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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

(सी आई) वायरल नकल पाली के साथ मध्य हमल स्टेज पर चूहे में मातृ प्रतिरक्षा सक्रियण की प्रेरण

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53643
Automatic Translation
*1, *1,2, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Introduction

मातृ प्रतिरक्षा सक्रियण की अवधारणा (मिया) आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन 1 के साथ मातृ संक्रमण की एसोसिएशन पर महामारी विज्ञान के अध्ययन से निकलती है। नाल या मातृ वायरल संक्रमण 2,3 के बाद भ्रूण के मस्तिष्क में पहचाने जाने नकल वायरल रोगजनकों के अभाव के कारण, वंश पर संक्रमण का प्रभाव नहीं बल्कि रोगजनकों खुद से मातृ प्रतिरक्षा प्रणाली की सक्रियता के कारण होता होगा धारणा है ।

polycytidylic एसिड: मिया और मानसिक विकारों, रासायनिक संश्लेषित, वायरल नकल डबल असहाय आरएनए polyinosinic के इंजेक्शन के बीच कारण और प्रभाव के संबंध को स्पष्ट करने के लिए: गर्भवती मूषक में (पाली (मैं सी)) व्यापक रूप से मिया के लिए पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है 4,5। पाली (मैं: सी) टोल की तरह रिसेप्टर 3 (TLR3), और पाली के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा मान्यता प्राप्त है (मैं: सी) वायरल की तरह तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया लाती है। तंत्र में से एक है जो पाली द्वारा (मैं: सी) पीआरoduces व्यवहार असामान्यताएं और वंश में neuropathologies मातृ-अपरा-भ्रूण अक्ष 6 में समर्थक और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स के एक असंतुलन के कारण से है। कई समूहों मानसिक विकारों 7 के एटियलजि समझने के लिए मिया मॉडल को अपनाया है, और अनुसंधान समूहों के बीच विविध हितों के कारण, प्रतिरक्षा सक्रियण के विभिन्न समय अंक मस्तिष्क के विकास और व्यवहार 7 पर अलग perturbations प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

, भ्रूण 12.5 दिनों में गर्भवती चूहों में: (सी आई) (E12.5) है, जो सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है कि मिया व्यवहार, स्नायविक उत्प्रेरण के लिए सक्षम है कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान में पॉल एच पैटरसन प्रयोगशाला पाली इंजेक्शन लगाने की रणनीति को गोद ले और वंश कि आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन 8-11 के साथ जुड़े रहे हैं में प्रतिरक्षा बदल जाता है। हमारे पूर्व काम करता है पता चलता है कि मिया संतानों व्यवहार असामान्यताएं (जैसे, सामाजिक impairmen प्रदर्शितटी, संचार घाटा, दोहराए व्यवहार, चिंता की तरह व्यवहार, और अव्यक्त निषेध घाटा 8,10,12), प्रतिरक्षा अनियंत्रण और साइटोकिन्स असंतुलन 8,13,14, भ्रूण के मस्तिष्क के जीन अभिव्यक्ति 15 की परिवर्तन, खण्ड VII में Purkinje सेल की हानि सेरिबैलम 11, हिप्पोकैम्पस 9 में synaptic गुणों का परिवर्तन, जीन एक्स पर्यावरण बातचीत 13, पेट पारगम्यता के परिवर्तन, और पेट microbiota रचना 16 वर्ष की। इसके अलावा, चिकित्सीय और रोगनिरोधी रणनीतियों भी इस मॉडल प्रणाली 13,16,17 से विकसित कर रहे हैं। E12.5 पर मिया उत्प्रेरण द्वारा, दूसरों से पता चला है कि मिया भ्रूण microglial सक्रियण और बेसल अग्रमस्तिष्क 18 में कोलीनर्जिक विकासात्मक परिवर्तन, तनाव विशिष्ट बातचीत 19, मस्तिष्क मस्तिष्क synaptosomal ultrastructural असामान्यताओं, मस्तिष्क mitochondrial श्वसन श्रृंखला hyperfunction abnormalties, डाउनरेगुलेशन मस्तिष्क synaptosomal अणुओं का उत्पादन 17 से ,अवसादग्रस्तता की तरह व्यवहार, अनुभूति और हिप्पोकैम्पस दीर्घकालिक potentiation (एलटीपी) में परेशानी होती है, और वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस 20 का घाटा।

(सी आई), साथ ही साथ कैसे आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन के एटियलजि अध्ययन करने के लिए इस मॉडल को लागू करने के लिए के मानदंड यहाँ, हम कैसे पाली द्वारा E12.5 पर मिया के लिए प्रेरित करने की एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं। यह ध्यान रखें कि मिया विकारों 4 की एक किस्म के लिए एक जोखिम कारक है महत्वपूर्ण है, और उसके परिणामों समय और प्रेरण की विधि के साथ ही गर्भवती बांधों के पशुपालन के प्रति बेहद संवेदनशील हैं। जैसे, प्रयोगशालाओं के बीच भी मामूली विसंगतियों अक्सर कम reproducibility और / या वंश में अलग phenotypes में परिणाम। हमारे विधि विशेष मिया आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन के लिए एक पर्यावरण जोखिम कारक के रूप में अध्ययन करने में रुचि रखने वालों के लिए बनाया गया है, और विस्तृत विवरण शोधकर्ताओं ने अपने डेटा के reproducibility में सुधार करने में मदद करेगा प्रदान की है।

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Protocol

सभी प्रोटोकॉल प्रौद्योगिकी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (IACUC) के अनुमोदन के तहत प्रदर्शन किया गया।

1. समय पर संभोग जोड़े के लिए तैयारी

  1. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए व्यवहार प्रयोगों के लिए कम से कम 6 बांधों और 3 का प्रयोग करें।
    नोट: यह अनुमान लगाया मादा चूहों की संख्या दोगुनी प्रयोग के रूप में चूहों के बारे में केवल 50% से समय पर संभोग से खामियों को दूर कर दिया जाएगा।
  2. कोई पूर्व गर्भावस्था के साथ और उम्र के 8-16 हफ्तों में मादा चूहों का प्रयोग करें।
    नोट: मादा चूहों नर चूहों से पहले यौन प्रदर्शन किया है लेकिन गर्भवती नहीं किया गया है कि स्वीकार्य हैं।
  3. हाउस मादा चूहों को एक साथ और एक दूसरे के बगल के क्रम में उनकी estrous चक्र सिंक्रनाइज़ करने में पिंजरों जगह है। 5 वयस्क चूहों के आवास अनुमति देने के लिए 5.5 इंच से अधिक की ऊंचाई और एक 75 वर्ग इंच आंतरिक फर्श के साथ एक मानक चूहों पिंजरे का प्रयोग करें। प्रत्येक महिला माउस एक कान पंच का उपयोग लेबल।

2. समय-चटाई की स्थापनाआईएनजी जोड़ी

  1. समय पर संभोग 0-2 घंटा के सेट अप से पहले अंधेरे चक्र शुरू होता है। प्रत्येक पिंजरे में दो मादा चूहों रखें। चूहों बाहर ले जाओ और उन्हें व्यक्तिगत रूप से तौलना। प्रत्येक महिला माउस के शरीर के वजन रिकॉर्ड।
  2. एक पुरुष माउस दो मादा चूहों के साथ प्रत्येक पिंजरे में रखें। पैतृक confounding प्रभाव को कम करने के लिए तीनों को संभोग का प्रयोग करें।

3. योनि प्लग चेक (E0.5)

  1. मादा चूहों 0-4 घंटा के जांच के बाद अंधेरे चक्र समाप्त होता है। धीरे पूंछ के आधार से महिला माउस उठा और माउस के तार ग्रिड, पिंजरे ऊपर, या पिंजरे किनारे हड़पने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. योनि प्लग के संकेत के लिए खोज: योनि प्लग योनि खोलने में एक दृश्य श्वेताभ बड़े पैमाने पर है। अगर प्लग स्पष्ट नहीं है, धीरे योनि खोलने में एक 200 μl विंदुक टिप डालें। जमावट से प्रतिरोध योनि प्लग गठन की पुष्टि करता है। प्रति दिन एक बार योनि प्लग की जाँच करें।
    नोट: योनि प्लग केवल एक संकेत है कि शयन हुआ है नहीं है जी है, और इसलिएuarantee गर्भावस्था। योनि प्लग चूहों के कुछ उपभेदों में पहचान करना मुश्किल हो सकता है। प्लग पहचान की शुद्धता बढ़ाने के लिए एक अनुभवी चूहों देखभालकर्ता से मदद चाहते हैं।
  3. एक नए पिंजरे में खामियों को दूर चूहों ले जाएँ और समूह उन्हें घर। भ्रूण 0.5 दिन (E0.5) के रूप में योनि प्लग उपस्थिति के दिन को परिभाषित करें।

4. E10.5-11.5 पर, गर्भावस्था की जाँच

  1. धीरे पूंछ के आधार उठा और माउस के तार ग्रिड, पिंजरे ऊपर, या पिंजरे किनारे हड़पने के लिए अनुमति देते हैं। गर्भावस्था, जैसे, पेट में एक उभार (चित्रा 1) के संकेत के लिए जाँच करने के लिए पेट क्षेत्र का निरीक्षण करें।
    नोट: गर्भावस्था के हस्ताक्षर हमेशा E10.5 की तुलना में E11.5 में अधिक स्पष्ट है।
  2. चूहों का वजन गर्भावस्था की पुष्टि करें। गर्भवती माउस आम तौर पर E10.5 पर के बारे में 20% और 30% भारी एक गैर गर्भवती माउस (चित्रा 2) की तुलना में E12.5 पर भारी वजन का होता है। एकल घर को साफ पिंजरों में गर्भवती चूहों।

5. 20 मिलीग्राम /किलो पाली (मैं: सी) तैयारी

  1. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए व्यवहार प्रयोगों के लिए समूह के अनुसार कम से कम 6 बांधों और 3 समूह प्रति का प्रयोग करें। समाधान: पाली (सी आई) के लिए इसी राशि से तैयार करें।
  2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में: (सी आई) के पाउडर 40 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए पाली वजन। आदेश में कम से कम और इंजेक्शन की मात्रा की वजह से तनाव का मानकीकरण करने, पाली के 5 μl इंजेक्षन में (मैं: सी) माउस शरीर के वजन (5 μl / जी, या 5 मिलीग्राम / किग्रा) के प्रत्येक ग्राम के लिए समाधान। (सी आई) प्रति किलो मिया को प्रेरित करने के लिए, हम पाली के 20 मिलीग्राम इंजेक्षन।
    नोट: पाली की एकाग्रता (मैं: सी) समाधान की जरूरत (20 मिलीग्राम / किग्रा) / (5 मिलीग्राम / किग्रा) = 4 मिलीग्राम / एमएल है। पाली के बाद से (मैं: सी) पाउडर 10% पाली शामिल समाधान (मैं: सी), हम (4 मिलीग्राम / एमएल) /0.1= 40 मिलीग्राम / पाली की मिलीलीटर (सी आई) के एक अंतिम एकाग्रता बनाने की जरूरत है।
    चेतावनी: पाली (मैं: सी) पाउडर बहुत हल्का है। किसी भी पाउडर में खोने के लिए नहीं है, जबकि शंक्वाकार ट्यूब रंग से स्थानांतरित सावधान रहें।
  3. 0.9% सोडियम क्लोराइड (खारा) की इसी मात्रा शंक्वाकार टब में जोड़ेई और टोपी को बंद करें। (सी आई) के पाउडर जब तक समाधान स्पष्ट है धीरे पाली खत्म खारा छोटी बूंद रोलिंग द्वारा पाउडर भंग। 1 मिनट (चित्रा 3 सी) के लिए 800 XG पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र। (सी आई) 0.22 माइक्रोन फिल्टर के द्वारा समाधान पाली फ़िल्टर। एक 1.5 या 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब: (सी आई) के समाधान पाली स्थानांतरण। वैकल्पिक: समाधान: पाली (सी आई) 260/280 अनुपात को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें। सुनिश्चित अनुपात 1.54-1.82 (चित्रा 3) के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित के बीच है। नोट: खारा पाली भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है (मैं: सी) पाउडर और नियंत्रण इंजेक्शन के रूप में सेवा बाँझ और दवा ग्रेड होना चाहिए।

6. खारा या पाली (मैं: सी) E12.5 पर इंजेक्शन

  1. पैमाने पर माउस वजन और इसे वापस रख पिंजरे में। (सी आई) के चूहों: शरीर के वजन (छ) 5 से गुणा = वांछित इंजेक्शन की मात्रा (μl) दोनों खारा और पाली के लिए इंजेक्शन की मात्रा की गणना करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें। एक 0.3 मिलीलीटर Insul का प्रयोग करें(सी आई) के समाधान, जैसे, एक 30 ग्राम माउस के लिए 150 μl सिरिंज में खारा की गणना की मात्रा या 20 मिलीग्राम / किग्रा पाली को आकर्षित करने के लिए।
  2. धीरे पूंछ के आधार द्वारा माउस लेने के लिए और पिंजरे के शीर्ष पर जगह है। धीरे माउस को संभालने के तनाव से प्रेरित confounding प्रभाव से बचने के लिए। सुई डालें, ऊपर बेवल, लगभग 20 डिग्री अपने दो ऊपरी निपल्स (चित्रा 4) के केंद्र में माउस के सापेक्ष, और खारा या पाली (मैं: सी) इंजेक्षन समाधान। ध्यान दें: सुई इंजेक्शन के बाद प्रत्येक माउस के लिए प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।
  3. माउस वापस अपने घर पिंजरे में रखें। एक शांत, कम यातायात कमरे में पिंजरों स्थान अन्य confounding प्रभाव से बचने के लिए।

7. डे पाली के बाद (मैं: सी) इंजेक्शन (E13.5)

  1. निम्नलिखित सुबह इंजेक्शन चूहों की जाँच करें। शरीर के वजन को मापने के लिए पैमाने का प्रयोग करें।
    नोट: पाली (मैं: सी) इंजेक्शन गर्भवती चूहों आमतौर पर कम वजन खारा inj के बाद दिन पर इंजेक्शन चूहों की तुलनाection।
  2. चूहों को परेशान तक संतानों के जन्म लेते हैं मत करो।

8. मिया वंश के गेज

  1. आदेश मिया प्रेरण के confounding प्रभाव को कम करने के लिए, मिया संतानों का उपयोग गेज करने के लिए नीचे सूचीबद्ध दिशा निर्देशों का पालन करें।
    1. litters को बाहर निकालें अपरिपक्व या देरी जन्म से, या यदि कूड़े आकार 5 से छोटी है।
    2. सीओ 2 द्वारा अत्यधिक पिल्ले Euthanize यदि कूड़े आकार 10 से बड़ा है।

9. वैकल्पिक: तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया मिया के बाद जांच करते हैं

  1. इंजेक्शन विधि संस्था के जानवरों की देखभाल समिति को मंजूरी दी प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग: के बाद खारा या पाली (सी आई) के गर्भवती चूहों 3 घंटा बलिदान।
    नोट: सरवाइकल अव्यवस्था अक्सर के रूप में यह बांध और भ्रूण पर सीओ 2 / इच्छामृत्यु दवाओं के प्रभाव को कम करता पसंद किया जाता है।
  2. वयस्क गर्भवती चूहों से तिल्ली लीजिए और नाल और भ्रूण ब्रा को अलग-थलगstereomicroscope के तहत में।
    1. तिल्ली संग्रह के लिए, विच्छेदन प्लेट पर माउस रख दी है और गर्भवती चूहों के पेट क्षेत्र पर स्प्रे 70% इथेनॉल। त्वचा के माध्यम से ribcage नीचे पेट क्षेत्र के केंद्र में एक खड़ी कटौती करने के लिए बाँझ कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें।
    2. तिल्ली बाईं बेहतर पेट चक्र में बैठता है। तिल्ली को अलग-थलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। नाजुक कार्य वाइपर पर तिल्ली रोल अंग के आसपास वसा ऊतकों को हटाने के लिए। प्लीहा ऊतक का लगभग 50 मिलीग्राम ले लीजिए और 500 μl शाही सेना के साथ Eppendorf ट्यूब में उन्हें व्यक्तिगत रूप से जगह बफर या TRIzol स्थिर न्यूक्लिक एसिड गिरावट को रोकने के। उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों की दुकान।
    3. नाल संग्रह के लिए, धीरे शरीर से गर्भाशय सींग बाहर खींच। Autoclaved फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ भरा एक पेट्री डिश में गर्भाशय सींग की जगह और बर्फ पर पकवान छोड़ दें। गर्भाशय की दीवार खुला आंसू और एमनियोटिक थैली बेनकाब करने के लिए दो संदंश का प्रयोग करें।
      1. ध्यान से नाल और भ्रूण को नुकसान पहुँचाए बिना एमनियोटिक थैली खोलने के लिए संदंश का उपयोग करें। भ्रूण से नाल को अलग करें और गर्भनाल के रूप में संभव के रूप में नाल के करीब काटा। नाल से एमनियोटिक थैली मलबे निकालें। नाल व्यक्तिगत रूप से Eppendorf ट्यूब 500 μl शाही सेना के साथ बफर या TRIzol को स्थिर में रखें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर उपयोग करें जब तक नमूना स्टोर।
    4. भ्रूण के मस्तिष्क के संग्रह के लिए, भ्रूण शाही सेना में कदम 9.2.2 से बफर स्थिर विच्छेदन जब तक दुकान। मस्तिष्क stereomicroscope के तहत नाजुक # 5 संदंश का उपयोग करने का वेंट्रिकल से pial झिल्ली बंद छेड़ो। ध्यान से भ्रूण के मस्तिष्क से सभी झिल्ली को हटा दें। भ्रूण के दिमाग को व्यक्तिगत रूप से Eppendorf ट्यूब 500 μl शाही सेना के साथ बफर या TRIzol को स्थिर में रखें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर उपयोग करें जब तक नमूना स्टोर।
  3. ऊतक से शाही सेना निकालें और सीडीएनए शाही सेना में परिवर्तित। वास्तविक टी द्वारा सीडीएनए में Il6 जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषणIME पीसीआर।
  4. TRIzol के निर्माण प्रोटोकॉल का पालन करते हुए ऊतकों से शाही सेना निकालें। ऊतकों आरएनए स्थिरीकरण बफर में जमा हो जाती है। नमूना गला लें और बफर नीचे स्पिन। साथ 500 μl TRIzol एक और Eppendorf को टिप द्वारा ऊतक स्थानांतरण और आरएनए निकासी जारी है।
  5. एकाग्रता, 260/280 और 260/230 शाही सेना के अनुपात को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें। सुनिश्चित अनुपात में 2.0 से ऊपर हैं।
  6. 10 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए DNase मैं मिक्स 1 माइक्रोग्राम आरएनए के साथ शाही सेना में इलाज, 1 μl 10X प्रतिक्रिया बफर, 1 μl RNase मुक्त DNase, और nuclease मुक्त पानी से डीएनए प्रदूषण को खत्म। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मास्टर मिश्रण सेते हैं। 1 μl DNase स्थान पर समाधान प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए जोड़ें। 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
  7. सीडीएनए शाही सेना नक़ल उल्टा। 20 μl प्रतिक्रियाओं का प्रयोग करें, और ऊपर 1 प्रतिक्रिया प्रति कुल शाही सेना के माइक्रोग्राम करने के लिए। 4 μl मिक्स 5x प्रतिलेखन (आरटी) प्रतिक्रिया मिश्रण बफर रिवर्स, 1 μl फिरनाERSE ट्रांसक्रिप्टेज, DNase मैं और 4 μl nuclease मुक्त एच 2 ओ के साथ उपचार के बाद 11 μl आरएनए टेम्पलेट एक अंतिम 20 μl समाधान बनाने के लिए। आरटी के लिए थर्मल साइक्लर की स्थिति कार्यक्रम। एक सामान्य हालत में शामिल हैं: चरण 1: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस; चरण 2: 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस; चरण 3: 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस; चरण 4: 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़। सीडीएनए पतला 5 बार। छोटी अवधि के भंडारण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए की दुकान। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए फ्रीज।
  8. वास्तविक समय पीसीआर द्वारा सीडीएनए में Il6 जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और बीटा actin के लिए जीन अभिव्यक्ति Il6 जीन अभिव्यक्ति मानक के अनुसार।
    1. Il6 और β-actin का पता लगाने के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाओ। 25 μl प्रतिक्रिया का प्रयोग करें, प्रत्येक जीन के लिए मास्टर मिश्रण 12.5 μl SYBR ग्रीन मिक्स, 10 माइक्रोन के आगे प्राइमर के 0.5 μl, 10 माइक्रोन के रिवर्स प्राइमर और 6.5 μl nuclease मुक्त एच 2 ओ के 0.5 μl शामिल
    2. जगह 5 μl 5x पतला सीडीएनए एकऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया थाली की अच्छी तरह से नीचे टी। पिपेट प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मास्टर मिश्रण के 20 μl एक अंतिम 25 μl पीसीआर मिश्रण बनाने के लिए। प्रत्येक नमूना के लिए प्रत्येक जीन तीन प्रतियों। ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म का उपयोग करके प्लेट सील। नीचे वास्तविक समय पीसीआर के मानक कार्यक्रम 4 डिग्री सेल्सियस उपयोग पर 3 मिनट के लिए 800 XG पर प्लेट स्पिन: चरण 1: 50 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए; चरण 2: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; चरण 3: 15 सेकंड और तापमान 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों। हदबंदी वक्र के लिए एक अतिरिक्त कदम जोड़ें।

10 की जांच करने मिया वयस्क संतानों में व्यवहार असामान्यताएं (वैकल्पिक):

  1. 8-12 हफ्तों की उम्र में व्यवहार परीक्षण प्रदर्शन करना। कम से कम 3 दिनों के परीक्षण से पहले पिंजरे बिस्तर बदलें। व्यवहार परीक्षण के कमरे के परीक्षण से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए चूहों acclimate।
  2. prepulse निषेध (पीपीआई) के लिए, इसे नीचे एक पीजो इलेक्ट्रिक सेंसर के साथ plexiglass सिलेंडर में चूहों को नियंत्रित। पल्स पोलियो टीकाकरण के लिए चूहों acclimate5 मिनट के लिए चैम्बर। 120 डीबी सफेद शोर (डराना) के 6 परीक्षण के साथ चूहों को बेनकाब।
  3. फिर 15 डीबी (15 डीबी उच्च पृष्ठभूमि शोर के 14 परीक्षण, डराना के 14 परीक्षण, prepulse 5 डीबी (5 DB पृष्ठभूमि शोर से अधिक) + डराना (PPI5) के 14 परीक्षण, और prepulse की 14 परीक्षणों के बेतरतीब मिश्रण के साथ चूहों का पर्दाफाश पृष्ठभूमि शोर + डराना (PPI15) की तुलना में।
  4. 120 डीबी परीक्षणों के पहले 6 परीक्षण के लिए डराना प्रतिक्रिया औसत। अन्य व्यक्ति stimulations के लिए डराना प्रतिक्रिया औसत। (- PPI5 या PPI15 डराना) / डराना द्वारा prepulse निषेध करने के लिए मूल्य गुप्त।
  5. खुले क्षेत्र परीक्षण के लिए, एक खुले मैदान वर्ग (50 x 50 x 50 सेमी 3) के कोने में माउस जगह है। एक छत पर चढ़कर कैमरा के माध्यम से 10 मिनट के लिए माउस की गति रिकॉर्ड। केंद्र क्षेत्र (17 x 17 सेमी 2) के रूप में मैदान के केंद्र को परिभाषित करें। दूरी की यात्रा की, केंद्र क्षेत्र प्रविष्टियों, और समय स्वयं या छवि के आधार पर स्वत: विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा केंद्र क्षेत्र में खर्च यों। संगमरमर दफन परीक्षण के लिए, 10 मिनट के लिए संकुचित 5 सेमी गहरी, स्वच्छ, एस्पेन पाइन बिस्तर के साथ एक परीक्षण पिंजरे के लिए माउस acclimate। इसकी homecage करने के लिए माउस लौटें। धीरे 4 एक्स 5 व्यवस्था के फैशन में 20 गहरे नीले रंग 1.5 सेमी व्यास कांच के पत्थर जगह है। माउस वापस 10 मिनट के लिए पत्थर के साथ परीक्षण के पिंजरे में रखें। पत्थर है कि 10 मिनट के परीक्षण अवधि में दफन कर दिया गया है गिनो।

11. जांच करते मिया वयस्क संतानों में अनुमस्तिष्क तंत्रिकाविकृति विज्ञान (वैकल्पिक):

  1. खारा और संवेदनाहारी द्वारा मिया वयस्क संतानों euthanize। हृदय प्रणाली के माध्यम से 50 मिलीलीटर पीबीएस के साथ माउस और बाद में 50 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde छिड़कना।
  2. मस्तिष्क ध्यान से निकालें और 4 में रात भर 4% paraformaldehyde में मस्तिष्क पोस्टफिक्स सी। पीबीएस के साथ मस्तिष्क कुल्ला तीन बार और एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज उपयोग करें जब तक में 0.02% सोडियम azide के साथ पीबीएस में मस्तिष्क की दुकान।
    ध्यान दें: postfixed मस्तिष्क 0.02% वतन के साथ पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता हैएक महीने तक के लिए फ्रिज में IUM azide।
  3. धारा 50 माइक्रोन से पतली स्लाइस में मस्तिष्क sagittally vibratome का उपयोग। एक नरम ब्रश पेन का उपयोग कर मस्तिष्क वर्गों लीजिए। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.6% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में वर्गों incubating द्वारा अंतर्जात peroxidase गतिविधि बर्खास्त।
  4. रात भर कमरे के तापमान पर विरोधी Calbindin एंटीबॉडी अवरुद्ध बफर (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 और 0.02% सोडियम azide के साथ 10% बकरी सीरम) में पतला में वर्गों सेते हैं। फिर इसी biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर में पतला में वर्गों सेते हैं।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बायोटिन पता लगाने के लिए Biotinylated peroxidase एच जटिल बफर - avidin डीएच में वर्गों सेते हैं। peroxidase सब्सट्रेट का उपयोग प्रतिजन कल्पना करने से वर्गों का विकास करना। कदम के बीच में तीन बार पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट। छवि खुर्दबीन के नीचे वर्गों।

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Representative Results

20 मिलीग्राम / किग्रा पाली का इंजेक्शन: E12.5 पर (मैं सी) मातृ-अपरा-भ्रूण अक्ष में एक तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया आह्वान और मस्तिष्क के विकास और व्यवहार phenotypes 12,13 करने के लिए एक पुरानी प्रभाव वेग सकता है। एक proinflammatory साइटोकाइन का ऊंचा स्तर, इंटरल्युकिन (IL) -6, मिया के बाद तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक विश्वसनीय सूचक है। इंजेक्शन 12,13: नाल में Il6 जीन अभिव्यक्ति और भ्रूण के मस्तिष्क के लिए पीक समय 3 घंटे बाद पाली (सी आई) पर है। हम जानते हैं कि पाली से पता चला है (मैं: सी) मातृ तिल्ली-नाल-भ्रूण के मस्तिष्क के पार उच्च Il6 जीन अभिव्यक्ति (चित्रा 5) लाती (वू से अनुकूलित डेटा एट अल, 2015।) 13। शोधकर्ताओं का कारक है कि मिया के बाद तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया, जैसे, मातृ आहार, आनुवंशिक उत्परिवर्ती चूहों, विरोधी भड़काऊ दवाओं, आदि को बदल सकता है अध्ययन करने के लिए अन्य उपचार के साथ इस प्रतिमान जोड़ सकता है।

ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> दूसरी ओर, व्यवहार में बदलाव भी मिया मॉडल की पहचान कर रहे हैं कई व्यवहार परीक्षण मिया वयस्क संतानों के विभिन्न ऑटिस्टिक और पागलपन की तरह प्रदर्शित करने के लिए आयोजित किया जा सकता है। व्यवहार। आम तौर पर, जब खारा संतानों की तुलना में, मिया संतानों कम केंद्र जोन प्रविष्टियों और छोटे केंद्र जोन अवधि खुले क्षेत्र परीक्षण में खर्च प्रदर्शित करते हैं। उन्होंने यह भी परीक्षण और निचले पीपीआई (चित्रा 6) दफन संगमरमर में अधिक पाये जाते दफन व्यवहार प्रदर्शित (डेटा अनुकूलित वू से एट अल।, 2015) 13। सेरिबैलम lobule सप्तम में Purkinje कोशिकाओं के नुकसान (मिया वंश की एक और बानगी है शि एट अल।, 2009)। जब Calbindin एंटीबॉडी के साथ दाग, वहाँ कम Calbindin पॉजिटिव सेरिबैलम में Purkinje कोशिकाओं रहे हैं मिया वंश की lobule सातवीं खारा नियंत्रण वंश (चित्रा 7) की तुलना में।

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चित्रा 1. गर्भवती चूहों का संकेत है। मिड-गर्भ माउस अपने पेट क्षेत्र (तीर) में उभार के द्वारा पहचाना जा सकता है। जन्मजात C57BL / 6 माउस तनाव एक उदाहरण के रूप में यहाँ प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
भ्रूण (ई) 0.5-12.5 दिनों से गर्भवती C57BL / 6N चूहों में चित्रा 2. शरीर का वजन बदल जाता है। जब E0.5 में उपस्थित योनि प्लग के साथ गर्भवती और गैर गर्भवती चूहों की तुलना, (ए) शरीर के वजन और (बी) के शरीर के वजन का प्रतिशत गर्भवती चूहों में E10.5 में एक नाटकीय वृद्धि आए। गर्भवती N = 10, गैर गर्भवती एन = 5. डेटा मतलब ± एसई के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। *** पी <0.001, ****पी <0.0001। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. पाली के absorbance माप (मैं: सी)।। समाधान सुनिश्चित करें 260/280 अनुपात 1.54-1.82 के बीच है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. पाली (मैं: सी) भ्रूण (ई) पर इंजेक्शन 12.5 दिनों कूड़ा गर्भवती माउस धीरे।। इंजेक्शन साइट ऊपरी निपल्स के मध्य बिंदु पर स्थित है। , सुई इंजेक्षन अप बेवल, माउस के लिए लगभग 20 डिग्री कोण रिश्तेदार पर। जन्मजात सी 57BL / 6 माउस तनाव एक उदाहरण के रूप में यहाँ प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. पाली (मैं: सी)। इंजेक्शन तिल्ली-नाल-भ्रूण बांध के मस्तिष्क अक्ष डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं में Il6 जीन अभिव्यक्ति बढ़ जाती है। * पी <0.05, ** पी <0.01 (डेटा से वू एट अल।, 2015 और अनुच्छेद 13 के लिए संशोधित मूल रूप है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6। & #160;। मिया वयस्क संतानों आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन की endophenotypes के साथ जुड़े व्यवहार असामान्यताएं प्रदर्शन कर खुले मैदान परीक्षण में, मिया वंश (ए) केंद्र क्षेत्र में कम समय खर्च कम बार केंद्र जोन और (बी) दर्ज करें। (सी) संगमरमर दफन परीक्षण में, मिया संतानों खारा नियंत्रण संतानों से अधिक पत्थर को दफनाने। मिया संतानों का प्रदर्शन (डी) prepulse 5 DB में prepulse निषेध (पीपीआई) घाटा और (ई) prepulse 15 डीबी। ± SEM मतलब है। * पी ​​<0.05, ** पी <0.01 (डेटा से वू एट अल।, 2015 और अनुच्छेद 13 के लिए संशोधित मूल रूप है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. मिया वयस्क संतानों Purkinje कोशिकाओं के आत्मकेंद्रित। घटाने की endophenotypes lobule में सातवीं मिया वयस्क संतानों में दिखाया गया है के साथ जुड़े नयूरोपथोलोगिकल असामान्यताएं दिखा रहे हैं। तीर: Calbindin + Purkinje कोशिकाओं। माले: आणविक परत, GCL: दाना सेल परत, PCL:। Purkinje सेल परत यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अलग-अलग समय खिड़कियों पर मिया प्रेरण कृन्तकों में विभिन्न मस्तिष्क के विकास घटनाओं perturbs, और फलस्वरूप अलग व्यवहार असामान्यताएं और वंश में neuropathologies की ओर जाता है। E12.5 पर इंजेक्शन: यहाँ, हम पाली (सी आई) के साथ चूहों में मिया प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। मिया प्रेरण का यह तरीका व्यवहार, तंत्रिका विज्ञान, प्रतिरक्षा, और वंश 8,10,11,16 में आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन के साथ जुड़े जठरांत्र असामान्यताओं की ओर जाता है। यह ध्यान रखें कि महत्वपूर्ण है, क्योंकि मिया एक पर्यावरण जोखिम कारक है, वंश के phenotype neurodevelopmental विकारों के आनुवंशिक मॉडल से चूहों की तुलना में अधिक बदलाव होने की संभावना है। इस प्रकार, सही और लगातार मिया के माध्यम से आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन से संबंधित phenotypes उत्पन्न करने के लिए है, यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण अतिरिक्त चर कि परिणाम उलझाना सकता है कम से कम करने के लिए है।

समय प्रोटोकॉल में वर्णित करीब पालन किया जाना चाहिएLy। सही इंजेक्शन समय खिड़की यह सुनिश्चित करना होगा कि मिया वांछित स्तर पर संतानों के मस्तिष्क के विकास perturbs। माउस में E12.5 पर मिया की प्रेरण मानव हमल 21 में पहली तिमाही के अंत के पास perturbations से मेल खाती है - एक अवधि के दौरान जो महत्वपूर्ण मस्तिष्क के विकास cortical परत में Purkinje कोशिकाओं और पूंछवाला putamen के विकास, और न्यूरोजेनेसिस सहित होता है। आगे की जांच पड़ताल मिया सेरिबैलम में Purkinje कोशिकाओं के नुकसान और मस्तिष्क के विकास के शुरुआती गड़बड़ी के बीच सहयोग को साबित करने की जरूरत होगी।

लगातार उपचार, परीक्षा, और बांधों का भी पालन संतानों phenotype पर मातृ तनाव के प्रभाव को कम होगा, हमारे प्रोटोकॉल अभी भी निरंतर है कि शोधकर्ताओं के बारे में पता होना चाहिए। उदाहरण के लिए, हम हाउस एकल बांधों पाली के इंजेक्शन से पहले दिन (मैं: सी) और गर्भावस्था के बाकी भर में। हमारी रणनीति एक undisturbe में गर्भवती चूहों को छोड़ रहा हैडी वातावरण। हालांकि, इस कार्रवाई मातृ माहौल में तनाव की प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकता है। हालांकि हम नहीं जानते कि इस अलगाव प्रेरित तनाव प्रतिक्रिया वंश के विकास के साथ हस्तक्षेप है कि क्या, मिया प्रभाव हमारे प्रक्रिया का पालन करते हुए देखा जा सकता है।

इसके अलावा, चूहों के तनाव और आनुवंशिक पृष्ठभूमि चुना और मिया शामिल करने के लिए सावधानी से परीक्षण किया जाना चाहिए। अब तक, मिया का असर ज्यादातर जंगली प्रकार C57BL / 6N चूहों 8,10,13,16 में दोहराया है। दूसरों को भी BTBR माउस तनाव 19 में मिया प्रभाव देखा है। (सी आई) के अनुवांशिक इंजीनियर चूहों 13,22-24 में विभिन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो संतानों के लिए अतिरिक्त confounding प्रभाव को पेश हो सकता बटोर सकता यह है कि पाली दिखाया गया है।

जैविक प्रतिकृति की संख्या के मामले में, हम जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन, या इम्युनो के लिए समूह के प्रति व्यवहार या शारीरिक assays के लिए समूह के अनुसार कम से कम 6 litters और 3 litters का उपयोगऊतकरसायनविज्ञान दृष्टिकोण। हम बजाय एक कूड़े के भीतर एक या दो संतानों का उपयोग कर प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक कूड़े के भीतर सभी संतानों का परीक्षण करें। हम यह भी एक कूड़े के भीतर सभी संतानों के लिए डेटा औसत, और एक डेटा बिंदु (जैसे कि एन = litters की संख्या) अनुचित आँकड़े 13 से बचने के लिए के रूप में है कि औसत का उपयोग करें। क्योंकि कोई स्पष्ट लिंग अंतर मिया मॉडल 13 में देखा गया है एक लिंग से डेटा भी जमा कर रहे हैं।

कूड़े आकार से मिया संतानों नापने के पीछे तर्क मातृ नर्सिंग और देखभाल की वजह से भिन्नता को कम करने के लिए है। कूड़े का आकार C57BL में / 6 चूहों 25 stereotypic व्यवहार के साथ संबंध स्थापित करने के लिए दिखाया गया है। हम सोचते हैं कि यह मातृ नर्सिंग और देखभाल के दौरान संसाधनों के काम की वजह से हो सकता है। इस confounding प्रभाव से बचने के लिए, हमारे मानक वांछित कूड़े आकार C57BL / 6 चूहों के लिए 6-10 है।

यहां तक ​​कि जब प्रोटोकॉल निम्नलिखित निकट प्रयोगकर्ता en मईइंजेक्शन के बाद पाली (सी आई) के गर्भवती चूहों में एक पीढ़ी कमजोर या जरूरत से ज्यादा शक्तिशाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मुकाबला। इससे बचने के लिए, यह पाली के विभिन्न बैचों (सी आई) के pyrogenic और cytokinogenic गतिविधि को मान्य करने के लिए आवश्यक है। विभिन्न बैचों और पाली के बहुत सारे (मैं: सी) एक ही कंपनी से चूहों में भड़काऊ प्रतिक्रिया के विभिन्न स्तरों के लिए ले जा सकता है; ऊँची, पाली के समान खुराक इंजेक्शन लगाने: विभिन्न बैचों से (मैं सी) प्लाज्मा में 10 गुना मतभेद आईएल -6 का स्तर 26 में परिणाम कर सकते हैं। खुराक और पाली के बैच निर्धारण: गैर गर्भवती महिला आईएल -6 माप के readout से आगे मिया प्रयोग के लिए (मैं सी) मिया प्रेरण से प्रभाव की भिन्नता को कम करने में मदद कर सकता है।

यदि यह पाली के विशिष्ट बैचों के लिए खुराक को संशोधित करने के लिए आवश्यक है (मैं: सी), यह भी पाली की एकाग्रता को संशोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है (मैं: सी) इंजेक्शन के लिए समाधान है कि इस तरह की मात्रा इंजेक्शन के ग्राम प्रति लगभग 5 μl रहता है माउस वजन। उदाहरण के लिए, manuf के अनुसारacturer की प्रक्रिया, पाली (मैं: सी) माना जाता है कि ~ पर पानी की 10 मिलीग्राम / एमएल का पुनर्गठन किया है शारीरिक फॉस्फेट बफर समाधान में एक polynucleotide उपज के लिए। हमारे 40 मिलीग्राम / एमएल समाधान की तुलना में, कम एकाग्रता 4 परतों से इंजेक्शन की मात्रा में वृद्धि होगी। गर्भवती चूहों के लिए, बफर इंजेक्शन की एक बड़ी मात्रा संभावित भ्रूण पर दबाव बढ़ाने के लिए और अवांछित मिलवा सकता है, संतानों के प्रभाव confounding। आदेश में इंजेक्शन की मात्रा को कम करने के लिए एक उच्च अंतिम एकाग्रता के साथ 0.09% सोडियम क्लोराइड में: (सी आई) के पाउडर इसलिए, हम पाली भंग करने के लिए चुनें।

आईएल -6 क्योंकि पूर्व अनुसंधान मस्तिष्क के विकास और व्यवहार पर मिया के प्रभाव को मध्यस्थता करने में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में आईएल -6 सिगनल की पहचान की है तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया के मार्कर होने के लिए चुना है। पाली के बाद (मैं: सी) उपचार, आईएल -6 मातृ रक्त और नाल 10,12 में सबसे upregulated साइटोकाइन है। सबसे महत्वपूर्ण बात, स्मिथ एट अल। प्रदर्शन कई की है किअत्यधिक upregulated साइटोकिन्स, केवल आईएल -6 दोनों आवश्यकता है और मिया-जुड़े मस्तिष्क और व्यवहार असामान्यताएं के शामिल होने के लिए प्रचुरता का प्रदर्शन किया। यही कारण है, विरोधी आईएल -6 की मातृ इंजेक्शन प्रभावी ढंग से मिया संतानों में असामान्य व्यवहार और transcriptomic असामान्यताओं को रोकने सकता है, जबकि निष्क्रिय अन्य साइटोकिन्स 10 नहीं किया। इसके अलावा, पुनः संयोजक आईएल -6 लड़का (पाली के बिना (मैं: सी)) की मातृ इंजेक्शन मिया जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल और व्यवहार असामान्यताएं मिया भ्रूण के मस्तिष्क के और वंश 12,15 में देखा reproduces।

अन्य तरीकों की तुलना मिया प्रेरित करने के लिए (जैसे, lipopolysaccharide (LPS) या इन्फ्लूएंजा), पाली (मैं: सी) अपेक्षाकृत सुरक्षित है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है। हालांकि भड़काऊ प्रतिक्रिया मातृ पाली (मैं: सी) द्वारा हासिल प्रशासन तीव्र और क्षणिक है, वंश व्यवहार और मस्तिष्क के विकास पर इसके प्रभाव गहरा है। कुल मिलाकर, एक बार मिया टी उत्प्रेरण की तकनीकhrough पाली (मैं: सी) E12.5 पर इंजेक्शन महारत हासिल है, एक तो संतानों पर यह पर्यावरण जोखिम कारक के प्रभाव की जांच करने के लिए अलग-अलग व्यवहार और जैविक assays प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं। एक ही समय में, एक भी आनुवंशिक संशोधन या अन्य उपचार के साथ विधि से पहले, जोड़ सकता है के दौरान या गर्भावस्था के बाद कारणों और आत्मकेंद्रित और मानसिक असंतुलन के लिए संभव चिकित्सकीय दृष्टिकोण की जांच करने के लिए।

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Acknowledgments

हम मिया मॉडल, आत्मकेंद्रित, और एक प्रकार का पागलपन अनुसंधान की प्रगति के लिए उनके योगदान के लिए देर डॉ पॉल एच पैटरसन का सम्मान करना चाहते हैं। हम इस प्रोटोकॉल पर अपने महान समर्थन के लिए Sarkis लालकृष्ण Mazmanian स्वीकार करते हैं; रूबेन एम Bayon, वेट्टी गार्सिया-फ्लोरेस, करेन सी Lencioni, और लेस्ली ए न्यूमन प्रशासनिक सहायता के लिए; फिल्मांकन पर सहायता के लिए अली Khoshnan और जनवरी सी Ko; ऐलेन वाई Hsiao और मिया प्रेरण पर उनकी सलाह के लिए नतालिया Malkova; जेफरी एस कोक्रेन, जोकिन Gutierrez, क्वान एफ ली, जैमे रोड्रिगेज, लोरेना सी सैंडोवल, और नेटली ए Verduzco उनके विशेषज्ञ पशुपालन के लिए। यह काम एनआईएच Conte केंद्र पुरस्कार (एनआईएच 5P50MH086383-04, पॉल एच पैटरसन के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था; आत्मकेंद्रित बोलती है (# 7670, पॉल एच पैटरसन के लिए); सिमंस फाउंडेशन (# 322839, Sarkis लालकृष्ण Mazmanian करने के लिए); एनआईएच प्रशिक्षण अनुदान (एनआईएच / एनआरएसए T32GM07616 लालकृष्ण-HC के लिए); कैलटेक ग्रीष्मकालीन अंडर ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (सर्फ) (ZY करने के लिए); Amgen विद्वान कार्यक्रम कैलटेक (ZY करने के लिए); और postdoctoral फैलोशिप frओम राष्ट्रीय विज्ञान परिषद, ताइवान (एनएससी 101-2917-मैं-564-039, डब्ल्यू-LW के लिए)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt SIGMA P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP HOSPIRA NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" COVIDIEN 8881600145
50 ml conical screw cap tubes USA SCIENTIFIC 1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC 1000 Optional
Stereomicroscope Wild Heerbrugg M5A Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm Roboz RS-5045 Optional
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76104 Optional
TRIzol reagent Life Technologies 15596-026  Optional
RQ1 Rnase-free DNase Promega M610A Optional
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8891 Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX  Roche 4913922001 Optional
Real-time PCR ABI 7300 Optional
Primer: Il6 forward Life Technologies TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Optional
Primer: Il6 Reverse Life Technologies TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC Optional
Primer: beta-actin forward Life Technologies AGAGGGAAATCGTGCGTGAC Optional
Primer: beta-actin Reverse Life Technologies CAATAGTGATGACCTGGCCGT Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate Life Technologies 4306737 Optionl
MicroAmp optical adhesive film  Life Technologies 4311971 Optionl
EthoVision Noldus EthoVision Optionl
SR-LAB apparatus (PPI) San Diego Instruments  SR-LAB Optionl
Marbles PENN-PLAX Blue gem stones marbles Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Life Technologies 21600-069 Optionl
Paraformaldehyde MACRON 2621-59 Optionl
Vibratome Leica VT1000 S Optionl
Sodium azide Sigma S2002 Optionl
Triton x-100 Sigma X100 Optionl
Hydrogen peroxide solution Sigma 18312 Optionl
Goat serum Vector Laboratories S-1000 Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody Abcam ab11426 Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody Vector Laboratories BA-1000 Optionl
VECTASTAIN ABC Kit Vector Laboratories PK-4000 Optionl

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 109 मातृ संक्रमण मातृ प्रतिरक्षा सक्रियण (मिया) Polyinosinic: polycytidylic एसिड (पाली (मैं: सी)) भ्रूण 12.5 दिन (E12.5) इंटरल्युकिन -6 (आईएल -6) मातृ-placental- भ्रूण अक्ष अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं hindbrain आत्मकेंद्रित पागलपन व्यवहार असामान्यताएं
(सी आई) वायरल नकल पाली के साथ मध्य हमल स्टेज पर चूहे में मातृ प्रतिरक्षा सक्रियण की प्रेरण
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Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C). J. Vis. Exp. (109), e53643, doi:10.3791/53643 (2016).

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