Summary
接触致畸可能导致出生缺陷。斑马鱼是确定的化学物质的致畸潜在有用的。我们通过暴露胚胎各级亚硝酸盐，并且也在曝光不同的时间证明斑马鱼的效用。我们表明，亚硝酸盐可能是有毒的，并导致严重的发育缺陷。
Abstract
在环境中的高硝酸盐水平可能导致在人体中的先天性缺陷或流产。据推测，这是由于硝酸根的由肠道和唾液细菌转化为亚硝酸盐。然而，在其他哺乳动物的研究中，高亚硝酸盐的含量不导致出生缺陷，尽管它们可能会导致差的生殖结局。因此，亚硝酸盐的致畸潜在不明确。这将是有脊椎动物模型系统轻松评估亚硝酸盐或任何其他感兴趣的化学物质的致畸作用非常有用。这里，我们证明斑马鱼（ 斑马鱼 ）的工具来筛选毒性和胚胎缺陷化合物。斑马鱼胚胎受精外，并有快速发展，使他们致畸研究的一个很好的模式。我们表明，增加曝光时间以负亚硝酸盐影响生存。增加亚硝酸盐的浓度也有不利影响的生存，而硝酸盐没有。对于胚胎塔ŧ生存亚硝酸盐暴露，可能会出现各种缺陷，包括心包和卵黄囊水肿，鱼鳔noninflation和颅面畸形。我们的结果表明，该斑马鱼是研究亚硝酸盐的致畸电位的方便的系统。这种方法可以容易地适用于测试其他化学品的早期脊椎动物发育的影响。
Introduction
畸变是由造成永久性的结构和功能异常，生长发育迟缓，或流产情况严重扰乱了1胚胎或胎儿的正常发育过程。它可以通过某些天然剂（致畸），其与胚胎发育以多种方式2干扰引起的。在人的胎儿发育，共同致畸如辐射，感染剂，有毒金属，和有机化工已报道引起epicanthic褶皱（弯曲手指或脚趾）通过形态发生错误的缺陷（皮肤褶皱中的上眼睑）和五指1。
理解致畸的分子机制是朝着显影治疗和预防的第一步。一些脊椎动物模型如非洲爪蛙（ 爪蟾 ）和斑马鱼（ 斑马鱼 ）已被用来确定受terat的分子途径ogens。以前的研究已经使用斑马鱼作为流行病学，毒理学和致畸3-7的典范。 Scholz等人 。考虑斑马鱼作为“金标准”环境毒性评估。这是由于在某种程度上，对斑马鱼胚胎，这允许它发生8研究者形象化发育缺陷的透明度。人类基因的大约70％的具有在斑马鱼直系同源物，使得斑马鱼的理想脊椎动物模型研究人类的缺陷9。
一些流行病学研究表明，硝酸盐和亚硝酸盐，通常存在于农场的食物和水，与出生缺陷或自然流产10,11相关联，而其它研究不支持此关联12。硝酸盐（NO 3 - ）和亚硝酸根（NO 2 - ）是在土壤和水自然存在。它们是氮植物的来源，并且是n的一部分itrogen周期13。食物，如绿豆，胡萝卜，南瓜，菠菜，甜菜，并从使用化肥高硝酸盐农场显著增强硝酸盐和亚硝酸盐7的水平。从高硝酸盐的食物和鱼高硝酸盐水（主要是从土壤中流失30）喂牛奶会导致人体消耗大量的硝酸盐和亚硝酸盐14。硝酸盐和亚硝酸盐也常用于食品保鲜，这大大增加了由人类12摄取的量使用。
硝酸盐和亚硝酸盐的最佳水平像血管稳态和功能，神经传递及免疫宿主防御机制13-15生理过程中发挥根本性的作用。然而，暴露于高水平的硝酸盐和亚硝酸盐的可能导致不利的影响，特别是在婴儿和儿童16。摄入硝酸盐是由微生物，并在第进一步转化为亚硝酸盐在口腔中由肠道菌群16 E胃肠道。
硝酸盐使婴儿在蓝色婴儿综合症高风险的血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，其携氧能力18损害血红蛋白。这导致皮肤的蓝色延伸到在更严重的情况下外周组织。在其他症状组织结果抑制氧化，最严重导致昏迷和死亡19,20。类似症状中的婴儿和成人在较高浓度的硝酸21的观察。由于紫绀，头痛亚硝酸盐中毒导致高铁血红蛋白成人水平升高，呼吸障碍31，死如不及时治疗，由于涉及重要组织缺氧32,33并发症。
硝酸盐在较高水平的摄入也可以导致各种健康并发症。儿童糖尿病，反复腹泻和反复呼吸道感染患儿已与硝酸盐摄入11,17,22相连。长期暴露于高水平硝酸盐与排尿和脾出血有关。急性高剂量照射硝酸盐可导致像腹痛，肌肉无力，便血和尿，昏厥，甚至死亡11医疗条件范围广泛。在较高水平产前暴露于硝酸一直与神经管缺陷的肌肉骨骼相关的11。
最近的一份报告显示，治疗斑马鱼胚胎与亚导致卵黄囊水肿，颅面和轴向畸形和鱼鳔noninflation 5。在这项研究中，我们证明了治疗斑马鱼的胚胎与硝酸盐和亚硝酸盐，以确定他们的致畸潜力的方法。胚胎在不同浓度和不同的时间长度暴露于亚硝酸盐。乙醇用作阳性对照，因为它是一个既定的致畸23。 Ø乌尔法表明，两种高浓度，长的曝光时间为亚硝酸盐不利于生存和导致各种表型，从轻度（水肿），重度（毛发育缺陷）。因此，斑马鱼是直接在探索胚胎硝酸盐和亚硝酸盐的潜在致畸作用，以补充流行病学研究的有用模型。
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Protocol
在本协议中所描述的程序进行的机构动物护理和使用委员会在宾夕法尼亚州印第安纳大学的批准。
1.收获胚胎
- 在28.5℃，pH为7，500-1,500μS之间电导率维持斑马鱼，和14小时光照和10小时黑暗的24的光/暗周期。使用野生型菌株，如涂，AB或TU / AB混合。不同的菌株可能有不同的反应化学处理25。
- 建立了鱼通过鱼加水系统到配合坦克交配收获鸡蛋的前一天晚上。添加雌雄鱼入罐和两个鱼分频器分开。每条鱼对将产生一系列的50-300蛋。为了确保有足够的蛋会产生，建立30双鱼。通常情况下，约50％在素配合年龄鱼对（6-9个月）将产生的蛋，导致每对多达200个鸡蛋，最大可达3的000蛋这个实验。
- 第二天早晨，指示灯亮起后，取下分开始交配。检查水箱交配鸡蛋每15分钟。
- 一旦鱼类产卵，用滤茶收获所有的胚胎，并将它们合并成E3缓冲液（5毫米氯化钠，0.17毫米氯化钾，0.33毫米氯化钙2，0.33毫米硫酸镁4）一个大容器。在1.5 HPF，删除和丢弃未受精的卵子在解剖显微镜下的塑料移液管。而受精卵是透明的34未受精的卵子是不透明的。
- 将50胚胎成包含每个处理条件50毫升E3缓冲100×15毫米的玻璃培养皿。共有33菜肴需要11治疗条件和3个重复。
2.治疗胚胎
- 开展以2小时受精后（HPF）35治疗。孵育胚胎/幼虫在28.5℃，并在120高倍视野检查幼虫。在执行LEAST的统计分析各处理条件重复三次。
- 3培养皿（每片含50胚胎）在2 HPF，取出E3缓冲用移液管，并加入50毫升300毫米乙醇E3缓冲液稀释。覆盖的培养皿用Parafilm最小化的乙醇蒸发。
- 继续暴露胚胎乙醇22小时。然后取出用移液管乙醇。加入50mL的E3缓冲液中，摇动培养皿几次洗出乙醇。用移液管取出本届E3缓冲区，并重复洗涤步骤2次以上。
- 3培养皿（每片含50胚胎）在2 HPF，取出E3缓冲用移液管，并加入50mL新E3缓冲。
- 9培养皿（每片含50胚胎）在2 HPF，取出E3缓冲用移液管，并加入50mL溶解在E3 1000缓冲mg / L的亚硝酸钠。事先确认使用的股票硝酸钠溶液浓度重氮化修饰（USEPA方法354.1）分光光度法28。
- 继续暴露3菜为46小时，三盘为70小时，三盘为94小时。每天更换和新鲜的亚硝酸盐溶液中的亚硝酸盐的解决方案。
- 每次曝光时间后，取出用移液管中的亚硝酸盐。加入50mL的E3缓冲液中，摇动培养皿几次洗出亚硝酸盐。用移液管取出本届E3缓冲区，并重复洗涤步骤2次以上。
- 3培养皿（每片含50胚胎）在2 HPF，取出E3缓冲用移液管，并加入50mL 200 mg / L的亚硝酸钠。 400，600，800重复此，与亚硝酸钠的1000毫克/升。
- 继续胚胎暴露于亚硝酸盐70小时。每天更换和新鲜的亚硝酸盐溶液中的亚硝酸盐的解决方案。
- 曝光时间后，取出用移液管中的亚硝酸盐。加入50mL E3缓冲液，摇动几盘次，以洗出亚硝酸盐。用移液管取出本届E3缓冲区，并重复洗涤步骤2次以上。
- 3培养皿（每片含50胚胎）在2 HPF，取出E3缓冲用移液管，并加入50mL溶解在E3 1000缓冲毫克/升硝酸钠。确认硝酸盐原液的浓度预先用镉还原（USEPA方法353.3）分光光度法28的变形例。
- 继续胚胎暴露于硝酸70小时。每天更换新鲜制成硝酸盐溶液的硝酸盐溶液。
- 曝光时间后，取出用移液管硝酸盐。加入50mL的E3缓冲液中，摇动培养皿几次洗出硝酸盐。用移液管取出本届E3缓冲区，并重复洗涤步骤2次以上。
- 在曝光中的每一天，计数用立体显微镜在死胚胎/幼虫数。死亡的迹象包括缺乏心跳和血液循环，或观察1分钟后，缺乏活力的。除去死胚/幼虫用移液管以减小E3缓冲器的污染。
- 当实验在120 HPF结束，安乐死的幼虫。
- 取出用移液管的E3缓冲区。然后加入50mL的0.2％的MS-222（缓冲到pH 7），等待10分钟。
- 用移液管取出的MS-222。加入50mL的E3缓冲并乱舞的洗出的MS-222。
- 用移液管取出E3缓冲器和加入20毫升4-％多聚甲醛（PFA）的固定幼虫。摇动的菜好几次。用移液管向幼虫转移到玻璃小瓶中有足够的PFA沿填充小瓶。存放在冰箱小瓶过夜（O / N）。
- 采取使用用数码相机一个立体镜固定幼虫的照片。使用30X的放大倍率，ISO 200和200毫秒的曝光时间。定向幼虫，使得前向乐英尺和背侧是对字段的顶部。
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Representative Results
曝光至300mM乙醇22小时对存活率（数据未示出），与以前的报告5,23,26一致没有影响。这是意料之中的，因为乙醇是一种已知的致畸，并担任阳性对照。观测到的表型包括心包水肿，鱼鳔noninflation（图1），颅面畸形和发育迟缓（数据未示出）。
用亚硝酸盐处理导致轻度至对生存造成严重影响，这取决于曝光的时间。例如，暴露于1000毫克/升94小时严重影响存活相比较短的曝光时间（ 图2）。
我们还评估了生存不同亚硝酸盐的浓度的影响。胚胎暴露70小时至200，400,600，800，和1000毫克/升。当暴露于高成活率较低亚硝酸盐的浓度，而硝酸盐没有对生存的效果（图3）。亚硝酸盐处理过的幼虫表型相似乙醇处理的胚胎（图4）。
图1：用乙醇处理乙醇处理胚发育的影响示心包水肿（箭头），鱼鳔noninflation（虚线），卵黄囊水肿（箭头），和颅面畸形（数据未示出）。图片拍摄于96高倍视野。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：1000毫克生存/ L亚硝酸盐处理的世博会后不同时间URE。胚胎在2 HPF暴露于1000毫克/升的亚硝酸盐。亚硝酸盐被暴露后的46，70和94小时洗出，并计算存活率。增加曝光时间下降导致成活率。标准差：未处理= 24; 46小时= 6; 70小时= 6; 94小时= 0.9。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：暴露于不同的亚硝酸盐的浓度后存活胚胎暴露70小时以增加亚硝酸盐的浓度。亚硝酸盐的浓度较高导致较低的存活率。有硝酸盐即使在1000毫克/升暴露70小时后的最高浓度没有影响。亚硝酸盐标准差：未处理= 19; 200毫克/升= 16; 400毫克/升= 21; 600毫克/升= 20; 800毫克/升= 14; 1000毫克/升= 12硝酸盐标准差等于4。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：相比于未处理的对照（顶面板）1000毫克/硝酸盐L（中图）处理硝酸盐和亚硝酸盐胚发育影响无影响。在1000毫克/升的亚硝酸盐处理导致除了在乙醇处理（底部面板）观察相似的表型毛的发育缺陷。图像是在120高倍视野。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里介绍的方法证明了评估硝酸盐和亚硝酸盐的潜在致畸斑马鱼的效用。相比其他脊椎动物斑马鱼有优势，包括高繁殖力，体外受精，光学透明，快速发展。缺乏色素沉着（如斑马鱼的Casper 36）可用的突变体也有助于增强内脏器官的知名度。它也很容易产生与报告基因的转基因斑马鱼便于分析在活鱼37。因为斑马鱼基因组与人类保守的，从他们的研究中获得的信息可以导致在人中9平移的结果。该方法可以适用于基因表达分析，例如原位杂交 ，从而获得关于引起致畸基因的误调节的附加 信息。
乙醇暴露没有显著影响存活，但它并引起马rked缺陷类似于此前的报道5,23,26。这表明，我们的方法是重复公布的结果可靠。硝酸对存活没有影响，而亚硝酸盐确实具有取决于浓度和暴露的时间显著影响。更长的曝光和亚硝酸盐的更高水平的对存活有负面影响，与以前的结果5一致。据最近表明，过量的亚暴露在斑马鱼27引起缺陷的心脏瓣膜的发展，验证使用斑马鱼的研究致畸的机制。
关键是要确认工作溶液的浓度它们由后。硝酸盐和亚硝酸盐的浓度可以使用， 分别为28镉还原修改（USEPA方法353.3）和重氮化（USEPA方法354.1）分光光度法测量。另一个关键步骤是覆盖培养皿用Parafilm减少蒸散乙醇配给如果这被用作阳性对照。如果幼虫有意外死亡（太高或太低），仔细检查解决方案的计算和浓度。
最近，采用同样的方法来确定的乙醇29的致畸作用。虽然这个方法类似于这里我们的方法中，只公开的胚胎为乙醇长达24小时，大概是由于暴露的胚胎为乙醇为长时间的毒性。相比之下，我们的方法公开胚胎硝酸盐和亚硝酸盐几天与替换每天测试的解决方案。这是用于测试低毒性的化学物质是有利的。
我们设想，我们的方法可以适用于测试其他药物或特定环境条件。但是，该方法仅限于测试水溶性分子。某些化学物质的光敏感度是要考虑的另一个因素。如果试验化学品光SENSIT香港专业教育学院，包裹培养皿用铝箔避光。此外，该方法是不好的，因为实验室斑马鱼需要最佳发展特定条件下（如pH和电导率）从一个特定的环境中所采取的测试水。即使如此，斑马鱼作为有利模型来快速确定所造成的潜在致畸发育缺陷。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
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