Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Induktion af Maternal immun aktivering i mus ved Mid-drægtighed Stage med Viral Mimic Poly (I: C)

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53643
Automatic Translation
*1, *1,2, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Introduction

Begrebet maternelle immun aktivering (MIA) stammer fra de epidemiologiske undersøgelser om deltagelse af maternel infektion med autisme og skizofreni en. På grund af fraværet af påviselige replikerende virale patogener i placenta eller føtal hjerne efter maternel virusinfektion 2,3 virkningen af infektionen på afkommet hypotese at være forårsaget af aktivering af moderens immunsystem snarere de patogener selv .

For at belyse forholdet mellem årsag og virkning-sammenhæng mellem MIA og psykiatriske lidelser, injektion af kemisk syntetiseret, viral efterligner dobbeltstrenget RNA polyinosin: polycytidylsyre syre (poly (I: C)) i gravide gnavere har været meget anvendt som dyremodel for MIA 4,5. Poly (I: C) er anerkendt af toll-like receptor 3 (TLR3), og systemisk indgivelse af poly (I: C) inducerer viral-lignende akut inflammatorisk respons. En af de mekanismer, hvorved poly (I: C) produces adfærdsmæssige abnormiteter og neuropatologier hos afkommet er ved at forårsage en ubalance af pro- og antiinflammatoriske cytokiner i maternel-placenta-føtal akse 6. Adskillige grupper har vedtaget MIA model for at forstå ætiologien af psykiatriske lidelser 7, og på grund af de forskellige interesser blandt forskningsgrupper har forskellige tidspunkter af immunaktivering blevet anvendt til at opnå forskellige forstyrrelser på hjernens udvikling og adfærd 7.

The Paul H. Patterson laboratorium på California Institute of Technology vedtager strategi injicere poly (I: C) i gravide mus ved embryonale 12,5 dage (E12.5), der med succes har vist, at MIA er i stand til at fremkalde adfærdsmæssige, neurologiske, og immunologiske ændringer i afkom, der er forbundet med autisme og skizofreni 8-11. Vores tidligere værker viser, at MIA afkom vise adfærdsmæssige abnormiteter (f.eks sociale impairment, kommunikation underskud, gentagne adfærd, angst-lignende adfærd, og latent hæmning underskud 8,10,12), immun dysregulering og cytokiner ubalance 8,13,14, ændring af fostrets hjerne genekspression 15, tab af purkinjecelle i lille lap VII af cerebellum 11, ændring af synaptiske ejendomme i hippocampus 9, gen x miljø interaktion 13, ændring af tarm permeabilitet, og tarm mikrobiota sammensætning 16. Desuden er terapeutiske og profylaktiske strategier også udviklet sig fra dette modelsystem 13,16,17. Ved at inducere MIA E12.5, andre har vist, at MIA producerer føtal mikroglial aktivering og kolinerg udviklingsmæssige ændringer i basale forhjerne 18, stamme specifik interaktion 19, hjerne cerebral synaptosomale ultrastrukturelle abnormiteter, cerebrale mitokondrie respiratoriske kæde hyperfunction abnormalties, nedregulering af cerebrale synaptosomale molekyler 17 ,depressive-lignende adfærd, værdiforringelse i kognition og hippocampus langsigtede (LTP) og underskud af voksne hippocampus neurogenese 20.

Her giver vi en detaljeret metode til at fremkalde MIA E12.5 ved poly (I: C), samt paradigmer hvordan man anvender denne model til at studere ætiologien af ​​autisme og skizofreni. Det er vigtigt at bemærke, at MIA er en risikofaktor for en række lidelser 4, og dens resultater er yderst følsomme over for den tid og fremgangsmåde til induktion samt hold af drægtige moderdyr. Som sådan, selv mindre uoverensstemmelser mellem laboratorier resulterer ofte i lav reproducerbarhed og / eller forskellige fænotyper hos afkommet. Vores metode er specielt designet til dem interesseret i at studere MIA som en risikofaktor miljømæssig for autisme og skizofreni, og den detaljerede beskrivelse, vil hjælpe forskerne forbedre reproducerbarheden af ​​deres data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller blev udført under godkendelse af California Institute of Technology Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1. Forberedelse til Timed-parring Pairs

  1. Brug mindst 6 dæmninger for adfærdsmæssige eksperimenter og 3 til genekspression analyse.
    BEMÆRK: Brug fordoble antallet af estimerede hunmus, idet kun cirka 50% af musene vil være sluttet fra den tidsindstillede-parring.
  2. Brug hunmus uden forudgående graviditet og ved 8-16 ugers alderen.
    BEMÆRK: Kvinde mus, der har forudgående seksuel eksponering for hanmus men har ikke været gravid er acceptable.
  3. House den hunmus sammen og placere burene ved siden af ​​hinanden for at synkronisere deres østrale cyklus. Bruge en standard mus bur med en højde på over 5,5 inches og en 75 kvadrattomme indvendige gulv for at tillade indkapsling af 5 voksne mus. Mærk hver hunmus under anvendelse af en øre punch.

2. Opsætning Tidsindstillet-matING Pair

  1. Opsæt tidsindstillet-parring 0-2 timer før den mørke cyklus begynder. Placer to hunmus i hvert bur. Tag musene og vejes individuelt. Optag legemsvægt hver hunmus.
  2. Placer en hanmus i hvert bur med de to hunmus. Brug trio parring for at minimere fædrene confounding effekt.

3. Vaginal Plug Check (E0.5)

  1. Kontroller hunmus 0-4 timer efter den mørke cyklus slutter. Løft forsigtigt hunmus fra haleroden og lade musen til at fange den trådgitteret, bur top, eller bur kant.
  2. Søg efter tegn på vaginal prop: vaginal prop er en synlig hvidlig masse i skedeåbningen. Hvis stikket ikke er indlysende, forsigtigt indsætte en 200 pi pipettespids i skedeåbningen. Modstand fra koagulering bekræfter vaginalprop formation. Kontroller vaginalprop gang om dagen.
    BEMÆRK: Vaginal stik er kun en indikation af, at samleje har fundet sted, og derfor ikke guarantee graviditet. Vaginalprop kan være vanskeligt at identificere i visse stammer af mus. Søg hjælp fra en erfaren mus omsorgsperson at øge nøjagtigheden af ​​plug identifikation.
  3. Flyt plugged mus til en ny bur og gruppe huse dem. Definer den dag vaginal prop udseende som embryonale 0,5 dage (E0.5).

4. Den E10.5-11.5, Check for graviditet

  1. Løft forsigtigt haleroden og lade musen til at fange den trådgitteret, bur top, eller bur kant. Overhold maven område for at kontrollere for tegn på graviditet, fx en bule i maven (figur 1).
    BEMÆRK: tegn på graviditet er altid mere indlysende ved E11.5 end ved E10.5.
  2. Afvej musene at verificere graviditet. Den gravide mus generelt vejer ca. 20% tungere ved E10.5 og 30% tungere ved E12.5 sammenlignet med en ikke-gravid mus (figur 2). Enkelt hus den gravide mus i rene bure.

5. 20 mg /kg Poly (I: C) Fremstilling

  1. Brug mindst 6 dæmninger per gruppe for adfærdsmæssige eksperimenter og 3 per gruppe for genekspression analyse. Forbered den tilsvarende mængde af poly (I: C) opløsning.
  2. Afvej poly (I: C) pulver i et 50 ml konisk rør at foretage en endelig koncentration på 40 mg / ml. For at minimere og standardisere stress forårsaget af injektionsvolumen, injicere 5 pi af poly (I: C) opløsning for hvert gram musenes kropsvægt (5 pl / g, eller 5 ml / kg). For at inducere MIA, vi injicere 20 mg poly (I: C) pr kg.
    BEMÆRK: Koncentrationen af ​​poly (I: C) opløsning behøves, er (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Eftersom poly (I: C) pulver indeholder 10% poly (I: C), er vi nødt til at foretage en endelig koncentration af (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml poly (I: C) opløsning.
    ADVARSEL: Poly (I: C) pulver er meget lys. Pas på ikke at miste nogen pulver mens overførsel fra spatel til den konisk rør.
  3. Tilsæt tilsvarende mængde 0,9% natriumchlorid (saltvand) ned i den koniske kare og luk hætten. Pulveret opløses ved blidt bølgende saltvand dråber over poly (I: C) pulver, indtil opløsningen er klar. Centrifugeres konisk rør ved 800 xg i 1 min (figur 3C). Foretage poly (I: C) opløsning af 0,22 um filter. Overfør poly (I: C) opløsning til en 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugerør. Valgfrit: Brug en spektrofotometer til at måle forholdet mellem den 260/280 af poly (I: C) opløsning. Sørg forholdet er mellem 1,54-1,82 (figur 3), som beskrevet af producenten. BEMÆRK: saltopløsning anvendes til at opløse poly (I: C) pulver og tjener som kontrol injektion bør være steril og farmaceutisk kvalitet.

6. Saline eller poly (I: C) Injektion af E12.5

  1. Afvejes musen på skalaen, og sæt den tilbage i buret. Brug følgende formel til at beregne mængden af ​​injektion for både saltvand og poly (I: C) mus: legemsvægt (g) ganget med 5 = ønsket injektion volumen (pl). Brug en 0,3 ml insuli sprøjten til at udarbejde den beregnede mængde af saltvand eller 20 mg / kg poly (I: C) opløsning, f.eks 150 pi for en 30 g mus.
  2. pick forsigtigt op musen ved haleroden og placere den på toppen af ​​buret. Håndter musen forsigtigt for at undgå forstyrrende virkninger fremkaldt af stress. Stik nålen, skråspids opad, ved ca. 20 ° i forhold til musen ind i midten af de to øvre brystvorter (figur 4), og injicere saltvand eller poly (I: C) opløsning. BEMÆRK: Nålen bør udskiftes for hver mus efter injektion.
  3. Placer musen tilbage til dets bur. Placer bure i et roligt, lav trafik plads til at undgå de andre confounding effekter.

7. The Day After Poly (I: C) Injection (E13.5)

  1. Tjek de injicerede mus på den følgende morgen. Brug en skala til måling af kropsvægt.
    BEMÆRK: Poly (I: C) injiceret drægtige mus normalt få mindre vægt end saltvand injicerede mus på dagen efter injfdeling.
  2. Forstyr ikke musene, indtil afkommet fødes.

8. Gauge af MIA Afkom

  1. For at minimere forstyrrende virkninger af MIA induktion Følg nedenstående retningslinjer for at måle brugen af ​​MIA afkom.
    1. Udeluk kuldene fra tidligt fødte eller forsinket fødsel, eller hvis kuldstørrelsen er mindre end 5.
    2. Afliv de overdrevne unger ved CO 2, hvis kuldstørrelsen er større end 10.

9. Valgfrit: Undersøg akut inflammatorisk respons efter MIA

  1. Sacrifice den gravide mus 3 timer efter saltvand eller poly (I: C) injektion ved metoden beskrevet i institutionens dyr pleje udvalg-godkendt protokol.
    BEMÆRK: Cervikal dislokation foretrækkes ofte, da det minimerer effekten af CO 2 / eutanasi narkotika på dæmningen og foster.
  2. Saml milten fra de voksne gravide mus og isolere placenta og fosterets bhi under stereomikroskop.
    1. For milt indsamling, lægge musen på dissektion plade og spray 70% ethanol på maveregionen af ​​de gravide mus. Brug et par steril saks for at gøre et lodret snit i centrum af abdominale område under brystkassen gennem huden.
    2. Milten sidder i den venstre overlegen abdominal kvadrant. Brug pincet til isolering milten. Rul milten på vanskelige opgave vinduesviskere at fjerne fedtvævet omkring orglet. Saml ca 50 mg milt væv og placere dem enkeltvis i Eppendorf-rør med 500 pi RNA stabilisere buffer eller TRIzol at forhindre nukleinsyre nedbrydning. prøverne ved -80 ° C fryser lagre indtil anvendelse.
    3. For placenta samling, forsigtigt trække livmoderhornene fra kroppen. Placer livmoderhornene i en petriskål fyldt med autoklaveret phosphatbufret saltvand (PBS) og henstår skålen på is. Brug to pincet til at rive åbne livmodervæggen og eksponere fosterhinden.
      1. Brug forsigtigt pincet til at åbne fosterhinden uden at beskadige placenta og fosteret. Adskil placenta fra fosteret og klippe navlestrengen så tæt på placenta som muligt. Fjern fosterhinden vragrester fra moderkagen. Placer placenta individuelt i Eppendorf-rør med 500 pi RNA stabilisere buffer eller TRIzol. Prøven opbevares ved -80 ° C fryser indtil brug.
    4. For føtal hjerne indsamling, gemme fosteret i RNA stabilisere buffer fra trin 9.2.2 til dissektion. Tease off pial membran fra ventrikel i hjernen ved hjælp af sarte # 5 pincet under stereomikroskop. Fjern forsigtigt alle membranen fra føtal hjerne. Placer føtale hjerner individuelt i Eppendorf-rør med 500 pi RNA stabilisere buffer eller TRIzol. Prøven opbevares ved -80 ° C fryser indtil brug.
  3. Ekstrahere RNA fra vævet og konvertere RNA til cDNA. Analyser IL6 genekspression i cDNA ved real-time PCR.
  4. Ekstrahere RNA fra vævene ved at følge fremstilling protokol af TRIzol. Hvis vævene opbevares i RNA stabilisering buffer. Optø prøven og spin ned bufferen. Overfør vævet ved spidsen til et andet Eppendorf-med 500 pi TRIzol og fortsætte RNA-ekstraktion.
  5. Brug et spektrofotometer til at måle koncentrationen, 260/280 og 260/230 forholdet mellem RNA. Sørg forholdene er over 2,0.
  6. Fjerne DNA-kontaminering af behandlet RNA med DNase I. Bland 1 ug RNA, 1 pi 10X reaktionsbuffer, 1 pi RNase-fri DNase, og nuclease-frit vand til et endeligt volumen på 10 pi. Inkubér master mix ved 37 ° C i 30 min. Tilsæt 1 pi DNase stop-løsning til at afslutte reaktionen. Inkuber blandingen ved 65 ° C i 10 min.
  7. Revers transkribere RNA til cDNA. Brug 20 pi reaktioner, og op til 1 ug totalt RNA pr reaktion. Bland 4 pi 5x revers transkription (RT) reaktion mix puffer, 1 pi reverse transkriptase, til 11 pi RNA-template efter behandlingen med DNase I og 4 pi nuclease-free H2O foretage en endelig 20 ul opløsning. Programmer den termiske variator betingelser for RT. En generisk tilstand omfatter: Trin 1: 25 ° C i 5 minutter; Trin 2: 42 ° C i 30 minutter; Trin 3: 85 ° C i 5 minutter; Trin 4: hold ved 4 ° C. Fortynd cDNA 5 gange. For kortvarig opbevaring, opbevare cDNA ved 4 ° C. Til langvarig lagring, fryse cDNA'et ved -20 ° C.
  8. Analyser IL6 genekspression i cDNA'et ved real-time PCR og normalisere IL6-genekspression til p-actin-genekspression.
    1. Lav en master mix for IL6 og β-actin afsløring. Brug 25 pi reaktion, master mix for hvert gen omfatter 12,5 pi SYBR Green Mix, 0,5 pi 10 pM forward primer, 0,5 pi 10 pM revers primer og 6,5 pi nuclease-free H 2 O.
    2. Placer 5 pi 5x fortyndet cDNA ent bunden af ​​brønd i optiske 96 brønde reaktion plade. Pipetter 20 pi mester mix til hver brønd for at foretage en endelig 25 pi PCR-blanding. Tredobbelte hvert gen for hver prøve. Forsegl pladen ved hjælp af optisk selvklæbende film. Spin ned pladen ved 800 x g i 3 minutter ved 4 ° C Brug standard program for real-time PCR: Trin 1: 50 ° C i 2 minutter; Trin 2: 95 ° C i 10 minutter; Trin 3: 40 cyklusser af 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Tilføj en ekstra skridt for dissociation kurve.

10. Undersøge adfærdsmæssige abnormiteter i MIA Voksen Afkom (valgfri):

  1. Udfør adfærd tests i alderen 8-12 uger. Skift buret strøelse mindst 3 dage før prøven. Akklimatisere musene til adfærdsmæssig testning værelse mindst 30 minutter før testen.
  2. For præpulsinhibering (PPI), begrænse musene i plexiglas cylinder med en piezoelektrisk sensor under den. Akklimatisere musene til PPIkammer i 5 min. Udsætte musene med 6 forsøg med 120 dB hvid støj (startle).
  3. Så udsætte musene med randomiserede blandinger af 14 forsøg med baggrundsstøj, 14 forsøg med Startle, 14 forsøg med prepulse 5 dB (5 dB højere end baggrundsstøjen) + Startle (PPI5), og 14 forsøg med prepulse 15 dB (15 dB højere end baggrundsstøjen + Startle (PPI15).
  4. Gennemsnit startle respons for de første 6 forsøg med 120 dB forsøg. Gennemsnit startle respons for de andre individuelle stimulationer. Skjult værdien til præpulsinhibering ved (Startle - PPI5 eller PPI15) / Startle.
  5. For open-field test, placere musen i hjørnet af en åben plads arena (50 x 50 x 50 cm 3). Optag bane af musen i 10 min gennem en loftmonteret kamera. Definer midten af arenaen som centrum zone (17 x 17 cm 2). Kvantificer den tilbagelagte afstand, center zone indgange, og tid tilbragt i midten zone manuelt eller ved billedbaseret automatisk analyse software. Til marmor nedgravning test, akklimatisere musen til en test bur med komprimeret 5cm dyb, ren, Aspen fyrretræ strøelse i 10 min. Retur musen til sin homecage. Anbring forsigtigt 20 marineblå 1,5 cm glas diameter kugler i mode af 4 x 5 arrangement. Placer musen tilbage til testen bur med kugler i 10 min. Tæl kuglerne, der er blevet begravet i 10 min test varighed.

11. Undersøg cerebellare Neuropatologi i MIA Voksen Afkom (valgfrit):

  1. Aflive saltvand og MIA voksen afkom efter bedøvelse. Perfundere musen med 50 ml PBS og derefter 50 ml 4% paraformaldehyd gennem det kardiovaskulære system.
  2. Fjern hjernen omhyggeligt og efterudfastsætte hjernen i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C. Skyl hjernen med PBS tre gange og gemme hjernen i PBS med 0,02% natriumazid i et 4 ° C køleskab indtil anvendelse.
    BEMÆRK: bagved hjerne kan opbevares i PBS med 0,02% sodium azid i køleskabet i op til en måned.
  3. § hjernen til 50 um tynde skiver sagittalt hjælp vibratome. Saml hjernen sektioner ved hjælp af en blød børste pen. Ophæve endogen peroxidaseaktivitet ved at inkubere de afsnit på 0,6% hydrogenperoxid i 30 min ved stuetemperatur.
  4. Inkuber de afsnit på anti-calbindin antistof fortyndet i den blokerende buffer (10% gedeserum med 0,1% Triton X-100 og 0,02% natriumazid i PBS) natten over ved stuetemperatur. Derefter inkuberes snittene i tilsvarende biotinyleret sekundært antistof fortyndet i blokeringsbuffer i 2 timer ved stuetemperatur.
  5. Inkuber sektionerne i avidin DH - Biotinyleret peroxidase H kompleks buffer at detektere biotin i 1 time ved stuetemperatur. Udvikle de sektioner ved hjælp af peroxidasesubstrat at visualisere antigen. Vask sektionerne med PBS tre gange i mellem trinnene. Monter afsnittene på objektglas. Billede sektionerne under lup.

    6. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injektion på 20 mg / kg poly (I: C) ved E12.5 kunne fremkalde en akut inflammatorisk respons i maternel-placenta-føtal akse og udfælde en kronisk virkning som hjernens udvikling og adfærdsmæssige fænotyper 12,13. Forhøjede niveauer af et proinflammatorisk cytokin, Interleukin (IL) -6, er en pålidelig indikator for akut inflammatorisk respons efter MIA. Spidsbelastningen for IL6 genekspression i moderkagen og føtal hjerne er på 3 timer efter poly (I: C) injektion 12,13. Vi har vist, at poly (I: C) inducerer højere IL6 genekspression tværs af maternel milt-placenta-føtal hjerne (figur 5) (Data tilpasset fra Wu et al, 2015.) 13. Forskere kan kombinere dette paradigme med anden behandling for at studere de faktorer, der kan ændre akut inflammatorisk respons efter MIA, f.eks maternelle kost, genetiske mutante mus, anti-inflammatoriske lægemidler, osv.

ent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> På den anden side, adfærdsændringer er også kendetegnende for MIA model Adskillige adfærdsmæssige test kan udføres på MIA voksen afkom at demonstrere forskellige autistisk og skizofren-agtig. adfærd. Generelt, når der sammenlignes med saltopløsning afkom, MIA afkom vise færre indgange center zone og kortere varighed center zone tilbragt i åben-felttest. De viser også hyppigere Burying adfærd i marmor begraver test og lavere PPI (figur 6) (data tilpasset fra Wu et al., 2015) 13. Tab af Purkinje-celler i cerebellum lille lap VII er et andet kendetegn for MIA afkom (Shi et al., 2009). Når farvet med calbindin antistof, der er færre calbindin-positive Purkinje celler i cerebellum lobule VII i MIA afkom sammenlignet saltopløsningskontrollen afkom (figur 7).

3643 / 53643fig1.jpg "/>
Figur 1. Tegnet af gravide mus. Mid-drægtighed mus kan identificeres ved den bule i sin mave område (pil). Indavlede C57BL / 6 mus stamme bruges her som et eksempel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. ændringer i kropsvægt hos gravide C57BL / 6N mus fra embryonale (E) 0.5-12.5 dage. Ved sammenligning af gravide og ikke-gravide mus med vaginal propper til stede på E0.5, den (A) legemsvægt og (B) procentdel af kropsvægten undergår en dramatisk stigning i E10.5 i drægtige mus. Gravide n = 10, ikke-gravide n = 5. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. *** P <0,001, ****p <0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Absorbans måling af poly (I: C).. Løsning Sørg 260/280 forholdet er mellem 1,54-1,82 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Poly (I: C) injektion ved embryonal (E) 12,5 dage Scruff den gravide mus forsigtigt.. Injektionsstedet er placeret på midtpunktet af de øverste brystvorter. Injicer nålen, skråspids opad, ved ca. 20 ° vinkel i forhold til mus. Inbred C57BL / 6 mus stamme bruges her som et eksempel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Poly (I: C) injektion øger IL6-genekspression i milt-placenta-føtal hjerne akse dæmningen Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM.. * P <0,05, ** p <0,01 (Dataene er oprindeligt fra Wu et al., 2015 og modificeret til artikel 13). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. & #160;. MIA voksen afkom udviser adfærdsmæssige abnormiteter i forbindelse med endophenotypes af autisme og skizofreni I det åbne-felttest, MIA afkom (A) ind i centrum zone mindre hyppigt og (B) bruge mindre tid i midten zone. (C) I marmor nedgravning test, MIA afkom begrave flere kugler end saltvand kontrol afkom. MIA afkom udviser præpulsinhibering (PPI) underskud i (D) prepulse 5 dB og (E) prepulse 15 dB. Middel ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Dataene er oprindeligt fra Wu et al., 2015 og modificeret til artikel 13). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. MIA voksen afkom udviser neuropatologiske abnormiteter i forbindelse med endophenotypes af autisme. Tab af Purkinje-celler i lobule VII er vist i MIA voksen afkom. Pil: calbindin + Purkinje celler. ML: molekylær lag, GCL: granulat cellelag, PCL:. Purkinjecelle lag Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MIA induktion ved forskellige tidsvinduer forstyrrer forskellige hjerne udvikling begivenheder i gnavere, og dermed fører til forskellige adfærdsmæssige abnormiteter og neuropatologier hos afkommet. Her beskrev vi en protokol til at fremkalde MIA i mus med poly (I: C) injektion ved E12.5. Denne metode til MIA induktion fører til adfærdsmæssige, neurologiske, immunologiske og gastrointestinale abnormiteter forbundet med autisme og skizofreni hos afkommet 8,10,11,16. Det er vigtigt at bemærke, at, fordi MIA er en miljømæssig risikofaktor, forventes fænotypen af ​​afkommet at have højere variation end mus fra genetiske modeller af neurologiske lidelser. Således præcist og konsistent generere autisme og skizofreni-relaterede fænotyper gennem MIA, er det især vigtigt at minimere yderligere variabler, der kan forvirre resultaterne.

Fremgangsmåden beskrevet i protokollen tidslinjen bør følges tætly. Korrekt injektion vindue tid ville sikre, at MIA forstyrrer afkommet hjernens udvikling på det ønskede tidspunkt. Induktion af MIA E12.5 i mus svarer til forstyrrelser nær slutningen af første trimester i menneskelig drægtighedsperioden 21 - en periode, hvor betydelig hjernens udvikling sker, herunder udvikling af Purkinjeceller og putamen putamen, og neurogenese i kortikale lag. Yderligere undersøgelser vil være behov for at bevise sammenhængen mellem tabet af Purkinjeceller i MIA lillehjernen og den tidlige forstyrrelse af hjernens udvikling.

Mens konsekvent behandling, undersøgelse, og selv hold af dæmningerne vil minimere effekten af ​​moderens stress på afkommet fænotype, vores protokol indeholder stadig forbehold, at forskere skal være opmærksom på. For eksempel, Single vi hus dæmningerne dagen før injektionen af ​​poly (I: C) og i hele resten af ​​graviditeten. Vores strategi er at lade gravide mus i en ugenertd miljø. Imidlertid kunne denne handling fremkalde stress respons i den maternelle miljø. Selv om vi ikke ved, om denne isolation-induceret stress respons forstyrrer udviklingen af ​​afkommet, kan MIA effekt observeres ved at følge vores procedure.

Desuden skal vælges og testes omhyggeligt for MIA induktion stammen og genetiske baggrund af musene. Hidtil er effekten af MIA meste gentaget i vildtype C57BL / 6N mus 8,10,13,16. Andre har også observeret MIA effekt i BTBR muse stamme 19. Det er blevet påvist, at poly (I: C) kunne fremkalde forskellige immunreaktioner i gensplejsede mus 13,22-24, hvilket kan medføre yderligere forstyrrende virkninger på afkommet.

Med hensyn til antallet af biologiske gentagelser, bruger vi mindst 6 kuld per gruppe til adfærdsmæssige eller fysiologiske assays og 3 kuld per gruppe for genekspression, protein eller immunohistokemi tilgange. Vi tester alle afkom inden et kuld stedet for at bruge en eller to unger i et kuld at undgå eksperimentel bias. Vi gennemsnit også data for alt afkom inden et kuld, og bruge dette gennemsnit som et datapunkt (sådan, at n = antallet af kuld) for at undgå uhensigtsmæssige statistik 13. Data fra hvert køn er også samles, fordi ingen indlysende kønsforskel er blevet observeret i MIA-modellen 13.

Rationalet bag måle MIA afkom efter kuldstørrelsen er at minimere variationen forårsaget af moderens sygepleje og omsorg. Kuldstørrelse har vist sig at korrelere med stereotype adfærd hos C57BL / 6-mus 25. Vi spekulere, at dette kunne være på grund af tildeling af ressourcer under moderens sygepleje og omsorg. For at undgå denne confounding effekt, vores standard ønskede kuldstørrelse er 6-10 for C57BL / 6 mus.

Selv når følge protokollen nøje, eksperimentatoren kan enimødegå en overdrevent svag eller uforholdsmæssigt potent immunreaktion hos gravide mus efter poly (I: C) injektion. For at undgå dette, er det vigtigt at validere pyrogene og cytokinogenic aktivitet af forskellige partier af poly (I: C). Forskellige partier og masser af poly (I: C) fra samme selskab kan føre til forskellige niveauer af inflammatorisk respons i mus; påfaldende, at indsprøjte identiske doser af poly: kan (I C) fra forskellige batches resultere i op til 10 fold forskelle i plasma IL-6-niveauer 26. Bestemmelse af doseringen, og batch af poly (I: C) til yderligere MIA eksperiment ved udlæsningen af ​​ikke-gravide kvinder IL-6 målemetode kan medvirke til at reducere variationen i virkning fra MIA induktion.

Hvis det er nødvendigt at ændre doseringen til særlige partier af poly (I: C), er det også vigtigt at tilpasse koncentrationen af ​​poly (I: C) opløsning til injektion, således at injicerede volumen forbliver omtrent 5 pi per gram mus vægt. For eksempel, ifølge den manufacturer procedure, poly (I: C) er angiveligt rekonstitueres ved ~ 10 mg / ml vand til opnåelse af et polynukleotid i fysiologisk phosphatpufret opløsning. Sammenlignet med vores 40 mg / ml opløsning, vil den lavere koncentration øge mængden af ​​injektion ved 4 folder. For gravide mus, kunne en stor mængde buffer indsprøjtning potentielt øge presset på embryoner og indføre uønskede, confounding effekter til afkommet. Derfor vælger vi at opløse poly (I: C) pulver i 0,09% natriumchlorid med en højere slutkoncentration for at reducere mængden af ​​injektion.

IL-6 er valgt til at være markør af akut inflammatorisk respons, fordi tidligere forskning har identificeret IL-6-signalering som en kritisk faktor i mediering af virkningerne af MIA på hjernens udvikling og adfærd. Efter poly (I: C) behandling, IL-6 er den mest opreguleret cytokin i moderens blod og placenta 10,12. Vigtigst, Smith et al. vist, at af fleremeget opreguleres cytokiner, kun IL-6 udstillet både nødvendighed og tilstrækkelighed for induktion af MIA-associeret hjerne og adfærdsmæssige abnormiteter. Det vil sige, maternal injektion af anti-IL-6 effektivt kunne forhindre unormal adfærd og transkriptom abnormiteter i MIA afkom, mens neutraliserende andre cytokiner ikke gjorde 10. Desuden maternal injektion af rekombinant IL-6 alene (uden poly (I: C)) gengiver MIA-associerede transskriptionelle og adfærdsmæssige abnormiteter ses i MIA føtal hjerne og afkom 12,15.

Forhold til andre metoder til at inducere MIA (f.eks lipopolysaccharid (LPS) eller influenza), poly (I: C) er forholdsvis sikker, og giver en nem måde at styre intensiteten af immunresponset. Selvom den inflammatoriske reaktion fremkaldt af maternel poly (I: C) administration er akut og forbigående, dets virkning på afkommet adfærd og hjernens udvikling er dyb. Samlet, når teknikken med at inducere MIA through poly (I: C) injektion på E12.5 er mestret, kan man derefter gå videre til at udføre forskellige adfærdsmæssige og biologiske assays for at undersøge effekten af ​​denne risikofaktor miljømæssig på afkommet. Samtidig kunne man også kombinere metoden med genetiske modifikationer eller andre behandlinger før, under eller efter graviditet at undersøge årsagerne og mulige terapeutiske metoder til autisme og skizofreni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi vil gerne ære den afdøde Dr. Paul H. Patterson for hans bidrag til udviklingen af ​​MIA-model, autisme, og skizofreni forskning. Vi anerkender Sarkis K. Mazmanian for hans store støtte på denne protokol; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni, og Leslie A. Neumann for administrativ bistand; Ali Khoshnan og Jan C. Ko for assistance på optagelserne; Elaine Y. Hsiao og Natalia Malkova til deres råd om MIA induktion; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, og Natalie A. Verduzco for deres ekspert dyrehold. Dette arbejde blev støttet af NIH Conte center Award (NIH 5P50MH086383-04, til Paul H. Patterson); Autisme Speaks (# 7670, til Paul H. Patterson); Simons Foundation (# 322.839, til Sarkis K. Mazmanian); NIH Training Grant (NIH / NRSA T32GM07616 til K.-HC); Caltech Summer Undergraduate Research Fellowship (SURF) (til ZY); Amgen Scholars Program på Caltech (til ZY); og Postdoc Fellowship from National Science Rådet, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, til W.-LW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt SIGMA P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP HOSPIRA NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" COVIDIEN 8881600145
50 ml conical screw cap tubes USA SCIENTIFIC 1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC 1000 Optional
Stereomicroscope Wild Heerbrugg M5A Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm Roboz RS-5045 Optional
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76104 Optional
TRIzol reagent Life Technologies 15596-026  Optional
RQ1 Rnase-free DNase Promega M610A Optional
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8891 Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX  Roche 4913922001 Optional
Real-time PCR ABI 7300 Optional
Primer: Il6 forward Life Technologies TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Optional
Primer: Il6 Reverse Life Technologies TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC Optional
Primer: beta-actin forward Life Technologies AGAGGGAAATCGTGCGTGAC Optional
Primer: beta-actin Reverse Life Technologies CAATAGTGATGACCTGGCCGT Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate Life Technologies 4306737 Optionl
MicroAmp optical adhesive film  Life Technologies 4311971 Optionl
EthoVision Noldus EthoVision Optionl
SR-LAB apparatus (PPI) San Diego Instruments  SR-LAB Optionl
Marbles PENN-PLAX Blue gem stones marbles Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Life Technologies 21600-069 Optionl
Paraformaldehyde MACRON 2621-59 Optionl
Vibratome Leica VT1000 S Optionl
Sodium azide Sigma S2002 Optionl
Triton x-100 Sigma X100 Optionl
Hydrogen peroxide solution Sigma 18312 Optionl
Goat serum Vector Laboratories S-1000 Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody Abcam ab11426 Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody Vector Laboratories BA-1000 Optionl
VECTASTAIN ABC Kit Vector Laboratories PK-4000 Optionl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

Tags

Immunologi Maternal infektion mødre immun aktivering (MIA) polyinosin: polycytidylsyre syre (Poly (I: C)) Embryonale 12,5 dage (E12.5) interleukin-6 (IL-6) Maternal-placental- føtale akse cerebellare Purkinjeceller baghjerne autisme skizofreni adfærdsmæssige abnormiteter
Induktion af Maternal immun aktivering i mus ved Mid-drægtighed Stage med Viral Mimic Poly (I: C)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L.… More

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C). J. Vis. Exp. (109), e53643, doi:10.3791/53643 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter