Summary
Vi beskriver et sett med protokoller som til sammen gir en vev-mimicking hydrogel bioink som funksjonelle og levedyktige 3-D vev konstruksjoner kan bioprinted for bruk i in vitro screening-programmer.
Introduction
De siste årene har en rekke teknologier blir tilgjengelige som løser behovet for alternative kilder til funksjonelle organer og vev ved å søke å produsere, eller biofabricate, dem. Bioprinting har dukket opp som en av de mest lovende av disse teknologiene. Bioprinting kan betraktes som en form for robot additiv fremstilling av biologiske deler, som kan brukes til å bygge eller mønster levedyktig organ lignende eller vev-lignende strukturer i 3 dimensjoner. 1. I de fleste tilfeller bioprinting anvender en tre-dimensjonal (3- D) utskriftsenheten som er regissert av en datamaskin for å sette inn celler og biomaterialer inn nøyaktige posisjoner, og dermed rekapitulere anatomisk ligne fysiologiske arkitekturer. 2 Disse enhetene skrive ut en "bioink", som kan ta form av celleaggregater, celler innkapslet i hydrogeler eller viskøse væsker, eller celle foret mikrobærerne, samt cellefrie polymerer som gir mekanisk struktur, eller fungere som cellefritt placeholders. 3,4 Etter den bioprinting prosessen, kan den resulterende struktur være modnet til funksjonelt vev eller organ strukturer, og som brukes for dens tiltenkte anvendelse ende. 5,6 Hittil en fullstendig fullt funksjonell human størrelse organ ikke har blitt trykt, men det er fortsatt den primære langsiktige mål om bioprinting forskning og utvikling. 2 men småskala "organoid" tissue konstruksjoner blir nå implementert i en rekke programmer, inkludert patologi modellering, narkotika utvikling, og toksikologi screening.
En av de viktigste hindrene som forskere har møtt i bruk bioprinting teknologien er at svært få materialer har blitt utviklet for eksplisitt formål bioprinting. For effektivt å lykkes i bioprinting, må en biomateriale møte 4 grunnleggende krav. Biomaterialet må ha 1) de nødvendige mekaniske egenskaper for å tillate avsetning (det være seg ekstrudering gjennom en dyse som en gel eller en jegnkjet som en dråpe), 2) evnen til å holde sin form som en komponent av en 3-D struktur etter avsetning, 3) mulighet for brukerkontroll av de 2 tidligere egenskaper, og 4) en celle vennlig og støttende miljø i det hele tatt faser av bioprinting prosedyren. 7 Historisk bioprinting arbeid har ofte forsøkt å ansette eksisterende tradisjonelle biomaterialer i bioprinting enheter uten hensyn til deres kompatibilitet, i stedet for å designe et biomateriale å ha de egenskapene som er nødvendige for bioprinting og påfølgende post-utskrift applikasjoner.
En rekke bioinks har nylig blitt utviklet for å bedre grenseflate mot avsetning og fabrikasjon maskinvare. Standard hydrogel systemer utgjøre betydelige problemer fordi de vanligvis eksistere som enten forløper væskeløsninger med utilstrekkelige mekaniske egenskaper, eller polymeriserte hydrogeler at hvis trykket kan tette dyser eller blir brutt opp ved ekstruderingsprosessen. Vårt team, samt others, utforsket ulike hydrogel formuleringer for å løse disse bioprinting problemer, inkludert celle spheroid utskrift inn hydrogel underlag, 5,8 celle og hydrogel filament ekstrudering fra microcapillary rør, 9-11 ekstruderbare hyaluronsyre (HA) -Gold nanopartikkel hydrogeler med dynamiske kryssbindende egenskaper 12 temporal kontroll av hydrogel stivhet ved hjelp fotopolymeriserbar methacrylated HA og gelatin, 13 fibrinogen-trombin-basert kryssbinding, 14,15 ionisk utveksling alginat-kollagen gels, 16 og nylig hurtig polymerisering ultrafiolett lys (UV) -klargjort kryssbinding, 17
Disse eksempler viser muligheten for å generere materialer som kan ved bioprinted effektivt. Men i tillegg til integrasjon med maskinvare, for å kunne generere levedyktige funksjonelle og 3-D vev konstruksjonene, må biomaterialer inneholde biokjemiske og mekaniske signaler som kan benyttes til å opprettholde cellulærlevedyktighet og funksjon. Disse ekstra faktorer, biokjemiske og mekaniske profiler, kan ha en betydelig innflytelse på den vellykkede funksjon bioprinted vev konstruksjoner.
Både celler og det native ekstracellulære matriks (ECM) er ansvaret for å levere et bredt spekter av signalmolekyler, slik som vekstfaktorer og andre cytokiner til andre celler. Kombinasjonen av disse signalene varierer fra vev til vev, men kan være svært potente og innflytelsesrik ved regulering av celle og vev oppførsel. 18 ansette vevsspesifikke ECM-komponenter fra forskjellige organer og implementering som en hydrogel eller som del av en hydrogel er blitt utforsket med suksess. 19-21 Denne tilnærmingen, som består av decellularizing et gitt vev, pulverisere den, og den ble oppløst, kan anvendes for å fremstille vevs-spesifikke biokjemiske signaler fra en hvilken som helst vev og kan inkorporeres i en 3-D-hydrogel konstruksjoner. 22
I tilleggDet er allment dokumentert at vev i kroppen oppta et bredt spekter av stivheter. 23 Som eksempel, evnen til å stille inn de mekaniske egenskapene til biomaterialer, såsom elastisitetsmodul E 'eller skjærelastisitetsmodul G', er et nyttig redskap for å vevsteknologi . Som beskrevet ovenfor, kontroll over bioink mekaniske egenskaper gjør det mulig for ekstrudering basert biofabrication ved hjelp av en myk gel, som deretter kan ytterligere manipuleres ved sekundær tverrbinding på et senere tidspunkt, ved hvilket elastisitetsmodul nivåer kan oppnås som samsvarer med den for målorganet type. For eksempel kan biomaterialer være tilpasset for å samsvare med en stivhet på 5-10 kPa som en innfødt lever, 23 eller samsvarer med en stivhet på 10-15 kPa som opprinnelig hjertevev, 24,25 teoretisk øke evnen til disse organoids til å fungere i en lignende måte som i sine opprinnelige vev motstykker. Påvirkningen av miljø stivhet på celle-fenotype har vært explored i de senere år, særlig med hensyn på stamceller. Engler et al., Demonstrerte at substratet elastisitet hjulpet i å drive stamceller (MSC) langs linjer med vev elastisitet som er tilpasset underlaget. 25 Dette konseptet har blitt ytterligere undersøkt for differensiering i muskel, hjertefunksjon, lever fenotype, hematopoetisk stamcelleproliferasjon og vedlikehold av stamcelle terapeutisk potensiale. 24,26-29 å være i stand til å stille en hydrogel til forskjellige elastisitetsmoduler er et viktig trekk ved et biomateriale som vil bli brukt til å biofabricate vev konstruksjoner. 30
Her beskriver vi en protokoll som representerer en allsidig fremgangsmåte som kan benyttes i vårt laboratorium for å formulere en hydrogel system som kan ekstrudering bioprinted, og tilpasset til 1) inneholde den biokjemiske profil av en spesiell vevstype og 2) etterligne den elastisitetsmodul som vevstypen . Ved å ta opp disse kravene, har vi som mål å pROVIDE et materiale som kan repetere de fysiokjemiske og biologiske egenskaper in vivo vev. 31 Det modulære hydrogel sammensatt system som er beskrevet her utnytter en multitverrbinding tilnærming til dannelse av ekstruderbare bioinks, og gjør det mulig for en sekundær kryssbinding for å stabilisere og øker stivheten av end produkter for å matche en rekke vevstyper. Biokjemisk tilpasning er oppfylt ved hjelp vevsspesifikke ECM-komponenter. Som en demonstrasjon, ansetter vi en leverspesifikk variant av denne hydrogel systemet til bioprint funksjonelle lever organoid konstruksjoner. Protokollen er beskrevet bruker et egendefinert 3-D bioprinting enhet. Generelt kan denne protokollen tilpasses de fleste profilbaserte skrivere, spesifikke utskriftsparametere variere dramatisk for hver type enhet og krever testing av brukeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel Bioink Formuleringer og klargjøring
- For å tilveiebringe vevs-spesifikke biokjemiske profiler, forberede vevsspesifikt ECM fordøye løsninger som tidligere beskrevet for leveren. 20
Merk: Generelt vil dette ECM digest utgjør 40% av den endelige hydrogel bioink volum som er ansatt. Flere hundre ml av ECM-sammendrag oppløsning kan fremstilles, alikvotert og frosset ved -80 ° C for fremtidig bruk. - Før hydrogelformulering, oppløse en fotoinitiator, 2-hydroksy-4 '- (2-hydroksyetoksy) -2-metylpropiofenon, i vann ved 0,1% vekt / volum.
Merk: Volumene i 50-100 ml serien kan være forberedt på forhånd og oppbevares skjermet mot lys ved 4 ° C i flere måneder. - For å danne hydrogel bioinks, først oppløse grunnmaterialet komponenter fra hyaluronsyre (HA) hydrogel sett i vannet fotoinitiator-oppløsning.
- Oppløse tiolert HA og tiolert gelatin hver for seg i vann-photoinitiator oppløsning (trinn 1.2) for å lage 2% vekt / volum oppløsninger.
- Oppløs polyetylenglykol diakrylat (PEGDA), tverrbindingsmidlet i hydrogelen kits, i vann-fotoinitiator-oppløsning (trinn 1.2) for å lage en 8% vekt / volum løsning.
- Oppløs polyetylenglykol (PEG) 8-arm alkynet (10 kDa molekylvekt) i vann-fotoinitiator-oppløsning (trinn 1.2) for å lage en 8% vekt / volum løsning.
- Vanligvis danner hydrogeler ved hjelp av følgende skjema, selv om ytterligere tilpasning er mulig.
- Kombiner 4 deler 2% tiolert HA, 4 deler 2% tiolert gelatin, en del kryssbinder en, en del kryssbinder to med 8 deler vev ECM-løsning og 2 deler hepatocytter dyrkningsmedier (HCM) (eller 10 deler vann som en generisk ikke-vev -spesifikk hydrogel).
Merk: Ytterligere umodifisert HA eller gelatin kan legges for å gjøre bioink Extrude mer jevnt. Dette er beskrevet nedenfor.
- Kombiner 4 deler 2% tiolert HA, 4 deler 2% tiolert gelatin, en del kryssbinder en, en del kryssbinder to med 8 deler vev ECM-løsning og 2 deler hepatocytter dyrkningsmedier (HCM) (eller 10 deler vann som en generisk ikke-vev -spesifikk hydrogel).
- Vortex den resulterende blanding på høy (hastighet 10 av 10) i 10 sekunder for å blande før bruk. </ Li>
- Bruk av hydrogel bioink
- For ekstrudering eller bioprinting testing, overføre blandingen i en sprøyte eller skriverkassetten og la den crosslink spontant i 30 min (trinn 1 tverrbinding) ved 37 ° C.
- For reologiske målinger, overføre blandingen til en 35 mm petriskål og tillate det å tverrbinde i 30 min.
Merk: Blandingen begynner straks å tverrbinde via tiol-akrylat bindingsdannelse og vil begynne å øke i viskositet. Blandingen skal overføres til en sprøyte, tonerkassett, eller target plassering innen 10 minutter for å unngå tilstopping av en pipette eller sprøyte under overføring. - Når sekundær tverrbinding (trinn 2) er ønsket, bestråle trinn 1-tverrbundne geler med ultrafiolett lys (365 nm, 18 W / cm 2) for å initiere en tiol-alkynet polymerisasjonsreaksjonen.
Merk: Varighet av bestråling er avhengig av overflatearealet til materialet. Generelt vil en kvadratcentimeter av materialet krever bare 1-2 sek av UV-eksponering på UV makt.
2. Skriver Kompatibilitet Testing
- Før integrasjonstesting med bioprinting enheter, test press egenskaper på laboratoriebenken med enkle profiltester ved hjelp av standard sprøyter og tynn kanyle tips (20-30 gauge).
- Skyv bioink gjennom en standard sprøyte for å oppnå jevnt ekstruderte filamenter av hydrogel med få eller ingen støt. Ekstrudering av linjer eller enkle mønstre er tilstrekkelig til å fastslå suksess.
- For bioprinter integrasjon, laste bioink forberedelser ved å pipettere dem inn blekkpatroner, og la 30 min for bioink å gjennomgå spontan scenen en kryssbinding i patronen.
Merk: Volum av bioink avhenger av den spesifikke applikasjonen og bør bestemmes av brukeren. Blekkpatroner kan ligne på eller være sprøyter som er kompatible med bioprinter enheten. - Evaluere ekstrudering kompatibilitetfor bioprinting ved å skrive ut et enkelt mønster ved hjelp av bioink. For eksempel skrive ut en 7 x 7 mm mønster består av parallelle linjer. Påføre trykk (for eksempel 20 kPa pneumatisk trykk), mens skrivehodet beveger seg i XY-planet ved en hastighet på omtrent 300 mm / min.
Merk: Skrivehode dysediameter av forskjellige størrelser kan anvendes, men koniske dyser med 400-500 um diameteråpninger er optimale for utskrift av sfæroider i 250-350 nm område.- Hvis de ekstruderte materialer er klumpet eller uregelmessig, se trinn 2.4, eller redusere mengden av PEGDA å myke scenen en kryssbundet materiale. Skikkelig forberedt bioink formuleringer ekstrudere jevnt, slik at nøyaktig deponering i ønskede mønstre eller arkitektur.
Merk: bioprinting prosedyrer beskrevet bruk en tilpasset 3-D bioprinting enhet konstruert i huset spesielt for vev konstruere utskrift 32 Som sådan, spesifikke utskriftsparametere variere dramatisk for hver type enhet og krever testin.g av brukeren.
- Hvis de ekstruderte materialer er klumpet eller uregelmessig, se trinn 2.4, eller redusere mengden av PEGDA å myke scenen en kryssbundet materiale. Skikkelig forberedt bioink formuleringer ekstrudere jevnt, slik at nøyaktig deponering i ønskede mønstre eller arkitektur.
- For å forbedre ekstruderingsegenskapene, supplere umodifisert HA og gelatin til bioinks (1,5 mg / ml og 30 mg / ml, henholdsvis).
3. Validering av Bioprinting med primær lever konstruerer
- Forbered 3-D primær celle lever kuler ved henging slipp metoder som cellekomponenten 33
Merk: Bioprinting kan utføres uten sfæroider, men i stedet med individuelle celler suspendert i hydrogelen bioinks også. Spheroids er ansatt her for å akselerere celle-celle interaksjoner og konstruere funksjonalitet. Antall kuler eller celler som anvendes er avhengig av den spesifikke anvendelsen, og bør bestemmes av brukeren. Disse trinnene bør utføres under sterile forhold, ved hjelp av sterile forsyninger.- Forbered HCM ved å legge de tinte innholdet i HCM supplement komponent kit til hepatocytter basal media (HBM) og steril filtrering.
- Tine supplement komponenter until væske.
- Tilsett supplement komponenter (askorbinsyre, 0,5 ml; bovint serumalbumin [fettsyrefri], 10 ml, gentamicin sulfat / amfotericin B, 0,5 ml; hydrokortison 21-hemisuksinat, 0,5 ml, insulin, 0,5 ml, human rekombinant epidermal vekstfaktor , 0,5 ml, overføring, 0,5 ml) til 500 ml HBM.
- Sterilt filter gjennom et 0,45 um eller 0,22 um filter ved hjelp av en flasketoppfilter-enhet eller en sprøytespiss filter.
- Bestem celletetthet av primære humane hepatocytter, Kupffer celler og stel celler ved å telle på en hemocytometer etter hver celletype som har tint, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kombiner primære humane hepatocytter, Kupffer celler og stel celler i en 80:10:10 andel av celletallet i HCM media som har blitt varmet opp til 37 ° C i et konisk rør.
Merk: Volumet av media som skal brukes, avhenger av det totale celle nummer spesifikke for programmet og bør bestemmes av the-bruker. - Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 520 x g ved 20 ° C.
- Aspirer supernatanten, etterlater cellepelleten.
- Resuspender cellepelleten i HCM media under dannelse av en cellesuspensjon inneholdende 1000 celler per 40 mikroliter medium. Totalvolumet er avhengig av antallet av kuler som fremstilles.
- Overfør cellesuspensjonen til 96-brønners format hengende dråpe platene. Legg til en total på omtrent 1000 celler til hver brønn i HCM og vedlikeholde ved 37 ° C i 5% CO2 i 3 dager i løpet av hvilken flercellede sfæroider danner.
- Samle lever kuler fra hengende dråpe plate ved hjelp av en pipette. Overføring til et sterilt 15 ml konisk tube.
- Forbered HCM ved å legge de tinte innholdet i HCM supplement komponent kit til hepatocytter basal media (HBM) og steril filtrering.
- Bioprint lever kuler i leveren spesifikke hydrogel bioink
- Fremstille en formulering av lever ECM-holdig hydrogel bioink som beskrevet i trinn 1, ved anvendelse av 8% PEGDA og 8% 8-arm PEG alkynet som tverrbindere. Bruk denne kombinasjonen for sin evne i resulting i en hydrogel tett i skjærelastisitetsmodul til mors levervev.
- La kulene sette seg på bunnen av det koniske rør hvori de ble plassert i trinn 3.1.7. Dette varierer ut spheroid størrelse og tetthet, men vanligvis skjer innen 1-2 min. Fjern alle medier ved forsiktig aspirere eller med en pipette.
- Overfør det ønskede volum av nylaget hydrogel bioink løsning på det koniske rør som inneholder sfæroidene. Generelt er en passende mengde 10% -25% større enn volumet av den 3-D-konstruksjon som skal skrives. Omhyggelig pipettere opp og ned for å resuspendere kulene i hydrogelen bioink løsning. Overføring til en bioprinter patron ved hjelp av en pipette eller serologisk pipette.
- Inne i bioprinter patronen, la oppløsningen til å gjennomgå den første tverrbindingstrinnet (tiol-akrylat-reaksjon) i 30 minutter.
Merk: Avhengig av spheroid størrelse, kan patronen må være sakte roteres eller innholdet kan trenge å bli blandet meden steril spatel for å holde kulene fordelt gjennom det bioink under trinnet en tverrbinding. Denne er mindre for en nødvendighet for bioinks fremstilt med suspenderte celler i stedet for kuler.
Merk: Etter scenen en kryssbinding, brukerne har en drifts vinduet i flere timer. Imidlertid er det anbefalt å utføre bioprinting prosessen raskt for å forbedre cellenes levedyktighet. - Etter trinn 1 kryssbinding, bruk en bioprinting enhet for å skape ønskede hydrogel strukturer som inneholder de primære lever kuler (eller andre celler).
Merk: Denne teknologien tilveiebringer et system for biofabricating en lang rekke konstruksjoner. Parametere som totalvolum, antall celler eller kuler, den trykte struktur geometri, og underlaget som konstruerer skrives er svært avhengig av målene for brukeren. - Etter avsetning til den ønskede konfigurasjon, administrere UV-lys i 2-4 sekunder for å initiere sekundære kryssbindingsmekanismen, stabiliserende konstructs og øke stivheten til ønsket nivå.
Merk: Konsentrasjonen av PEG-alkyn, og således den totale endelige tverrbindingstetthet, kontrollerer først og fremst den endelige konstruksjonen stivhet. - Gjenta trinn 3.2.4 og 3.2.5 for å skape lagdelte konstruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor blir fulgt riktig, bør hydrogeler inneholde en biokjemisk profil bestemt til målet vevstype, 20 muliggjør en høy grad av kontroll over bioprinting og endelig elastisitetsmodul, 34 og støtte levedyktige funksjonelle celler i vev konstruksjoner.
hydrogel Customization
For å best etterligner naturlig leveren, ble hydrogelen bioink supplert med lever ECM-løsninger og en vekstfaktor-array, 20 ECM-løsninger inneholde en lang rekke vekstfaktorer og cytokiner (vist i pg / ml, Figur 1A). Disse omfatter hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), bFGF, benmorfogent protein 5 (BMP-5), FGF-4, insulinlignende vekstfaktorbindende protein 2 (IGFBP-2), TGF-B1, BMP-7, EGF , FGF-7, veksthormon (GH), heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor (HB-EGF), HGF og neurotrophin 3 (NT-3). I tillegg ECM-løsninger inneholde ytterligere strukturelle komponenter, som er analysert ved hjelp av kolorimetriske assays. 20 For lever ECM-løsninger, total kollageninnhold på lever ECM-løsninger var 91,33 ± 0,58 mg / ml, elastin innholdet var 189,33 ± 48,40 mg / ml, og den glycosaminoglycan (GAG) innholdet var 86,00 ± 53,45 mg / ml (Figur 1b).
Hydrogel bioink mekaniske egenskaper kan karakteriseres ved hjelp av en skjærspenning feie test (0,6 til 10 Pa, oscilleringsfrekvens 1 Hz) på rheometer. 10,12,13,34 Ved å tillate spontan scenen en tiol-akrylat kjemi å skje på nøytral pH, en myk hydrogel med en G 'av 113,66 ± 22,59 Pa dannes. Etter oppstart av trinn 2 tiol-alkyn kryssbinding av UV fotopolymerisasjon, G 'øker til omtrent 10 kPa (10637 ± 113,83 Pa, Figure 1C), hermet levervev elastisitet. Ytterligere manipulering av konsentrasjonene, molekylvekter, og geometrier av tverrbindingsmidler kan oppnå en rekke av trinn to G-verdiene. 34
Kvaliteten på bioprinted hydrogel
Kjemisk strategi og gjennomføring av trinn 1 og trinn 2 tverrbinding av hydrogel bioinks er beskrevet i figur 2. Generelt er tverrbindingsmidler som for eksempel Extralink, som er basert på akrylerte PEG-polymerer, spontant reagere med tiolgrupper på HA og gelatin kjeder på nøytral pH (trinn 1) i nærvær av celler for å danne en myk hydrogel ekstruderbar. Denne myke hydrogel kan bioprinted som en bioink, hvoretter UV-lys anvendes for å initiere fotopolymerisasjon av uomsatte tioler og de sekundære tverrbindere basert på alkyn-modifisert PEG-polymerer. Den spesielle molekylvekter og geometrier av tverrbindere gåVern slutten stivhet i bioprinted konstruksjonen. En 7 x 7 mm mønster ble implementert for testformål (figur 3A). Innledende tester viste at de innledende formuleringer var ekstruderbar, men først på uregelmessig og clumped under og etter ekstrudering (figur 3B). For å forbedre ekstruderingsegenskapene, ble umodifisert HA og gelatin supplert til bioinks (1,5 mg / ml og 30 mg / ml). Den forbedrede glatte trykte struktur er vist i figur 3C.
Livskraftig og grunnleggende funksjon av bioprinted primære humane lever konstruksjoner
Bruk av 3-D bioprinter det bioaktive leverspesifikke hydrogel bioink ble brukt til å kapsle og sette primære humane lever kuler, tidligere utarbeidet ved henging slipp kulturer, på plastglassene. Blir trykket på plastdekkglass er tillatt for robust håndtering og overføring til et utvalg av cellekulturmiljøer. Etter bioprinting, high celle levedyktighet i leveren konstruksjonene ble observert etter LIVE / DEAD levedyktighet / cytotoksisitet farging og konfokalmikroskopi (figur 4A). Under optimale miljøforhold bør levedyktighet være over 85%. Primære humane hepatocytter anses generelt følsomme for mekaniske og kjemiske påkjenninger, som krevde noen optimalisering av miljøvariabler.
Etter bioprinting og bekreftelse av levedyktighet, kan flere leveren konstruksjoner som er plassert i kultur bli vurdert for funksjonalitet ved å analysere media aliquoter fjernet på dag 3, dag 7, dag 10 og dag 14 for analyse av utskilt urea og albumin. Urea kolorimetriske analyser viser et relativt konsistent nivå av urea sekresjon fra leveren konstruksjonene over hele 14-dagers tidsforløp, som gjenstår mellom 15 og 20 ng / ml (figur 4B). Oppdagede urea-nivåer var ikke signifikant forskjellige fra hverandre på ulike tidspunktpunkter. The Human albumin ELISA-analysen viser at albumin produksjonen fra de konstruerer også fortsatt relativt konsistent over tid, gjenværende stabilt mellom 125 og 140 ng / ml (Figur 4C). I tillegg, når farget for markører som indikerer levervev, positiv ekspresjon av intracellulær albumin, CYP3A4 (en cytokrom P450-isoformen som er involvert i metabolisme), E-cadherin (en epitelial celle-celle adhesjon protein), og dipeptidylpeptidase-4 (et protein uttrykt høyt i leveren) er observert (Figur 4D-F). Tatt sammen, dette levedyktighet og funksjonelle data tyder på at de vevsspesifikke hydrogel bioink hjelpemidler for å opprettholde levedyktighet og funksjon av bioprinted primære cellebasert lever konstruksjoner.
Figur 1. Hydrogel komponent karakterisering og stivhet vurdering. A) vekstfaktor ogcytokinanalyse av proteomikk arrays for ECM-løsninger fremstilt fra leveren. B) Colorimetric analyse kvantifisering av kollagen, glycosaminoglycan og elastin innhold i leveren ECM løsninger. C) Demonstrasjon av evnen til å kontrollere bioink stivhet. Når trinn en tverrbinding, er gelen relativt myk og i stand til å bli ekstrudert glatt. Når trinn 2 kryssbinding av UV-lys, elastisitetsmodul øker med mer enn en størrelsesorden, mimicking levervev elastisk modulus. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ansette flere PEG-baserte crosslinkers for ekstrudering bioprinting og kontroll over vev konstruere mekaniske egenskaper. Strategy av formuleringen av utskrivbare bioinks består av akrylat-baserte crosslinkers (tverrbindings 1), alkyn-baserte crosslinkers (tverrbinder 2), tiolert HA, tiolert gelatin, vev ECM materialer, og umodifisert HA og gelatin. Den bioink formulering fremstilles og spontant tverrbindes gjennom tiol-akrylat binding, noe som resulterer i et mykt, ekstruderbart materiale. Bioprinting utføres. Til slutt blir de bioprinted lag smeltet, stabilisert, og bringes til leveren elastisitetsmodul. Denne prosessen kan gjentas for å generere flere lag strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Bioprinting testing av bioinks. A) En 7 x 7 mm viklemønster ble anvendt for bioink ekstrudering testing i bioprinter. B) Den innledende formulering av en PEGDA og 8-arm PEG alkyn bioink resulterte i uregelmessig deponering. C) Legge rå HA og gelatin forbedret ekstrudering, som resulterer i jevn ekstrudering av bioink. Scale bar -. 1 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Demonstrasjon av levedyktighet og funksjon av lever sfæroider bioprinted i lever-spesifikke hydrogel bioink. A) Gjennomføring av leveren bioink for bioprinting, resulterte i høye levedyktighet konstruksjoner. Grønn - calcein AM-farget levedyktige celler; Red - B Ethidium homodimer-farget døde celler) Urea og C) albumin som utskilles av leveren konstruksjoner over 14 d.ays i kultur, kvantifiseres ved kolorimetriske og ELISA-analyser, henholdsvis. Feilfelt angir standardavvik. Farging av markører assosiert med levervevet: D) CYP3A4, E) Intracellulær albumin, og F) DPP4 og E-cadherin. Grønn eller rød - indikert flekken; Blue -. DAPI Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere komponenter som er avgjørende for å vurdere når du forsøker å biofabricate 3-D vev konstruerer, for eventuell bruk i mennesker eller for in vitro screening-programmer. Ansette de riktige cellulære komponenter bestemmer slutten potensial funksjonalitet, mens biofabrication enheten selv avgjør generell metodikk for å nå slutten konstruere. Den tredje komponenten, biomateriale, er like viktig som det tjener dobbeltroller. Spesielt må biomateriale komponent være kompatibel med både biofabrication hardware (dvs. bioprinters) og støtter også de potensielt sårbare biologiske cellekomponenter. Optimalisering av begge disse kravene kan være vanskelig, så bioprintable materialer må oppfylle flere viktige parametre: 1) besitter den riktige kjemiske, mekaniske og tidsmessige egenskaper til rette for effektiv og uhemmet utskrift; 2) støtte celle levedyktighet under utarbeidelsen stadier og bioprinting prosedyre; 3) og tilveiebringe et gjestfritt miljø som best forbedrer cellelevedyktigheten og eventuelt vev konstruksjon funksjon etter bioprinting. Vi benytter modul hydrogel bioink systemet beskrevet i metoden beskrevet her for å oppfylle disse kravene. Først, ved inkorporering av vekstfaktorer, kollagener, knebel, og elastins avledet fra ECM av en spesiell vevstype, kan vi oppnå en biokjemisk profil som minner om det mål-vevet type. For det andre, ved å benytte 2 like, men uavhengig kryssbindingsreaksjoner er vi i stand til å oppnå en myk ekstruderbart materiale som er kompatibelt med de fleste ekstrudering-basert, noe som kan ytterligere endres med den andre tverrbindingstrinnet for å nå et bestemt materiale elastisitetsmodul som samsvarer med en target vev av valget. 34
Den kritiske egenskap ved dette system som gjør det nyttig er muligheten til å støtte flere kjemiske reaksjoner som kan bli brukt til å manipulere gjøre at polymerrization kinetikk og mekaniske egenskaper av bioink systemet. Ved å anvende 2 uavhengige reaksjonstyper, tiol-akrylat og tiol-alkyn, oppnår vi muligheten til å utføre et trinn 1 tiol-akrylat reaksjon som resulterer i et mykt materiale som kan ekstruderes gjennom en sprøyte eller bioprinting anordning, og en fase 2 tiol -alkyne reaksjon, som kun initieres ved UV-eksponering i nærvær av en fotoinitiator, som bestemmer den elastiske modul av den endelige bioprinted konstruksjon. Disse flere trinn resulterer i en bioprintable materiale. Som sådan, for å oppnå en stabil bioink som støtter ekstrudering og påfølgende elastisitetsmodul tilpasning, å opprettholde disse separate reaksjonstyper er viktig.
Den primære draw å bruke systemet for biofabrication er dens lette for tilpasning, noe som gjøres gjennom enten å manipulere slutten elastisk modulus gjennom annenhåndskryssbinder eller gjennom inkludering av ulike vev-avledet ECM materialer eller vekstfaktor cocktails. ECM i vev som inneholder en rekke vekstfaktorer og andre cytokiner, som ofte varierer i generell fordeling mellom vevstyper. Vi tror at disse faktorene er integrert for å opprettholde funksjon av visse celletyper, så som primære, humane hepatocytter. Gjennomføringen av dette konseptet ble tidligere vist å øke levedyktigheten og funksjonen av primære humane hepatocytter i hepariniserte hyaluronsyre sandwich-kulturer. 20 Ved å kombinere heparinkjedene i hydrogelen med heparin-bindende vekstfaktorer så vel som andre ECM-komponenter fra leveren ECM, var vi i stand å presentere denne lever-spesifikk biokjemisk profil for å primære humane hepatocytter, opprettholde levedyktighet og funksjon in vitro for en lengre periode. Denne fremgangsmåten kan lett utvides til andre typer vev, slik at forskere å oppnå gjentagelse av disse vevs-spesifikke faktorer ved decellularizing og oppløseliggjøring av andre vev.
telt "> Brukere bør være klar over at mens base komponenter i dette bioink systemet har blitt implementert i bioprinting tidligere, 10,12,17 men i mindre nyanserte, vev spesifikke tilnærminger, samt en rekke andre regenerativ medisin programmer, 35- 45 biofabrication har ikke vært forsøkt for alle vevstyper. som sådan, kan det være noen videre utvikling og feilsøking nødvendig for å skape slike tilleggs vev konstruksjoner. imidlertid kan et modulært system slik som det som er beskrevet her meget godt kunne tilpasses. Andre potensielle begrensninger inkluderer naturlige slektskap at noen celletyper kan ha mot bestemte biomaterialer. generelt har vi funnet at hyaluronsyre, gelatin, og PEG-baserte basis komponenter i denne hydrogel systemstøtte levedyktige kulturer av en rekke forskjellige celletyper, men det kan være noen typer celler som utfører bedre i konstruerte miljøer med forskjellige sammensetninger, slik som kollagen, som har en iboende fibrøs naTure, eller elastin, som av natur er mer elastisk. Som sådan, er hensynet til den optimale materialet for en gitt vevstype og slutten søknad viktig, og hydrogel bioink systemet beskrevet her, kan ikke være tilstrekkelig for alle bruksområder. I tillegg er det viktig å vurdere de miljømessige forholdene som bioprinting utføres. Under utviklingen av denne protokollen, har vi gått fra nær ambient (romtemperatur) forhold ved hjelp bioinks uten celle media, noe som fører til dårlig levedyktighet om utarbeidelse og trykking tid ble også trukket ut, til raskere protokoller under 37 ° C ved hjelp bioinks med en media komponent, som dramatisk økt celle levedyktighet.Inntil nylig var noen materialer eller materielle systemer utviklet spesielt for å kommunisere med bioprinting systemer. Som et resultat av de fleste materialer er forenklede, utnytte enten deres biologiske egenskaper for å støtte-celler, eller deres kompatibilitet med biofabricationmaskinvare. Få materialer er optimal i begge riker. Systemet er beskrevet i denne metodikken decouples disse egenskapene, og dermed lar tilpasning av biologisk karakterisering, og samtidig fremme de mekaniske egenskapene som er nødvendige for ekstrudering bioprinting. En ekstra utmerkelse av denne hydrogel bioink systemet er at det kan etterligne både biokjemiske og fysiske parametre av målet vev det er brukt for biofabricating. Dette understøtter en imponerende grad av fleksibilitet, slik at gjentagelse av de biokjemiske faktorene for nesten alle vev, så vel som søker elastisitetsmodulen av et annet mykt vev. Oppmerksomheten til begge disse aspektene av en vev har sjelden vært utforsket i tandem.
Den modulære natur denne teknologien gir en fleksibilitet til å bli implementert i en lang rekke anvendelser. Evnen til å etterligne forskjellige vevstyper som gir mulighet til å biofabricate ikke bare lever konstruksjoner som anvendes som eksempel i dette arbeidet, men constructs som representerer mange av de andre vev i kroppen. Kanskje den mest åpenbare bred anvendelse ved hjelp av disse parametrene er evnen til å matche begge sider til et bestemt vev for å optimalisere utgangen funksjon av konstruerte konstrukter for reelle applikasjoner som implantering eller medikament og toksikologi screening. Mens generasjonen av menneskestore vev for implantasjon i pasienter er det endelige målet for mange forskere, på grunn av regulatoriske hindringer, celle sourcing, og begrensninger på evnen til å dikte funksjonelle blodkar i vev utviklet organer, vil dette høye målet krever videre utvikling og tid å bli realisert. Imidlertid er teknologier som metoden beskrevet her for tiden i ferd med å bli implementert for å generere "organoids" for in vitro-plattformer. Vårt team, så vel som andre, er for tiden utnytte organoid biofabrication å lage modellsystemer der toksikologiske studier er utført. I tillegg kan slike organoids benyttes tilstudere sykdommer og sykdomsprogresjon, slik som kreft, 46 og teste potensielle terapeutiske behandlinger. Til slutt, dette systemet støtter også en annen viktig bruk. Ved å manipulere disse parametrene selvstendig, kan forskerne utføre grunnleggende vitenskapelige eksperimenter for å bestemme den relative betydningen av biokjemiske versus mekaniske faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for finansiering av Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) kontrakt nr N6601-13-C-2027. Utgivelsen av dette materialet utgjør ikke godkjennelse fra myndighetene i de funn eller konklusjoner heri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
