维组织构建，以便最终使用在人类或用于体外筛选应用考虑的关键。使用适当的细胞成分决定了端电位的功能，而生物制造装置本身确定的通用方法用于到达末端构建体。第三成分，该生物材料，是同样重要的，因为它提供双重角色。具体地，生物材料组件必须与两个生物制造硬件（ 即 ，bioprinters），并且还支持潜在脆弱生物细胞组分相容。优化这两个要求是很困难的，因为bioprintable材料需要满足几个关键参数：1）具有相应的化学，机械，和时间特性以利于有效和未支配印刷; 2）在准备阶段，bioprin支持细胞活力婷程序; 3），并提供最能增强细胞活力及以下生物印刷最终组织构建功能的好客的环境。我们采用在这里所描述满足这些要求的方法所描述的模块化的水凝胶生物油墨系统。首先，通过将生长因子，胶原，聚糖，和来自特定组织类型的ECM来源弹性蛋白，就可以实现一种生化信息是令人联想到靶组织类型的。第二，通过采用2相似，但独立的交联反应，我们能够实现软挤出材料，其是与大多数挤压型，它可与所述第二交联步骤可以进一步改变，以达到符合目标的确定的材料的弹性模量兼容选择的组织。34
这个系统，使得它非常有用的关键特征是支持，可以被利用来操纵多种聚合物：化学反应的能力化动力学和生物油墨系统的机械性能。通过采用2个独立的反应类型，硫醇 - 丙烯酸酯和硫醇炔，我们实现的能力以执行一个阶段1硫醇 - 丙烯酸酯反应，其导致可以通过注射器或生物印刷装置中挤出的软质材料，和一个第2阶段硫醇-alkyne反应，这是在光引发剂，它决定了最终bioprinted构建体的弹性模量的存在下在UV曝光仅启动。这些多步骤导致bioprintable材料。因此，为了实现一个支持挤压和随后的弹性模量的定制，维持这些分开的反应类型稳定生物油墨是很重要的。
主拉伸到使用该系统为生物制造是其定制容易，这是通过任一操纵通过次级交联剂末端弹性模量，或者通过包含不同的组织来源的ECM材料的做或生长因子鸡尾酒。在组织中的细胞外基质含有多种生长因子和其它细胞因子，这往往在组织类型之间的整体分布发生变化。我们认为，这些因素是用于保持某些细胞类型，如原代人肝细胞的功能为一体。这个概念的实施以前证明增加活力和在肝素化透明质酸三明治培养原代人肝细胞的功能。20通过肝素链中具有肝素结合生长因子的水凝胶，以及来自肝脏的ECM其它ECM成分相结合，我们能够呈现这个肝脏特异性生化信息到原代人肝细胞，保持在体外存活力和功能，用于在延长的时间周期。这种方法可以很容易地扩展到其它类型的组织，允许研究人员通过脱细胞和增溶剂等组织来实现这些组织特异性因子的重演。
帐篷“>用户应该知道，虽然这种生物油墨系统的基础组件已生物印刷中得到落实之前，10,12,17但不太细致入微，组织具体的办法，以及其他各种再生医学应用，35- 45生物制造尚未尝试对于所有的组织类型，因此，有可能是为了创建这样的附加 组织构建需要一些进一步发展和故障排除。然而，模块化系统如这里描述很可能是适应的。其他潜在限制包括某些类型的细胞可以具有朝向特定生物材料的天然亲和力。一般地，我们已经发现，这水凝胶系统支持的透明质酸，明胶，和聚乙二醇为基础的基本组件的多种细胞类型的活培养，但有可能是一些类型的执行中不同的组合物的工程化的环境中，如胶原蛋白，它具有固有的纤维呐更好的细胞TURE，或弹性，这在本质上是更有弹性。因此，考虑对于给定的组织类型和最终应用的最佳材料是重要的，并且在这里所描述的水凝胶生物油墨系统可能不足以为所有用途。另外，考虑根据其中进行生物印刷的环境条件是很重要的。在这个协议的发展，我们从接近环境温度（室温）使用bioinks没有任何细胞培养基，导致生存条件差转变，如果准备和打印时间是在37℃下使用bioinks太拉出来，更快速的协议与媒体组成部分，它大大增加细胞活力。直到最近，一些材料或材料系统是专门开发的生物印刷用系统接口。其结果是，大部分的材料是简单的，利用任一其生物学特性，以支持细胞，或者，它们与生物制造兼容性硬件。少的材料是在两个领域最佳。本方法中所描述的系统解耦这些特性，从而允许生物表征定制，同时促进必需的挤压生物印刷机械性能。此水凝胶生物油墨系统的一个附加的区别在于，它可以模仿它用于biofabricating靶组织的生物化学和物理参数。这支持的灵活性一个令人印象深刻的水平，从而使几乎所有的组织的生化因子的概括，以及配套的任何软组织的弹性模量。于组织的这两个方面的关注很少被探讨串联。
这种技术的模块化性质，得到了广泛的应用，以实现一个灵活性。以模仿各种组织类型的能力提供的能力biofabricate在这项工作中使用，例如，不只是肝构建体，但CON结构代表许多在体内的其它组织。可能使用这些参数的最明显的广泛的应用是两个方面匹配到特定的组织，以优化工程化构建体的端部功能，对于实际应用，如注入或药物和毒理学筛选的能力。虽然一代人大小为患者植入组织是许多研究人员的最终目标，由于监管方面的障碍，细胞的采购，以及制造功能性血管进入组织工程器官的能力的限制，这一崇高目标将需要进一步的发展和时间到实现。然而，技术，如这里所描述的方法是目前开始用于产生“组织体”为在体外平台上实现。我们的团队，以及其他人，目前正在利用生物制造类器官创造一种执行毒理学研究模型系统。另外，这种组织体可被用来研究的病理学并且疾病进展，如癌症，46和测试潜在的治疗性治疗。最后，此系统也支持另一个重要的用途。通过独立地处理这些参数，研究人员可以执行基本科学实验来确定的生化与机械因素的相对重要性。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者非常感谢由空间和海战系统中心太平洋（SSC PACIFIC）的合同号N6601-13-C-2027下的国防威胁降低局（DTRA）的资金。这种材料的出版并不构成此结果或结论的政府批准。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
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