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Immunology and Infection

एक मॉडल के रूप Zebrafish नाइट्राइट की क्षमता का आकलन करने के लिए टेराटोजेनिक

Published: February 16, 2016 doi: 10.3791/53615
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Summary

teratogens के संपर्क में जन्म दोष का कारण बन सकता है। Zebrafish रसायनों के टेराटोजेनिक क्षमता का निर्धारण करने के लिए उपयोगी होते हैं। हम जोखिम के अलग अलग समय पर नाइट्राइट के विभिन्न स्तरों के लिए भ्रूण को प्रकाश में लाने के लिए और भी द्वारा zebrafish की उपयोगिता प्रदर्शित करता है। हम बताते हैं कि नाइट्राइट विषाक्त हो सकता है और गंभीर विकास दोष पैदा कर सकता है।

Abstract

वातावरण में उच्च नाइट्रेट का स्तर जन्मजात दोष या मानव में गर्भपात हो सकता है। मुमकिन है, इस आंत और लार बैक्टीरिया द्वारा नाइट्राइट को नाइट्रेट के रूपांतरण के कारण है। हालांकि, अन्य स्तनधारी अध्ययन में, उच्च नाइट्राइट का स्तर जन्म दोष, हालांकि वे गरीब प्रजनन परिणामों को जन्म दे सकता का कारण नहीं है। इस प्रकार, नाइट्राइट की टेराटोजेनिक संभावित स्पष्ट नहीं है। यह एक कशेरुकी मॉडल प्रणाली को आसानी से नाइट्राइट या हित के किसी भी अन्य रसायन के टेराटोजेनिक प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी होगा। यहाँ, हम विषाक्तता और भ्रूण दोष के लिए यौगिकों स्क्रीन करने के लिए zebrafish (Danio rerio) की उपयोगिता का प्रदर्शन। Zebrafish भ्रूण बाहर से निषेचित और तेजी से विकास किया है, उन्हें टेराटोजेनिक के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल बना रहे हैं। हम बताते हैं कि जोखिम के समय नकारात्मक नाइट्राइट के लिए बढ़ती अस्तित्व को प्रभावित करता है। नाइट्राइट की एकाग्रता बढ़ाने पर भी प्रतिकूल, अस्तित्व को प्रभावित करता है, जबकि नाइट्रेट नहीं करता है। भ्रूण था के लिएटी नाइट्राइट जोखिम जीवित है, विभिन्न दोषों पेरिकार्डियल सहित पाए जाते हैं और थैली शोफ की जर्दी, मूत्राशय noninflation, और craniofacial कुरूपता तैर कर सकते हैं। हमारे परिणाम से संकेत मिलता है कि zebrafish नाइट्राइट की टेराटोजेनिक संभावित अध्ययन के लिए एक सुविधाजनक प्रणाली है। इस दृष्टिकोण को आसानी से जल्दी कशेरुकी विकास पर उनके प्रभाव के लिए अन्य रसायनों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

Teratogenesis एक प्रक्रिया है कि गंभीर मामलों 1 में स्थायी संरचनात्मक और कार्यात्मक असामान्यताओं, विकास मंदता, या गर्भपात के कारण से एक भ्रूण या भ्रूण के सामान्य विकास बाधित है। यह कुछ प्राकृतिक एजेंट (teratogens) है, जो कई मायनों 2 में भ्रूण के विकास के साथ हस्तक्षेप की वजह से हो सकता है। मानव भ्रूण के विकास के दौरान, इस तरह के विकिरण, संक्रामक एजेंटों, विषाक्त धातुओं, और कार्बनिक रसायन के रूप में आम teratogens मॉर्फ़ोजेनेटिक त्रुटियों के माध्यम से epicanthic परतों में दोष (ऊपरी आंख ढक्कन में त्वचा गुना) और वक्रांगुलिता (घुमावदार उंगली या पैर की अंगुली) पैदा करने के लिए सूचित किया गया है 1।

teratogenesis की आणविक तंत्र को समझना उपचार और रोकथाम के विकास की दिशा में पहला कदम है। इस तरह के रूप में कई अफ्रीकी कशेरुकी मॉडल मेंढक (Xenopus laevis) और zebrafish (Danio rerio) नोंकदार terat से प्रभावित आणविक मार्ग निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैogens। पिछले अध्ययनों से महामारी विज्ञान, विष विज्ञान और teratogenesis 3-7 के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish का इस्तेमाल किया है। Scholz एट अल। एक "सोने के मानक 'पर्यावरण आकलन के लिए विषाक्तता के रूप में माना zebrafish। इस zebrafish भ्रूण है, जो के रूप में यह 8 से होता शोधकर्ताओं विकासात्मक दोष कल्पना करने के लिए अनुमति देता है की पारदर्शिता के लिए, की वजह से है, भाग में। मानव जीन का लगभग 70% मानव दोष 9 के अध्ययन के लिए एक वांछनीय zebrafish हड्डीवाला मॉडल बनाने zebrafish में orthologues है।

कुछ महामारी विज्ञान के अध्ययन है कि नाइट्रेट और नाइट्राइट, सामान्यतः खेत खाद्य पदार्थ और पानी में मौजूद सुझाव दिया है, जन्म दोष या सहज गर्भपात 10,11 के साथ जुड़े रहे हैं, जबकि अन्य अध्ययनों से इस संघ 12 का समर्थन नहीं करते। नाइट्रेट (सं 3 -) और नाइट्राइट (सं 2 -) मिट्टी और पानी में स्वाभाविक रूप से मौजूद रहे। वे पौधों के लिए नाइट्रोजन का स्रोत रहे हैं और एन का एक हिस्सा हैंitrogen चक्र 13। ऐसे हरी बीन्स, गाजर, स्क्वैश, पालक, और बीट खेतों कि नाइट्रेट में उच्च उर्वरकों के उपयोग से के रूप में फूड्स काफी नाइट्रेट और नाइट्राइट 7 के स्तर को संवर्धित किया है। उच्च नाइट्रेट खाद्य पदार्थ और उच्च नाइट्रेट पानी (मुख्य रूप से मिट्टी अपवाह 30 से) में मछली के साथ खिलाया गायों से दूध लेने वाली नाइट्रेट और नाइट्राइट 14 की बड़ी मात्रा में मनुष्य के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। नाइट्रेट और नाइट्राइट भी आमतौर पर खाद्य संरक्षण, जो नाटकीय रूप से राशि मनुष्यों 12 द्वारा किया जाता बढ़ जाती है में किया जाता है।

नाइट्रेट और नाइट्राइट का इष्टतम स्तर संवहनी homeostasis और समारोह, न्यूरोट्रांसमिशन और प्रतिरक्षा मेजबान रक्षा तंत्र 13-15 की तरह शारीरिक प्रक्रियाओं में मौलिक भूमिका निभाते हैं। हालांकि, नाइट्रेट और नाइट्राइट का उच्च स्तर के लिए जोखिम विशेष रूप से शिशुओं और बच्चों के 16 में प्रतिकूल प्रभाव पैदा हो सकती है। जाता नाइट्रेट आगे microflora द्वारा और वें में मौखिक गुहा में नाइट्राइट में बदल जाती हैआंतों microflora 17 से ई जठरांत्र पथ।

नाइट्रेट methemoglobin को हीमोग्लोबिन के ऑक्सीकरण द्वारा ब्लू बेबी सिंड्रोम के लिए एक उच्च जोखिम में शिशुओं डालता है, इसकी क्षमता 18 ऑक्सीजन ले जाने से हीमोग्लोबिन आई। यह है कि और अधिक गंभीर मामलों में परिधि के ऊतकों तक फैली हुई त्वचा के नीले रंग में परिणाम है। अन्य लक्षणों में ऊतकों परिणामों के हिचकते ऑक्सीजन, सबसे गंभीर रूप से कोमा और मौत 19,20 के लिए अग्रणी। इसी तरह के लक्षण नाइट्रेट 21 की उच्च सांद्रता में बच्चों और वयस्कों में मनाया जाता है। नीलिमा, सिर दर्द में नाइट्राइट विषाक्तता के परिणामों के कारण वयस्कों में methemoglobin का ऊंचा स्तर, श्वास संबंधी विकार 31, और मौत महत्वपूर्ण ऊतक हाइपोक्सिया 32,33 से संबंधित जटिलताओं के कारण इलाज नहीं है।

उच्च स्तर पर किया जाता नाइट्रेट भी विभिन्न स्वास्थ्य जटिलताओं में परिणाम कर सकते हैं। बचपन मधुमेह, आवर्तक दस्त, और आवर्तक श्वसन तंत्र में संक्रमणबच्चों में उच्च नाइट्रेट का सेवन 11,17,22 के साथ जोड़ा गया है। नाइट्रेट के एक उच्च स्तर के लिए पुरानी जोखिम पेशाब और तिल्ली ख़ून का बहाव के साथ जुड़ा हुआ है। नाइट्रेट के लिए तीव्र उच्च खुराक जोखिम पेट में दर्द, मांसपेशियों में कमजोरी, मल और मूत्र, बेहोशी में रक्त, और मृत्यु 11 की तरह चिकित्सा स्थितियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उच्च स्तर पर नाइट्रेट को प्रसव पूर्व जोखिम न्यूरल ट्यूब दोष और musculoskeletal 11 के साथ संबद्ध किया गया है।

हाल ही में एक रिपोर्ट से पता चला है कि नाइट्राइट साथ zebrafish भ्रूण इलाज थैली सूजन, craniofacial और अक्षीय विकृतियों की जर्दी के लिए नेतृत्व किया, और मूत्राशय noninflation 5 तैरना। इस अध्ययन में, हम नाइट्रेट और नाइट्राइट साथ zebrafish भ्रूण के इलाज के लिए उनके टेराटोजेनिक क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन। भ्रूण अलग सांद्रता और समय के विभिन्न लंबाई में नाइट्राइट से अवगत कराया गया। क्योंकि यह एक स्थापित teratogen 23 इथेनॉल है, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हेउर विधि से पता चला है कि दोनों उच्च सांद्रता और नाइट्राइट करने के लिए लंबे समय जोखिम समय के अस्तित्व के लिए हानिकारक थे और विभिन्न phenotypes में हुई, गंभीर (सकल विकास दोष) को हल्के (edema) से लेकर। इसलिए, zebrafish सीधे महामारी विज्ञान के अध्ययन पूरक करने के लिए भ्रूण पर नाइट्रेट और नाइट्राइट की संभावित टेराटोजेनिक प्रभाव की खोज के लिए एक उपयोगी मॉडल है।

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Protocol

प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित पेंसिल्वेनिया के इंडियाना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. फसल भ्रूण

  1. 28.5 डिग्री सेल्सियस, पीएच 7, 500-1,500 μS के बीच चालकता पर zebrafish बनाए रखें, और एक प्रकाश / 14 घंटा प्रकाश और 10 घंटा अंधेरे 24 के अंधेरे चक्र। ऐसे Tu, एबी या Tu / एबी संकर के रूप में जंगली प्रकार उपभेदों का प्रयोग करें। विभिन्न प्रकारों रासायनिक उपचार करने के लिए 25 अलग प्रतिक्रिया हो सकती है।
  2. एक संभोग टैंक में मछली प्रणाली पानी जोड़कर कटाई अंडे से पहले रात संभोग के लिए मछली सेट करें। एक नर और मादा मछली टैंक में जोड़ें और एक विभक्त के साथ दो मछली अलग। प्रत्येक मछली जोड़ी 50-300 अंडे की एक श्रृंखला का उत्पादन होगा। यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है कि अंडे, मछली का उत्पादन किया जाएगा के 30 जोड़े की स्थापना की। आमतौर पर, प्रधानमंत्री संभोग की उम्र में मछली जोड़े के बारे में 50% (6-9 महीने पुरानी है), अंडे का उत्पादन होगा जोड़ी प्रति 200 अंडे और ऊपर से 3 की एक अधिकतम जिसके परिणामस्वरूपइस प्रयोग के लिए 000 अंडे।
  3. अगली सुबह के बाद प्रकाश पर बदल जाता है, विभक्त संभोग आरंभ करने के लिए हटा दें। अंडे के लिए हर 15 मिनट संभोग टैंकों की जाँच करें।
  4. एक बार मछली अंडे देते हैं, एक चाय का झरनी का उपयोग कर सभी भ्रूण फसल और उन्हें E3 बफर (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4) के साथ एक बड़े कंटेनर में गठबंधन। 1.5 HPF पर, हटाने और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet के साथ unfertilized अंडे त्यागें। जबकि निषेचित अंडे पारदर्शी हैं 34 unfertilized अंडे अपारदर्शी हैं।
  5. स्थानांतरण 50 प्रत्येक उपचार हालत के लिए 50 मिलीलीटर E3 बफर युक्त एक 100 x 15 मिमी गिलास पेट्री डिश में भ्रूण। 33 व्यंजन के कुल 11 इलाज की स्थिति और 3 प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं।

2. इलाज भ्रूण

  1. 2 घंटे बाद निषेचन (HPF) 35 पर उपचार के लिए बाहर ले। 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते भ्रूण / लार्वा और 120 HPF पर लार्वा की जांच। घास का मैदान पर प्रदर्शनसेंट सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक उपचार हालत के तीन दोहराता है।
  2. 2 HPF पर 3 पेट्री डिश (प्रत्येक युक्त 50 भ्रूण) के लिए, एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर हटाने और 300 मिमी इथेनॉल E3 बफर में पतला के 50 मिलीलीटर जोड़ें। इथेनॉल के वाष्पीकरण को कम करने के Parafilm के साथ पेट्री डिश को कवर किया।
    1. 22 घंटे के लिए इथेनॉल के लिए भ्रूण को उजागर जारी रखें। फिर एक हस्तांतरण pipet के साथ इथेनॉल को हटा दें। E3 बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें और पकवान कई बार इथेनॉल बाहर धोने के लिए ज़ुल्फ़। एक हस्तांतरण pipet के साथ इस E3 बफर निकालें और वाशिंग चरण 2 बार दोहराएँ।
  3. 2 HPF पर 3 पेट्री डिश (प्रत्येक युक्त 50 भ्रूण) के लिए, एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर हटाने और नए E3 बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. 2 HPF पर 9 पेट्री डिश (प्रत्येक युक्त 50 भ्रूण) के लिए, एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर हटाने और 1000 मिलीग्राम / एल सोडियम नाइट्राइट E3 बफर में भंग की 50 मिलीलीटर जोड़ें। शेयर नाइट्राइट समाधान की एकाग्रता पहले से एक का उपयोग कर पुष्टिdiazotization के संशोधन (USEPA विधि ३५४.१) spectrophotometric विधि 28।
    1. 46 घंटे के लिए 3 व्यंजन, 70 घंटे के लिए 3 व्यंजन और 94 घंटे के लिए 3 व्यंजन उजागर जारी रखें। ताजा बना नाइट्राइट समाधान के साथ नाइट्राइट समाधान दैनिक बदलें।
    2. प्रत्येक जोखिम समय के बाद, स्थानांतरण pipet के साथ नाइट्राइट को हटा दें। E3 बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें और पकवान कई बार नाइट्राइट बाहर धोने के लिए ज़ुल्फ़। एक हस्तांतरण pipet के साथ इस E3 बफर निकालें और वाशिंग चरण 2 बार दोहराएँ।
  5. 2 HPF पर 3 पेट्री डिश (प्रत्येक युक्त 50 भ्रूण) के लिए, एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर हटाने और 200 मिलीग्राम / एल सोडियम नाइट्राइट की 50 मिलीलीटर जोड़ें। 400, 600, 800 के साथ इस दोहराएँ, और सोडियम नाइट्राइट के 1000 मिलीग्राम / एल।
    1. 70 घंटे के लिए नाइट्राइट के लिए भ्रूण को उजागर जारी रखें। ताजा बना नाइट्राइट समाधान के साथ नाइट्राइट समाधान दैनिक बदलें।
    2. जोखिम समय के बाद, स्थानांतरण pipet के साथ नाइट्राइट को हटा दें। E3 बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें और पकवान कई ज़ुल्फ़बार नाइट्राइट बाहर धोने के लिए। एक हस्तांतरण pipet के साथ इस E3 बफर निकालें और वाशिंग चरण 2 बार दोहराएँ।
  6. 2 HPF पर 3 पेट्री डिश (प्रत्येक युक्त 50 भ्रूण) के लिए, एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर हटाने और 1000 मिलीग्राम / एल सोडियम नाइट्रेट E3 बफर में भंग की 50 मिलीलीटर जोड़ें। कैडमियम कमी (USEPA विधि ३५३.३) spectrophotometric विधि 28 के एक संशोधन का उपयोग करते हुए पहले से शेयर नाइट्रेट समाधान की एकाग्रता की पुष्टि करें।
    1. 70 घंटे के लिए नाइट्रेट के लिए भ्रूण को उजागर जारी रखें। ताजा बना नाइट्रेट समाधान के साथ नाइट्रेट समाधान दैनिक बदलें।
    2. जोखिम समय के बाद, स्थानांतरण pipet के साथ नाइट्रेट को हटा दें। E3 बफर के 50 मिलीलीटर जोड़ें और पकवान कई बार नाइट्रेट बाहर धोने के लिए ज़ुल्फ़। एक हस्तांतरण pipet के साथ इस E3 बफर निकालें और वाशिंग चरण 2 बार दोहराएँ।
  7. जोखिम के प्रत्येक दिन के दौरान, एक stereomicroscope का उपयोग मृत भ्रूण / लार्वा की संख्या गिनती। मौत के लक्षणदिल की धड़कन की कमी और रक्त परिसंचरण, या अवलोकन के 1 मिनट के बाद गतिशीलता की कमी शामिल है। एक हस्तांतरण pipet के साथ मृत भ्रूण / लार्वा हटाये E3 बफर के प्रदूषण को कम करने के लिए।
  8. प्रयोगों 120 HPF पर अंत में जब, लार्वा euthanize।
    1. एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर निकालें। फिर 0.2% MS-222 (7 पीएच को बफर) के 50 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. एक हस्तांतरण pipet के साथ एमएस-222 निकालें। E3 बफर और चक्कर आने की 50 मिलीलीटर एमएस -222 बाहर धोने के लिए जोड़ें।
    3. एक हस्तांतरण pipet के साथ E3 बफर निकालें और लार्वा को ठीक करने के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 20 मिलीलीटर जोड़ें। डिश कई बार भंवर। पर्याप्त पीएफए ​​के साथ एक कांच की शीशी में लार्वा को हस्तांतरण करने की शीशी को भरने के लिए एक हस्तांतरण pipet का प्रयोग करें। रात भर फ्रिज में शीशियों (ओ / एन) की दुकान।
  9. एक डिजिटल कैमरे के साथ एक त्रिविमदर्शी का उपयोग कर तय लार्वा की तस्वीरें ले लो। 30X बढ़ाई, आईएसओ 200, और 200 मिसे जोखिम समय का उपयोग करें। लार्वा ओरिएंट इतना है कि le लिए पूर्वकालफुट और पृष्ठीय क्षेत्र के शीर्ष करने के लिए है।

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Representative Results

22 घंटे के लिए 300 मिमी इथेनॉल के संपर्क में अस्तित्व (नहीं दिखाया डेटा), पिछली रिपोर्टों 5,23,26 के साथ संगत पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। यह आशा की जाती है, के रूप में इथेनॉल एक ज्ञात teratogen है और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। मनाया phenotypes पेरिकार्डियल शोफ, तैरना मूत्राशय noninflation (चित्रा 1), craniofacial दोष, और विकास में देरी (डेटा नहीं दिखाया गया है) शामिल थे।

नाइट्राइट के साथ उपचार के अस्तित्व पर गंभीर प्रभाव को हल्के में हुई, जोखिम के समय पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, 94 घंटा के बुरी तरह प्रभावित अस्तित्व के लिए प्रदर्शन करने के लिए 1000 मिलीग्राम / एल कम जोखिम बार (चित्रा 2) की तुलना में।

हम यह भी अस्तित्व पर अलग नाइट्राइट सांद्रता के प्रभाव का आकलन किया। भ्रूण 200 से 70 घंटा, 400, 600, 800, और 1000 मिलीग्राम / एल के लिए खुल गए थे। जब उच्च के संपर्क में जीवित रहने की दर कम थेनाइट्राइट की सांद्रता, जबकि नाइट्रेट अस्तित्व पर असर नहीं था (चित्रा 3)। नाइट्राइट का इलाज लार्वा के लिए phenotypes इथेनॉल इलाज भ्रूण की है कि (चित्रा 4) जैसे लगते थे।

आकृति 1
चित्रा 1:। इथेनॉल उपचार भ्रूण के विकास के प्रभाव इथेनॉल के साथ इलाज किया पेरिकार्डियल शोफ (तीर) से पता चला है, मूत्राशय noninflation (धराशायी लाइन), जर्दी थैली शोफ (नोक), और craniofacial दोष (डेटा) नहीं दिखाया तैरना। छवियाँ 96 HPF पर ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: 1000 मिलीग्राम की जीवन रक्षा / एल नाइट्राइट उपचार Expos के अलग अलग समय के बादUre। भ्रूण 2 HPF पर 1,000 मिलीग्राम / एल नाइट्राइट से अवगत कराया गया। नाइट्राइट 46, 70, और 94 घंटे के बाद जोखिम के बाहर धोया गया था, और जीवित रहने की दर की गणना की गई। वृद्धि की जोखिम समय जीवित रहने की दर में कमी आई में हुई। मानक विचलन: अनुपचारित = 24; 46 घंटा के = 6; 70 घंटा के = 6; 94 घंटा के = 0.9। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। नाइट्राइट विभिन्न सांद्रता के प्रदर्शन के बाद जीवन रक्षा भ्रूण नाइट्राइट की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए 70 घंटे के लिए खुल गए थे। नाइट्राइट की उच्च सांद्रता कम जीवित रहने की दरों में हुई। नाइट्रेट भी 70 घंटे के लिए प्रदर्शन के बाद से 1000 मिलीग्राम / एल सर्वोच्च एकाग्रता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। नाइट्राइट के लिए मानक विचलन: अनुपचारित = 19; 200 मिलीग्राम / एल = 16; 400 मिलीग्राम / एल = 21; 600 मिलीग्राम / एल = 20; 800मिलीग्राम / एल = 14; 1000 मिलीग्राम / एल = नाइट्रेट के लिए 12. मानक विचलन के बराबर होती है 4. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। नाइट्रेट और नाइट्राइट भ्रूण के विकास के प्रभाव 1,000 मिलीग्राम / एल नाइट्रेट (मध्यम पैनल) के साथ इलाज कोई प्रभाव नहीं पड़ा अनुपचारित नियंत्रण (शीर्ष पैनल) की तुलना में। 1000 मिलीग्राम / एल पर नाइट्राइट उपचार इथेनॉल उपचार (नीचे पैनल) में मनाया समान phenotypes के अलावा सकल विकास दोष में हुई। छवियाँ 120 HPF पर ले जाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विधि यहाँ वर्णित नाइट्राइट और नाइट्रेट की टेराटोजेनिक संभावित आकलन करने में zebrafish की उपयोगिता को दर्शाता है। अन्य रीढ़ की तुलना में, zebrafish लाभ है कि उच्च उपजाऊपन, बाह्य निषेचन, ऑप्टिकल पारदर्शिता, और तेजी से विकास शामिल है। उपलब्ध म्यूटेंट कि रंजकता की कमी है (जैसे कि कैस्पर zebrafish 36) के रूप में भी आंतरिक अंगों की दृश्यता को बढ़ाने के लिए मदद करते हैं। यह भी जीवित मछली 37 में विश्लेषण की सुविधा के लिए रिपोर्टर जीन के साथ ट्रांसजेनिक zebrafish उत्पन्न करने के लिए आसान है। क्योंकि zebrafish जीनोम मनुष्यों के साथ संरक्षित है, उनके अध्ययन से प्राप्त जानकारी मनुष्यों 9 में translational परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। विधि teratogens की वजह से जीन की misregulation के बारे में अतिरिक्त जानकारी हासिल करने के लिए इस तरह के स्वस्थानी संकरण में के रूप में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है,।

इथेनॉल जोखिम काफी अस्तित्व को प्रभावित नहीं किया है, लेकिन यह एमए कारण थाrked पिछली रिपोर्टों 5,23,26 के समान दोष। यह दर्शाता है कि हमारे विधि प्रकाशित परिणामों में दोहरा विश्वसनीय है। जबकि नाइट्राइट एक महत्वपूर्ण एकाग्रता और जोखिम के समय के आधार पर प्रभावित किया है किया नाइट्रेट, अस्तित्व पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। अब जोखिम और नाइट्राइट का उच्च स्तर के अस्तित्व पर एक नकारात्मक प्रभाव है, पिछले परिणाम 5 के साथ संगत कर दिया था। हाल ही में यह दिखाया गया है कि अत्यधिक जोखिम नाइट्राइट zebrafish 27 में दोषपूर्ण हृदय वाल्व विकास के कारण होता है, teratogens की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए zebrafish के उपयोग को मान्य।

यह काम कर समाधान की सांद्रता की पुष्टि करने के बाद वे बना रहे हैं महत्वपूर्ण है। नाइट्रेट और नाइट्राइट की सांद्रता में क्रमश: 28 कैडमियम कमी के संशोधनों (USEPA विधि ३५३.३) और diazotization (USEPA विधि ३५४.१) spectrophotometric तरीकों का उपयोग कर मापा जा सकता है। एक और महत्वपूर्ण कदम Parafilm के साथ पेट्री प्लेट कवर करने के लिए evapo कम करने के लिए हैइथेनॉल के राशन यह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। लार्वा अप्रत्याशित मौत (बहुत अधिक या बहुत कम) है, गणना और समाधान की सांद्रता दोहरी जांच।

हाल ही में, एक समान विधि इथेनॉल 29 की टेराटोजेनिक प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि इस पद्धति हमारे विधि यहाँ के समान है, यह केवल शायद समय की एक लंबी अवधि के लिए इथेनॉल के लिए भ्रूण को प्रकाश में लाने की विषाक्तता के कारण, अप करने के लिए 24 घंटे के लिए इथेनॉल के लिए भ्रूण को उजागर करता है। इसके विपरीत, हमारे विधि परीक्षण समाधान दैनिक के प्रतिस्थापन के साथ कई दिनों के लिए नाइट्रेट और नाइट्राइट के लिए भ्रूण को उजागर करता है। यह कम जहरीले रसायनों के परीक्षण के लिए फायदेमंद है।

हम कल्पना है कि हमारे विधि अन्य दवाओं या विशिष्ट पर्यावरण की स्थिति का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, इस पद्धति केवल पानी में घुलनशील अणुओं का परीक्षण करने के लिए सीमित है। कुछ रसायनों के प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता एक और पहलू पर विचार करना है। परीक्षण रसायन प्रकाश sensit कर रहे हैंIve, प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में पेट्री डिश लपेटो। इसके अलावा, विधि एक विशिष्ट वातावरण से लिया क्योंकि प्रयोगशाला zebrafish इष्टतम विकास के लिए (जैसे कि पीएच और चालकता के रूप में) विशिष्ट स्थितियों की आवश्यकता परीक्षण के पानी के लिए अच्छा नहीं है। फिर भी, zebrafish जल्दी से संभावित teratogens की वजह से विकास दोष का निर्धारण करने के लिए एक अनुकूल मॉडल के रूप में कार्य करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DREL/2010 instrument Hach 26700-03
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
KIMAX glass Petri Dish VWR 89001-244
MS-222 Sigma-Aldrich E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent Hach 14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent Hach 14065-99
Parafilm Fisher Scientific 3-374-10
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
S6E stereomicroscope Leica 10446294
Sodium nitrate Fisher Scientific S343
Sodium nitrite Fisher Scientific S347
Transfer pipets Laboratory Products Sales L320072
Glass vials Fisher Scientific 03-338B

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References

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एक मॉडल के रूप Zebrafish नाइट्राइट की क्षमता का आकलन करने के लिए टेराटोजेनिक
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Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A.… More

Keshari, V., Adeeb, B., Simmons, A. E., Simmons, T. W., Diep, C. Q. Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite. J. Vis. Exp. (108), e53615, doi:10.3791/53615 (2016).

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