Introduction
Понятие материнской иммунной активации (МВД) берет свое начало из эпидемиологических исследований по ассоциации материнской инфекции с аутизмом и шизофренией 1. Из - за отсутствия обнаруживаемых реплицирующихся вирусных патогенов в плаценте или головного мозга плода после материнской вирусной инфекции 2,3, влияние инфекции на потомстве гипотетически быть вызвано активацией материнской иммунной системы , а не самих патогенных микроорганизмов ,
Для выяснения причинно-следственной связи между МВД и психическими расстройствами, инъекции химически синтезированного, вирусный мимической двухцепочечная РНК полиинозиновая: полицитидиловая кислоты (поли (I: C)) в беременных грызунов широко используется в качестве животной модели для МВД 4,5. Поли (I: С) признается Толлем-подобный рецептор 3 (TLR3) и системное введение поли (I: С) индуцирует вирусоподобные острой воспалительной реакции. Одним из механизмов, с помощью которых поли (I: С) прoduces поведенческие аномалии и невропатологий у потомства, вызывая дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в оси материнской-плацентарного-фетальной 6. Несколько групп приняли модель МВД , чтобы понять этиологию психических расстройств 7, и в связи с различными интересами среди исследовательских групп, различные моменты времени иммунной активации были использованы для достижения различных возмущений на развитие мозга и поведения 7.
Лаборатория Пол Х. Паттерсон из Калифорнийского технологического института принимает стратегию инъекций поли (I: C) в беременных мышей в эмбриональные 12,5 дней (E12.5), который успешно продемонстрировал, что МВД способно вызвать поведенческие, неврологические, и иммунологические изменения у потомства, которые связаны с аутизмом и шизофренией 8-11. Наши предыдущие работы показывают , что МВД потомство отображать поведенческие отклонения (например, социальные impairmenт, дефицит общения, повторяющееся поведение, тревога типа поведения, и латентный дефицит ингибирования 8,10,12), иммунной дисрегуляции и цитокины дисбаланс 8,13,14, изменение экспрессии гена фетального мозга 15, потеря клеток Пуркинье в дольки VII мозжечка 11, изменения синаптических свойств в гиппокампе 9 генов х окружающей среды взаимодействия 13, изменение проницаемости кишечника и кишечную флору композиции 16. Кроме того, терапевтические и профилактические стратегии также разработаны с этой моделью системы 13,16,17. По индукции МВД на E12.5, другие показали , что МВД производит плода активации микроглии и холинергической изменения развития в базальных отделах переднего мозга 18, штамм специфического взаимодействия 19, мозг церебральный синаптосомальных ультраструктурным аномалии, церебральный дыхательной цепи митохондрий гиперфункции abnormalties, понижающей регуляции мозговых молекул синаптосомальных 17 ,депрессивно-как поведение, нарушения в познании и гиппокампа долговременной потенциации (LTP), а также дефицит взрослых гиппокампа нейрогенеза 20.
Здесь мы приводим детальный метод, как индуцировать MIA на E12.5 поли (I: C), а также парадигм, как применить эту модель для изучения этиологии аутизма и шизофрении. Важно отметить , что МВД является фактором риска для различных расстройств , 4 -х , и его результаты чрезвычайно чувствительны к тому времени , и метод индукции, а также земледелии беременных плотин. Таким образом, даже незначительные несоответствия между лабораториями часто приводят к низкой воспроизводимости и / или различных фенотипов в потомстве. Наш метод разработан специально для тех, кто заинтересован в изучении МВД как фактор риска для окружающей среды аутизм и шизофрения, а также подробное описание при условии, поможет исследователям улучшить воспроизводимость своих данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы были выполнены в соответствии с утверждением Калифорнийского технологического института Institutional животных по уходу и использованию комитета (IACUC).
1. Подготовка к Timed-брачных пар
- Используйте по крайней мере 6 плотин для поведенческих экспериментов и 3 для анализа экспрессии генов.
Примечание: Используйте двойное количество оцениваемых самок мышей, так как только около 50% мышей будет подключен от тайм-спариванию. - Использование самок мышей без предшествующей беременности и в 8-16-недельного возраста.
Примечание: Самки мышей, которые имеют предварительное сексуальное воздействие самцов мышей, но не были беременны, являются приемлемыми. - Дом самки мышей вместе и поместить клетки рядом друг с другом, чтобы синхронизировать их эстрального цикла. Используйте стандартный мышей клетку с высотой более 5,5 дюймов и 75 квадратный дюйм пола в помещении, чтобы корпус 5 взрослых мышей. Добавьте описание каждой самки мыши с помощью ушного удар.
2. Настройка тайм-матИНГ пара
- Настройка тайм-ответная 0-2 ч до начала темного цикла. Поместите два самок мышей в каждой клетке. Выньте мышей и взвесить их по отдельности. Регистрируют вес тела каждой самки мыши.
- Поместите один самца мыши в каждую клетку с двумя самок мышей. Используйте трио спаривание, чтобы минимизировать отеческую путая эффект.
3. Вагинальный штепсельной вилки Check (E0.5)
- Проверьте самок мышей 0-4 ч после окончания цикла темный. Аккуратно поднимите женскую мышь от основания хвоста и позволить мышь, чтобы захватить проволочную сетку, клетку сверху, или клетка край.
- Поиск на наличие признаков вагинальной пробки: вагинальный вилка видимая беловатые массы в вагинальное отверстие. Если вилка не очевидна, аккуратно вставьте 200 мкл наконечник пипетки в вагинальное отверстие. Сопротивление от коагуляции подтверждает образование вагинальный штепсельной вилки. Проверьте вагинальный пробку один раз в день.
Примечание: Вагинальные вилка только признак того, что спаривание произошло, и, следовательно, не гuarantee беременность. Вагинальные вилка может быть трудно определить в некоторых штаммов мышей. Обратитесь за помощью к опытному мышей воспитателя повысить точность идентификации пробки. - Перемещение блокированных мышей в новую клетку и группа их размещения. Определить день вагинального появления пробки как эмбриональное 0,5 дня (E0.5).
4. На E10.5-11.5, Проверить наличие беременности
- Осторожно поднимите основание хвоста и позволить мышь, чтобы захватить проволочную сетку, клетку сверху, или клетка край. Обратите внимание на область живота , чтобы проверить на наличие признаков беременности, например, вздутие в брюшной полости (рис 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: признак беременности всегда более очевидна на E11.5, чем на E10.5. - Взвесьте мышей для проверки беременности. Беременной мыши в целом весит около 20% тяжелее на E10.5 и 30% тяжелее по сравнению с E12.5 небеременной мыши (рисунок 2). Одноместный дом беременных мышей в чистых клетках.
5. 20 мг /кг Поли (I: C) Приготовление
- Использование по меньшей мере, 6 плотин на группу для поведенческих экспериментов и 3 на группу для анализа экспрессии генов. Подготовьте соответствующее количество поли (I: C) раствором.
- Взвесить поли (I: С) порошка в 50 мл коническую пробирку, чтобы получить конечную концентрацию 40 мг / мл. Для того чтобы минимизировать и стандартизировать стресс, вызванный объемом впрыска, вводят по 5 мкл поли (I: С) раствор для каждого грамма веса тела мыши (5 мкл / г, или 5 мл / кг). Для того, чтобы побудить МВД, мы вводим 20 мг поли (I: C) за килограмм.
Примечание: Концентрация поли (I: С) раствор Необходим (20 мг / кг) / (5 мл / кг) = 4 мг / мл. Поскольку поли (I: C) порошок содержит 10% поли (I: C), нам нужно сделать конечную концентрацию мл поли (4 мг / мл) /0.1= 40 мг / (I: C) раствором.
ВНИМАНИЕ: Poly (I: C), порошок очень светло. Будьте осторожны, чтобы не потерять какой-либо порошок при передаче от шпателя к конической трубе. - Добавьте соответствующий объем 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор) в коническую ваннее и закройте крышку. Растворите порошок, осторожно крученым солевой раствор капельку над поли (I: C) порошка, пока раствор не станет прозрачным. Центрифуга коническую трубку при 800 мкг в течение 1 мин (рис 3C). Фильтр поли (I: C) раствор фильтром 0,22 мкм. Перенести поли (I: C) раствора до 1,5 или 2 мл микроцентрифужных трубки. Необязательно: Используйте спектрофотометр для измерения отношения поли (I: C) 260/280 раствора. Убедитесь , что соотношение между 1.54-1.82 (рисунок 3) , как описано производителем. Примечание: физиологический раствор используется для растворения поли (I: C) порошок и служить в качестве инъекции управления должна быть стерильной и фармацевтического класса.
6. Физиологический раствор или поли (I: C) Раствор для инъекций на E12.5
- Взвесьте мыши на шкале и положил его обратно в клетку. Используйте следующую формулу для расчета объема впрыска как для физиологического раствора и поли (I: C) мышей: вес тела (г), умноженных на 5 = нужного объема впрыска (мкл). Используйте 0,3 мл INSULв шприц , чтобы составить расчетный объем физиологического раствора или 20 мг / кг поли (I: C) раствор, например, 150 мкл для 30 г мыши.
- Аккуратно поднимите мышь на основании хвоста и разместить его на верхней части клетки. Ручка мыши осторожно, чтобы избежать вмешивающихся эффектов, вызванных стрессом. Вставьте иглу, скос вверх, при температуре около 20 ° по отношению к мыши в центр своих двух верхних сосков (рис 4), и вводят физиологический раствор или поли (I: C) решение. Примечание: Игла должна быть заменена на каждой мыши после инъекции.
- Поместите мышь обратно в родную клетку. Поместите клетки в тихом и низкой комнате трафика, чтобы избежать других вмешивающихся эффектов.
7. На следующий день после Poly (I: C) Инъекции (E13.5)
- Проверьте вводили мышам на следующее утро. Используйте шкалу для измерения веса тела.
Примечание: Poly (I: C) вводили беременным мышам, как правило, набирают меньше веса, чем физиологический раствор вводили мышам на следующий день после инъекцпрогиб. - Не беспокоить мышей, пока потомство не родится.
8. Датчик МВД Offspring
- Для того, чтобы свести к минимуму смешанное воздействие МВД индукции, следуйте рекомендациям, перечисленные ниже, чтобы оценить использование МВД потомства.
- Исключить из пометов недоношенными или с задержкой рождения, или если размер помета меньше 5.
- Эвтаназии излишние щенкам от CO 2 , если размер мусора больше , чем 10.
9. Необязательно: Проверьте острой воспалительной реакции После МВД
- Жертвуют беременных мышей 3 ч после того, как физиологический раствор или поли (I: C) инъекции с использованием метода, описанного в протоколе комитета по уходу за животными утвержденных учреждения.
Примечание: цервикальной дислокации часто является предпочтительным , поскольку это сводит к минимуму эффект CO 2 / эвтаназии наркотиков на плотине и эмбриона. - Сбор селезенки от взрослых беременных мышей и изолировать плаценту и плода бюстгальтерв рамках стереомикроскопа.
- Для коллекции селезенке, лежал мыши на рассечение пластины и спрей 70% этанола на брюшной области беременных мышей. Используйте пару стерильными ножницами, чтобы сделать вертикальный разрез в центре области живота ниже грудной клетки и через кожу.
- Селезенка сидит в левой верхней абдоминальной квадранте. Используйте пинцет, чтобы изолировать селезенки. Раскатайте селезенку на деликатных стеклоочистителей задач для удаления жировой ткани вокруг органа. Собрать примерно 50 мг ткани селезенки и разместить их по отдельности в пробирки Эппендорф с 500 мкл РНК стабилизации буфера или TRIzol для предотвращения деградации нуклеиновой кислоты. Храните образцы при -80 ° C морозильнике до использования.
- Для плацента коллекции, аккуратно вытащить рога матки из организма. Поместите рогов матки в чашке Петри заполнены автоклавного фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) и оставьте блюдо на льду. Используйте два пинцета, чтобы разорвать стенки матки и подвергать амниотической мешочка.
- Осторожно использовать пинцет, чтобы открыть амниотической мешка без повреждения плаценты и плода. Отделить плаценту от плода и перерезать пуповину как можно ближе к плаценте, насколько это возможно. Удалите амниотической мусор из плаценты. Поместите плаценту индивидуально в пробирки Эппендорф с 500 мкл РНК стабилизируют буфера или TRIzol. Хранить пробу при -80 ° C морозильнике до использования.
- Для сбора мозга плода, сохранить плод в РНК не стабилизируются буфер со стадии 9.2.2 до рассечения. Дразнить от пиальных мембрану из желудочка головного мозга с использованием деликатных # 5 щипцов под стереомикроскопа. Осторожно удалите всю мембрану из мозга плода. Поместите эмбриональные мозги индивидуально в пробирки Эппендорф с 500 мкл РНК стабилизируют буфера или TRIzol. Хранить пробу при -80 ° C морозильнике до использования.
- Извлечение РНК из ткани и преобразовать РНК в кДНК. Анализ экспрессии гена IL - 6 в кДНК с помощью реального TIME ПЦР.
- Извлечение РНК из тканей, следуя изготовления протокола TRIzol. Если ткани сохраняются в буфере стабилизации РНК. Оттепель образца и спином вниз буфер. Передача ткани от кончика к другому Эппендорф с 500 мкл TRIzol и продолжить экстракции РНК.
- Используйте спектрофотометр для измерения концентрации, 260/280 и 260/230 отношение РНК. Убедитесь в том, что отношения выше 2,0.
- Устранить загрязнение ДНК путем обработанной РНК с ДНКазы I. Mix 1 мкг РНК, 1 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл РНКазы ДНКазы и нуклеазы без воды до конечного объема 10 мкл. Выдержите основной смеси при 37 ° С в течение 30 мин. Добавьте 1 мкл раствора ДНКазы остановки для прекращения реакции. Выдержите смесь при температуре 65 ° С в течение 10 мин.
- Обратный транскрибировать РНК в кДНК. Используйте 20 мкл реакции, и до 1 мкг общей РНК на реакцию. Смешайте 4 мкл 5x буфера обратного транскрипции (RT) реакционной смеси, 1 мкл числа оборотовERSE транскриптазы, 11 мкл матричной РНК после лечения с ДНКазы I и 4 мкл нуклеазы без H 2 O , чтобы принять окончательное решение 20 мкл. Программирование тепловых условий Cycler для РТ. Обобщенный условие включают: Шаг 1: 25 ° C в течение 5 мин; Шаг 2: 42 ° С в течение 30 мин; Шаг 3: 85 & deg; С в течение 5 мин; Шаг 4: держать при температуре 4 ° С. Развести кДНК в 5 раз. Для кратковременного хранения, хранить кДНК при 4 ° С. Для длительного хранения, заморозить кДНК при -20 ° С.
- Анализ экспрессии гена IL - 6 в кДНК с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовать экспрессию гена IL - 6 к бета-актина экспрессии гена.
- Сделать мастер смеси для IL6 и бета-актина обнаружения. Используйте 25 мкл реакции, мастер смесь для каждого гена включает в себя 12,5 мкл SYBR Green Mix, 0,5 мкл 10 мкМ прямого праймера, 0,5 мкл 10 мкМ обратного праймера и 6,5 мкл нуклеазы без H 2 O.
- Поместите 5 мкл 5x разбавленный кДНК Aт в нижней части скважины оптического 96-луночного реактивную пластину. Пипетка 20 мкл мастер смеси в каждую лунку, чтобы сделать окончательный 25 мкл ПЦР-смеси. Triplicate каждого гена для каждого образца. Уплотнение пластины с помощью оптической клейкой пленки. Спин вниз пластины при 800 мкг в течение 3 мин при 4 ° C Использование стандартной программы в режиме реального времени ПЦР: Шаг 1: 50 ° C в течение 2 мин; Шаг 2: 95 & deg; С в течение 10 мин; Шаг 3: 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с и температуре 60 ° С в течение 1 мин. Добавьте дополнительный шаг для кривой диссоциации.
10. Изучить поведенческим отклонениям в МВД взрослых Offspring (необязательно):
- Выполните тесты поведения в возрасте 8-12 недель. Изменение клетки постельные принадлежности по крайней мере за 3 дня до начала испытания. Акклиматизироваться мышей в поведенческом комнату тестирования по крайней мере за 30 минут до теста.
- Для предымпульсной торможения (PPI), сдерживать мышей в плексигласа цилиндр с пьезоэлектрическим датчиком под ним. Акклиматизироваться мышей ИЦПкамера в течение 5 мин. Выставляют мышей с 6 испытаний 120 дБ белого шума (испуга).
- Затем подвергать мышей с рандомизированные смесей 14 исследований фонового шума, 14 испытаний испуга, 14 испытаний предымпульса 5 дБ (5 дБ выше, чем фоновый шум) + испуга (PPI5) и 14 испытаний предымпульса 15 дБ (15 дБ выше чем фоновый шум + испуга (PPI15).
- Нормальное реакции испуга в течение первых 6 испытаний 120 испытаний дБ. Нормальное реакции испуга для других отдельных раздражений. Covert значение для предымпульсной ингибированию (испуга - PPI5 или PPI15) / испуга.
- Для испытания в открытом грунте, поместите курсор в углу открытой квадратной арены (50 х 50 х 50 см 3). Запись траектории мыши в течение 10 мин через потолок камерой. Определить центр арены как центральной зоны (17 х 17 см 2). Количественная расстояние, записи центра зоны, а время, проведенное в центральной зоне вручную или с помощью программного обеспечения автоматического анализа изображений на основе. Для испытания погребения мрамор, акклиматизироваться мышь к тестовой клетке с сжимаются 5см глубокой, чистой, осина сосны постельное белье в течение 10 мин. Возвращает мышь, чтобы его homecage. Аккуратно поместите 20 темно-синий 1,5 см стекло диаметр шариков в моде 4 х 5 договоренности. Поместите мышь обратно в испытуемую клетку с шариками в течение 10 мин. Граф мраморов, которые были захоронены в период тестирования 10 мин.
11. Осмотрите мозжечковой невропатологии в МВД взрослых Offspring (необязательно):
- Эвтаназии физиологический раствор и MIA для взрослых потомство по анестетика. Заливать мышь с 50 мл PBS и впоследствии 50 мл 4% параформальдегида через сердечно-сосудистую систему.
- Удалить мозг тщательно и постфиксную мозг в 4% параформальдегид в течение ночи при 4 ° С. Промыть мозг с PBS три раза и сохранить мозг в PBS с 0,02% азида натрия в 4 ° C холодильнике до использования.
ВНИМАНИЕ: постфиксами мозг может храниться в PBS с 0,02% дернаНМУ азид в холодильнике до месяца. - Раздел мозг на 50 мкм тонкими ломтиками сагиттальной использованием vibratome. Собирают срезы головного мозга с помощью мягкой щетки пера. Прекратить эндогенной активности пероксидазы инкубации срезов в 0,6% перекиси водорода в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте разделы в анти-кальбиндин антитела, разведенного в блокирующем буфере (10% козьей сывороткой с 0,1% тритона Х-100 и 0,02% азида натрия в PBS) в течение ночи при комнатной температуре. Затем инкубировать разделы в соответствующие биотинилированные вторичные антитела, разведенного в блокирующем буфере в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте секций в авидин DH - биотинилированной пероксидазы буфера Н сложного для обнаружения биотина в течение 1 ч при комнатной температуре. Разработка разделов с помощью пероксидазной субстрата для визуализации антигена. Вымойте участки с PBS три раза между шагами. Установите секции на предметные стекла микроскопа. Изображение секции под микроскопом.
- Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
- Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
- Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
- Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
- Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
- Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
- Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
- Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
- Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
- Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
- Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
- Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
- Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
- Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
- Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
- Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
- Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
- Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
- Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
- Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инъекция 20 мг / кг поли (I: С) при E12.5 может вызвать острую воспалительную реакцию у оси мать-плацента-плод и осаждаться хроническое воздействие на развитие мозга и поведенческих фенотипов 12,13. Повышенные уровни провоспалительного цитокина, интерлейкин (IL) -6, является надежным индикатором острого воспалительного ответа после МВД. Время пик для экспрессии гена IL - 6 в плаценте и фетального мозга через 3 ч после поли (I: C) инъекции 12,13. Мы показали , что поли (I: C) индуцирует более высокую экспрессию генов IL6 через материнский селезенка-плацента-эмбрионального мозга (рис 5) (данные , адаптированные из Wu и др, 2015) . 13. Исследователи могли бы объединить эту парадигму с другими лечения , чтобы изучить факторы , которые могли бы изменить острую воспалительную реакцию после МВД, например, материнские диеты, генетических мутантных мышей, противовоспалительные препараты и т.д..
лор "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> С другой стороны, поведенческие изменения также отличительными чертами модели МВД Некоторые поведенческие тесты могут проводиться на взрослого потомства МВД, чтобы продемонстрировать разные аутист и шизофреник типа. модели поведения. в целом, по сравнению с солевым потомстве, MIA потомство отображения меньше записей центр зоны и короткой продолжительности центр зоны , проведенные в тесте открытого поля. Они также показывают более частые похоронив поведения в мраморе закапывали тест и нижний PPI (рисунок 6) (адаптировано данных от Wu и др., 2015) 13. Потеря клеток Пуркинье в мозжечке дольке VII является еще одним признаком МИА потомства (Ши и др., 2009). Когда окрашивают кальбиндин антителом, существует меньше кальбиндин-положительных клеток Пуркинье в мозжечке дольки VII МВД потомства по сравнению с контрольным физиологическим раствором потомства (рис 7).3643 / 53643fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Знак беременных мышей. Средний гестационный мыши могут быть идентифицированы выпуклость в его области живота (стрелка). Инбредных штамм C57BL / 6 мыши используется здесь в качестве примера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изменения веса тела у беременных мышей C57BL / 6N из эмбриональных (E) 0.5-12.5 дней. При сравнении беременных и небеременных мышей с вагинальными пробками , присутствующих на E0.5, то (А) массы тела и (б) процент от массы тела претерпевает резкое увеличение на E10.5 у беременных мышей. Беременные п = 10, небеременных п = 5. Данные представлены как среднее ± SE. *** Р <0,001, ****р <0,0001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Измерение оптической плотности поли (I: C).. Решение Убедитесь , что соотношение 260/280 между 1.54-1.82 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Poly (I: C) раствор для инъекций в эмбриональной (E) 12,5 дней Скрафф беременная мышь мягко.. Место инъекции находится в средней точке верхних сосков. Вводят иглу, скос вверх, при температуре приблизительно 20 ° по отношению к мыши. инбредных C57BL / 6 штамм мыши используется здесь в качестве примера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Poly (I: C) инъекции увеличивает экспрессию гена IL6 в селезенке-плацента-плод оси мозга плотины Данные представлены как среднее ± SEM.. * Р <0,05, ** р <0,01 (данные родом из Wu и др., 2015 и модифицированное для статьи 13). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. & #160;. MIA взрослого потомства проявляют поведенческие отклонения , связанные с эндофенотипов аутизма и шизофрении В тесте открытого поля, МВД потомство (A) в центральную зону реже и (В) проводят меньше времени в центральной зоне. (C) В тесте погребению мрамор, MIA потомство закопать больше , чем мраморы физиологический раствор контроля потомства. MIA потомство демонстрируют предымпульса ингибирование (PPI) дефицит (D) предымпульсной 5 дБ и (Е) предымпульсе 15 дБ. Среднее значение ± SEM. * Р <0,05, ** р <0,01 (данные родом из Wu и др., 2015 и модифицированное для статьи 13). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. MIA взрослого потомства демонстрируют нейропатологических отклонения , связанные с эндофенотипов аутизма. Потеря клеток Пуркинье в дольки VII было показано в МВД взрослого потомства. Стрелка: кальбиндин + клетки Пуркинье. ML: молекулярный слой, ВКТ: гранула клеточный слой, PCL:. Пуркинье слой клеток Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
МИА индукция в разных временных окнах возмущает различные события развития мозга у грызунов, а следовательно, приводит к различным поведенческим отклонениям и невропатологий в потомстве. Здесь мы описали протокол для индукции MIA у мышей с поли (I: C) инъекции в E12.5. Этот метод индукции МВД приводит к поведенческим, неврологического, иммунологических и желудочно - кишечных нарушений , связанных с аутизмом и шизофренией у потомства 8,10,11,16. Важно отметить, что, поскольку МВД является фактором риска для окружающей среды, фенотип потомства, как ожидается, имеют более высокую вариацию, чем у мышей, связанные с использованием генетических моделей неврологическими расстройствами. Таким образом, чтобы точно и последовательно генерировать аутизм и шизофрения, связанных с фенотипами через МВД, особенно важно, чтобы свести к минимуму дополнительные переменные, которые могут спутать результаты.
Шкала времени описано в протоколе следует придерживаться близкоLY. Правильное окно время впрыска будет гарантировать, что МВД возмущает развитие мозга потомства на желаемой стадии. Индукционная МВД на E12.5 у мышей соответствует возмущениям ближе к концу первого триместра беременности в человеческом 21 - период , в течение которого происходит значительное развитие мозга, в том числе развитие клеток Пуркинье и хвостатых скорлупе и нейрогенеза в корковом слое. Дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы доказать связь между потерей клеток Пуркинье в мозжечке и МВД раннего возмущения развития мозга.
В то время как последовательное лечение, обследование, и даже нива плотин позволит свести к минимуму влияние материнского стресса на потомство фенотипа, наш протокол все еще содержит предостережений, что исследователи должны знать. Например, мы один дом плотины день до инъекции поли (I: C) и в течение остальной части беременности. Наша стратегия состоит в том, чтобы оставить беременных мышей в undisturbed окружающая среда. Тем не менее, это действие может вызвать реакцию на стресс в материнской среде. Несмотря на то, что мы не знаем, не влияет ли эта изоляция индуцированный реакция на стресс с развитием потомства, эффект MIA можно наблюдать, следуя нашей методике.
Кроме того, штамм и генетическим фоном мышей должно быть выбрано и тщательно проверены на МИА индукции. До сих пор влияние МВД в основном воспроизведены в дикого типа C57BL / 6N мышей 8,10,13,16. Другие также наблюдали эффект MIA в BTBR штамме мышей 19. Было показано , что поли (I: C) может вызывать различные иммунные реакции с помощью генной инженерии мышей 13,22-24, которые могут иметь дополнительные эффекты искажающие к потомству.
С точки зрения количества биологических повторностях, мы используем по крайней мере 6 пометов в группе для поведенческих или физиологических анализов и 3 пометов в группе для экспрессии генов, белков, или иммуноГистохимия подходы. Мы проверяем все потомство в помете вместо того чтобы использовать один или два потомства в помете, чтобы избежать экспериментального смещения. Мы также усреднять данные для всех потомков в помете, и использовать это в среднем по одной точке данных (такие , что п = число пометов) , чтобы избежать неуместных статистики 13. Данные от каждого пола также объединены , так как никакой разницы очевидно , пол не наблюдалась в модели МИА 13.
Обоснованием гидрометрической МИА потомство от размера помета, чтобы свести к минимуму изменение, вызванное материнской медсестер и заботы. Размер выводка было показано, коррелирует с стереотипных поведения у мышей C57BL / 6 мышей 25. Мы полагаем, что это может быть связано с назначением ресурсов во время материнского ухода за больными и заботы. Чтобы избежать этого эффекта сбивающий, наш стандартный желаемый размер помета составляет 6-10 для мышей C57BL / 6.
Даже если внимательно следуя протоколу, экспериментатор может анпротивостоять чрезмерно слабой или чрезмерно мощный иммунный ответ у беременных мышей после поли (I: C) инъекции. Чтобы избежать этого, необходимо, чтобы подтвердить пирогенных и cytokinogenic активность различных партий поли (I: C). Различные партии и много поли (I: C) из той же компании может привести к различным уровням воспалительного ответа у мышей; поразительно, инъекционные одинаковые дозы Poly (I: C) из разных партий может привести к до 10 - кратно различий в плазме IL-6 уровней 26. Определение дозы и партии поли (I: C) для дальнейшего эксперимента МВД по считыванием небеременных женского измерения IL-6 может помочь уменьшить изменение эффекта от МВД индукции.
Если необходимо изменить дозировку для конкретных партий поли (I: C), также важно, чтобы изменить концентрацию поли (I: С) раствор для инъекций таким образом, что объем инъекции остается примерно 5 мкл на грамм вес мыши. Например, в соответствии с веденоПроцедура acturer, в поли (I: С), предположительно, восстановленная на ~ 10 мг / мл воды, чтобы получить полинуклеотид в физиологическом растворе с фосфатным буфером. По сравнению с нашим 40 мг раствора / мл, тем ниже концентрация будет увеличивать объем инъекции по 4-кратном. Для беременных мышей, большой объем закачки буферной потенциально может увеличить давление на эмбрионов и внедрить нежелательна, путая эффекты к потомству. Поэтому мы решили распустить поли (I: C) в порошок 0,09% хлорида натрия с более высокой конечной концентрации, с тем чтобы уменьшить объем впрыска.
IL-6 выбран в качестве маркера острого воспалительного ответа, поскольку предварительное исследование определило IL-6 сигнализации в качестве важнейшего фактора в опосредовании влияния МВД на развитие мозга и поведения. После поли (I: С) лечение, ИЛ-6 является наиболее повышающей регуляции цитокина в материнской крови и плаценты 10,12. Самое главное, Смит и др. Показано, что из несколькихвысоко активируемых цитокинами, только IL-6 выставлялись как необходимость и достаточность для индукции МИА-ассоциированного мозга и поведенческих отклонений. То есть, материнская инъекция анти-IL-6 может эффективно предотвратить аномальные поведенческие и транскриптомных аномалий у потомства МИА, в то время как нейтрализующие другие цитокины не делали 10. Кроме того, материнское инъекции рекомбинантного IL-6 в одиночку (без поли (I: C)) воспроизводит МИА-ассоциированный транскрипции и поведенческие отклонения видели в головном мозге плода и потомства 12,15 МИА.
По сравнению с другими методами , чтобы побудить МВД (например, липополисахарида (LPS) или гриппа), поли (I: C) является относительно безопасным и обеспечивает легкий способ контролировать интенсивность иммунного ответа. Хотя воспалительный ответ, индуцированный материнский поли (I: C) введения является острым и преходящими, его влияние на потомство поведения и развития мозга является глубоким. В целом, как только техники индукции МВД тhrough поли (I: C) раствор для инъекций в E12.5 освоен, можно затем продолжить выполнять различные поведенческие и биологические анализы для исследования влияния этого фактора экологического риска на потомстве. В то же время, можно также комбинировать метод с генетическими модификациями или другими способами лечения до, во время или после беременности, чтобы выявить причины и возможные терапевтические подходы к аутизма и шизофрении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы почтить покойного д-ра Пола Х. Паттерсон за его вклад в прогресс модели МВД, аутизм и шизофрения исследования. Мы признаем Саркис К. Mazmanian за его большую поддержку по этому протоколу; Рубен М. Байон, Иветт Гарсия-Флорес, Карен С. Ленсиони, и Лесли А. Нейман об административной помощи; Али Khoshnan и Ян К. Ко за помощь в съемках фильма; Элейн Ю. Сяо и Наталья Малкова за их советы по MIA индукции; Джеффри С. Cochrane, Хоакин Гутьеррес, Kwan Ф. Ли, Хайме Родригес, Lorena C. Сандоваль, и Натали А. Вердуско для их экспертного животноводства. Эта работа была поддержана NIH Conte Center Award (NIH 5P50MH086383-04, Пола Х. Паттерсон); Аутизм Говорит (# 7670, Пола Х. Паттерсон); Simons Foundation (# 322839, к Саркис К. Мазманян); NIH Обучение Грант (NIH / NRSA T32GM07616 К.-HC); Калифорнийский технологический институт Летний Бакалавриат Исследования Fellowship (SURF) (в ZY); Amgen Программа Ученых в Калифорнийском технологическом институте (в ZY); и докторантуру фром Национальный научный совет, Тайвань (NSC 101-2917-I-564-039, чтобы W.-LW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% sodium chloride INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml conical screw cap tubes | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | Optional |
| Stereomicroscope | Wild Heerbrugg | M5A | Optional |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | Optional |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | Optional |
| TRIzol reagent | Life Technologies | 15596-026 | Optional |
| RQ1 Rnase-free DNase | Promega | M610A | Optional |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | Optional |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | Roche | 4913922001 | Optional |
| Real-time PCR | ABI | 7300 | Optional |
| Primer: Il6 forward | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | Optional |
| Primer: Il6 Reverse | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | Optional |
| Primer: beta-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | Optional |
| Primer: beta-actin Reverse | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | Optional |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp optical adhesive film | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB apparatus (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | Blue gem stones marbles | Optionl |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| Paraformaldehyde | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Optionl |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Optionl |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | 18312 | Optionl |
| Goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| Rabbit anti-calbindin antibody | Abcam | ab11426 | Optionl |
| Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | Optionl |
