Introduction
גורם השעתוק הביע כל מקום בגוף וconstitutively אינטרפרון פקטור תקינה 3 (IFN) (IRF3) הוא קריטי עבור קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות הגיוס של IFNβ, אלא גם באמצעות הגיוס של chemokine (מוטיב CC) יגנד 5 (CCL5 ) וכמה חלבונים אנטי כוללים חלבון הנוצר על-IFN עם tetratricopeptide חוזר IFIT1 / 2/3 1-3. הפעלת IRF3 דווחה הזיהום הבא עם וירוסים רבים, או חשיפה לחומצת polyinosinic-polycytidylic (פולי אני: C) או lipopolysaccharide (LPS) 4. חשוב לציין, הווירוסים הנחקרים ביותר התפתחו מנגנונים להתחמק התגובה בתיווך IRF3, ובכך להימלט מארח ההגנה חיסונית מולדת 5. לפיכך, ניטור הפעלת IRF3 הוא בעל חשיבות רבה להבנת המנגנונים המולקולריים של ההגנה אנטי המארח המולדת, אלא גם לזהות את האסטרטגיה בשימוש על ידי וירוסים כדי לנטרל את התגובה הזאת.
אף אוזן גרון "> דיווחים שפורסמו רבים זאת לספק ניתוח מוגבל של הפעלת IRF3 מבוצעת על ידי הניטור של אינדוקציה גן IRF3-היעד (IFNB1 וIFIT1) ו / או assay גן הכתב בלוציפראז מצמידים ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן ברזולוציה נמוך (SDS- עמוד) ניתוח של IRF3. עם זאת, מחקרים ביוכימיים רבים, ניתוח של ההתנהגות של מוטציות IRF3 שונות והבהרה של מבנה הגבישי IRF3 6-11 תרמו להקמת IRF3 שהוא נתון למערכת מורכבת של שינויים לאחר translational רציפים על ידי זרחון ב אתרים מרובים. הקבוצה של זירחון המעורב בהפעלת IRF3 מופיע להיות תלוי בגירוי וסביר להניח בסוג התא. בתאים נגוע, IRF3 מתקיים כמינים לא-פוספורילציה וhypophosphorylated מכילים phosphoresidues, כולל Thr135 וSer173, ב1 אזור -198 aa N-מסוף 6,12-14. הצטברות של f hypophosphorylated זהORM של IRF3 מושרה על ידי מעוררי מתח, גורמי גדילה וסוכנים הפוגע ב- DNA 6. זירחון של שאריות Ser / Thr באזור C-terminal של IRF3 מכיל תחום transactivation מופעל לאחר הפעלה על ידי וירוסים, פולי אני: C או LPS בתא מסוג אופן תלוי 15-17. זירחון C-מסוף של IRF3 כרוך לא פחות מ -7 אתרי phosphoacceptor שונים מאורגנים בשני אשכולות עיקריים, Ser385 / Ser386 וSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, שכל אחד יתרום להפעלת IRF3 דרך dimerization, הצטברות גרעינית, בשיתוף עם CREB חלבון -binding (CBP) / coactivators P300, DNA מחייב IFN אלמנט תגובה רגיש (ISRE) רצפי קונסנסוס וtransactivation של גני המטרה 9,10,17-19. זירחון של Thr390 הוא חשב גם לתרום להפעלת IRF3 המושרית-וירוס 20. ספקטרומטר מסת מנתח של IRF3 הוכיח כי שאריות Ser386, Thr390, Ser396 וSer402 ישירות phosphorylatאד על ידי מעכבי קינאז של ε κB (IKKε) / קינאז מחייב טנקי 1 (TBK1) קינאז 9,10. זירחון בשאריות C-המסוף נדרש גם להפסקת הפעלת IRF3 דרך polyubiquitination והשפלה בתיווך פרוטאזום 10. תהליך זה תלוי גם בזירחון בSer339, אשר הכרחי לגיוס של isomerase propyl PIN1 10,11. מיני IRF3 מכילים לפחות phospho-Ser339 / 386/396 שאריות נחשבים צורות hyperphosphorylated. הרצף והתפקוד המדויק של כל אתר נשאר עניין של דיון 10,21. עכשיו זה ברור שIRF3 הופעל אינו מייצג מדינה הומוגנית, אבל שמינים שונים מופעלים מציגים מאפייני זרחון או dimerization שונים קיימים 10,22.כדי לספק הבנה של הפעלת IRF3 שלמה בתגובה לפתוגנים ספציפיים, זה כך צורך CHaracterize שמהמינים מופעלים מושרים. אינדוקציה של גני מטרת IRF3, IFNB1 וIFIT1, הוכיחה לספק קריאה מתוך אמינה להפעלת IRF3. עם זאת, ניטור ביטוי של גנים אלה אינם מבחינים בין מדינות הפעלה השונות של IRF3. ניתוח מקיף של מדינות הפעלת IRF3 בהגדרה מסוימת מסתמך על האפיון מפורט של זירחון וdimerization מעמדו 10. Unphosphorylated (אני צורה), hypophosphorylated (טופס השני) וhyperphosphorylated (צורות III ו- IV) צורות IRF3 6,18,23 ניתן לפתור בהצלחה על ידי ניידות מופחתת בניתוח SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה. מיני IRF3 monomeric וdimeric ניתן לזהות ביעילות על ידי ניתוח ילידים-עמוד. גישות אלה השתפרו מאוד כאשר משתמשים בשילוב עם נוגדני phosphospecific המכוונים נגד אתרי phosphoacceptor IRF3 מובחנים.
פרוטוקולים סטנדרטיים מאפשרים רזולוציה נמוכה שלחלבונים שאינו מאפשרים הפרדה יעילה של צורות phosphorylated IRF3 המובחנת. כאן, אנו מתארים בפירוט הליך כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לפקח על הגיוס של מיני IRF3 שונים המופעל באמצעות וירוס SDS-PAGE מצמידים את ילידים-עמוד בשילוב עם immunoblot באמצעות נוגדנים כולל וphosphospecific. אפליה בvivo בין שונה מופעל צורות של IRF3 מתבצעת על בסיס משמרות הניידות שלהם נצפו על SDS-PAGE. בנוסף, מונומר IRF3 ודימר ניתן להבחין על ידי אלקטרופורזה denaturing שאינו. השילוב של שתי טכניקות משלימות אלה עם immunoblot מוכיח להיות גישה סביר ורגישה לרכוש את כל המידע הדרוש לניתוח של הפעלה בתיווך זירחון של IRF3 מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול מתואר כאן שימוש בתאי A549 נגוע בוירוס סנדאי (שב). עם זאת, הפרוטוקול לSDS-PAGE ועמוד ילידים גם עובד עם כל סוגי בני האדם ועכבריים התא נבדקו עד כה, במיוחד תאי מיאלואידית מגורה עם 9,15,19,24,25 גירויי הפעלה-IRF3 שונים.
1. זיהום של תאי A549
- שמור על תאי A549 בתרבות בצלחת 15 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס / 5 CO 2% ב 20 מיליליטר F12K / בינוני חם המכיל 10% בסרום חום מומת שור עוברי (HI-FBS) ו -1% L- גלוטמין (F12K מלא / מדיום חם).
הערה: כל הפתרונות המשמשים לתרבות תא וטיפולים חייבים להיות סטרילי. - בגיל 24 שעות לפני הזיהום, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט שנאגרו מזוקק (D-PBS) ב RT.
- הוסף 1 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA לכל צלחת כדי לכסות את התאים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- לעצור את הדגירה בהקדם התאי דואר להתחיל להתנתק מהצלחת על ידי הקשה על ברכות הצלחת ביד אחת. להשבית טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של F12K בינוני / חם מלא מחומם מראש לכל צלחת ולהעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה ב 350 XG במשך 3 דקות ב RT. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 8 מיליליטר של F12K בינוני / חם מלא לקבל השעיה תא בודדת הומוגנית.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. זרעי התאים בצפיפות של 1 x 10 6 תאים לכל צלחת 60 מ"מ ב 4 מיליליטר של F12K בינוני / חם-מחומם מראש מלאה. דגירה של 20-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. לאחר 20-24 שעות, התאים בצורת monolayer ומחוברות 90% (זה מתאים 1.5 x 10 6 תאים).
- הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של F12K הסרום ללא / בינוני חם (SFM). הוסף 2 מיליליטר של SFM הטרי לצלחת 60 מ"מ.
- להפשיר aliquot של נגיף סנדאי (שב) (מאוחסן aliquoted ב -80 ° C) על קרח ובקצרה מערבולת.
- לדלל הוירוס דואר בSFM המחומם מראש כדי להשיג 60 HAU / 100 μl. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בשקט ולהוסיף של וירוס מדולל לצלחת 100 μl לבצע את הזיהום ב -40 HAU / 10 6 תאים. אל תוסיף וירוס בצלחת השליטה שאינה נגועה.
- דגירה התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. להתסיס את הצלחות ביד 3 או 4 פעמים, או באמצעות ייקר מסלולית או נדנדה אוטומטית ממוקם ישירות בחממה, בשעה הראשונה של זיהום.
- בזיהום שלאחר 2 שעות, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום F12K / חם המכיל 20% HI-FBS להשיג ריכוז סופי של 10% HI-FBS.
- דגירה התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 לשעת 1, 4 ו -7 נוספת להגיע כוללת פעמים זיהום של 3, 6, ו -9 שעות, בהתאמה. בכל אחד מנקודות הזמן אלה, המשיכו לשלב 2.1.
2. הכנת תמציות תא שלמות (WCE)
- הסר את מדיום הזיהום. קציר התאים על ידי גירוד ב 1 מיליליטרשל קר כקרח D-PBS ולהעביר את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות מראש צונן 1.5 מיליליטר.
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ולמזוג בזהירות את כל העקבות של D-PBS.
הערה: בשלב זה, התא גלולה יכול להיות נתונה ישירות למיצוי חלבון או פלאש-קפוא בחנקן נוזלי או קרח / אמבטיה אתנול יבשה ומאוחסן ב -80 ° C עד תמוגה. - הכן את חיץ תמוגה המכיל 50 מ"מ HEPES pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, גליצרול 10% ו -1% Nonidet P-40 במים ללא יונים (DDH 2 O). Extemporarily להוסיף פרוטאז (1 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin ו -2 מיקרוגרם מיליליטר aprotinin /) מעכבים וphosphatase (פלואוריד נתרן 5 מ"מ, 1 מ"מ מופעל orthovanadate נתרן, פוספט p-nitrophenyl 2 מ"מ ו -10 מ"מ pH β-glycerophosphate 7.5).
הערה: מאגר תמוגה ללא מעכבים יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. פרוטוקול ספציפי להפעלה של orthovanadate נתרן מתואר בטבלה של חומרים כימיים / Equipme ספציפיNT. - Resuspend התא גלולה ב -70 μl של מאגר תמוגה. בדרך כלל ריכוז lysate יהיה סביב 2 מיקרוגרם / μl.
- דגירה על קרח למשך 20 דקות. פלאש-להקפיא את lysate ידי דגירה באמבט חנקן נוזלי במשך 15 שניות. להפשיר lysate ב RT עד שהוא נמס לגמרי ומערבולת למשך 10 שניות. חזור על ההקפאה / הפשרה / מחזור המערבולת 3 פעמים.
- לחלופין, לבצע את צעד ההקפאה באתנול / אמבט קרח יבש 1 דקות.
- צנטריפוגה ב 16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מעבירים את supernatant (המקביל לWCE) לצינור מראש צונן חדש 1.5 מיליליטר צנטריפוגות. שמור WCE על קרח בכל העת.
- לכמת חלבונים באמצעות כל הליך כימות חלבון תואם את מאגר תמוגה כגון מבוסס רדפורד assay חלבון 26.
3. החלטה של WCE ידי הרזולוציה גבוהה SDS-PAGE
- הכן שלושה ג'לי אלקטרופורזה denaturing.
- לצורך זיהוי של, צורות IRF3 לשפוך שני ג'לים של מינימום של אורך סנטימטר 16 עם ג'ל הפרדה המורכב של 7.5% acrylamide / bis-acrylamide (37.5: 1), 375 טריס-HCl pH 8.8 מ"מ (RT), 0.1% סולפט dodecyl נתרן (SDS ), 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O וג'ל לערום מורכב מacrylamide 4%, 62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT), 0.05% SDS, 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O.
זְהִירוּת! Acrylamide, TEMED וSDS הם רעילים ו / או גירוי. ללבוש כפפות מגן ולטפל מתחת למכסת מנוע קטר. - , לגילוי של חלבוני sev לשפוך ג'ל אחד מינימום של אורך סנטימטר 8.5 עם מאפיינים דומים לג'ל מתואר ב3.1.1, פרט לכך שג'ל ההפרדה מכיל acrylamide 12%.
- לצורך זיהוי של, צורות IRF3 לשפוך שני ג'לים של מינימום של אורך סנטימטר 16 עם ג'ל הפרדה המורכב של 7.5% acrylamide / bis-acrylamide (37.5: 1), 375 טריס-HCl pH 8.8 מ"מ (RT), 0.1% סולפט dodecyl נתרן (SDS ), 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O וג'ל לערום מורכב מacrylamide 4%, 62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT), 0.05% SDS, 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O.
- לפגל WCE שהושג בשלב 2.6 על ידי הוספת 1: 4 (V / V) מאגר טעינת 5x (125 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ (RT), 10% SDS, 20% (p / גליצרול) נ ', bromophenol 0.0005% כחולים ו 25% β-mercaptoethanol ב DDH 2 O) ואחרי חימום ב 100 מעלותצלזיוס למשך 10 דקות. ספין מהיר הצינורות להפיל את העיבוי שיוצר בכובע.
זְהִירוּת! β-mercaptoethanol הוא רעיל על ידי שאיפה. ללבוש כפפות מגן ולטפל מתחת למכסת מנוע קטר. - הר ג'לי במנגנון ההגירה. מלא את התאים העליונים ותחתונים עם הפעלת מאגר המכיל 25 מ"מ טריס-בסיס, SDS 0.1% וגליצין 192 מ"מ במים מזוקקים (DH O 2).
- עומס 14 μl לסטנדרטים של משקל מולקולרי ובאחד מכל ג'ל 16 סנטימטר ו -7 μl לסטנדרטים של משקל מולקולרי ובאחד של ג'ל 8.5 סנטימטר. עומס 30 מיקרוגרם של WCE מפוגל (שהוכן כמתואר בשלב 3.2) בכל טוב של שני ג'לי מוכן בשלב 3.1.1 לגילוי צורות IRF3. עומס 8 - 10 מיקרוגרם של WCE מפוגל (שהוכן כמתואר בשלב 3.2) לכל היטב על הג'ל מוכן בשלב 3.1.2 לניתוח sev.
- הפעל את ג'לי ליום 30 בזרם קבוע mA עד לפני ההגירה מגיע לתחתית של ג'ל.
הערה: הגירה בדרך כלל נמשכת approximately 3 שעות לג'ל 16 סנטימטר ו- 45 דקות לג'ל 8.5 סנטימטר. - המשך להעברה על גבי קרומי nitrocellulose (שלב 5).
4. ניתוח של IRF3 dimerization ידי ילידים-עמוד
הערה: שיטה זו תוארה לראשונה על ידי הקבוצה של ד"ר ט Fujita 27.
- הכן את עליון - (+) מאגרי התא אלקטרופורזה ותחתונים (). חיץ החדר העליון מורכב של 25 מ"מ טריס-HCl pH 8.4 (RT), deoxycholate נתרן 192 מ"מ וגליצין 1% (DOC) בDDH 2 O. חיץ התא התחתון מכיל 25 טריס-HCl pH 8.4 מ"מ (RT) ומ"מ 192 גליצין בDDH 2 O.
הערה: ניתן לאחסן מאגרי אלקטרופורזה תא העליונים ותחתונים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עם זאת, לוודא שהם מראש לחמם RT לפני ביצוע אלקטרופורזה. - יוצקים ג'ל שאינו denaturing פתרון של מינימום של אורך 8.5 סנטימטר המכיל 7.5% acrylamide / bis-acrylamide (37.5: 1), 375 טריס-HCl pH 8.8 מ"מ (RT), תחמושת 1%persulfate nium ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O.
- טרום להפעיל את הג'ל על 40 זרם קבוע mA למשך 30 דקות על קרח. לחץ על מנגנון הריצה לתוך הקרח כ לרמה של חיץ אלקטרופורזה תא התחתון. חשוב שג'ל הוא לא בקרח.
- במהלך קדם-טווח, לערבב WCE שמר על קרח עם חיץ טעינת יליד-עמוד 2x 1: (V / V) O. המכיל 125 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT), גליצרול 30% ושל 0.1% bromophenol כחול DDH 2 1
- עומס 8 - 10 WCE מיקרוגרם (שהוכן כמתואר בשלב 4.4) מייד בתום הקדם-הטווח.
- הפעל את הג'ל על 25 זרם קבוע mA על קרח, כפי שתואר לעיל לטרום הריצה, עד לפני ההגירה מגיע לתחתית של ג'ל (כ -40 דקות).
5. ניתוח immunoblot מינים IRF3
- הכן את חיץ ההעברה המכיל 25 מ"מ טריס-בסיס וגליצין 192 מ"מ בDDH 2 O. מכניס למקרר למאגר ההעברה על 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- שלוש חתיכות רטובות של קרום nitrocellulose לחתוך לגודל מעט גדול יותר מג'לים בקופסא פלסטיק / זכוכית המכילה מאגר ההעברה. ציין את הכיוון של הקרום על ידי חיתוך פינה אחת. חיץ ההעברה ניתן לעשות שימוש חוזר 3 פעמים. אחסן את החיץ על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים.
- ג'לי (SDS-PAGE וילידים-עמוד) Uncast ולחתוך פינה אחת של כל ג'ל לכיוון נכון.
- לילידים-עמוד, דגירה ג'ל ב RT עם תסיסה עדינה במשך לפחות 30 דקות במאגר ריצת SDS-PAGE כדי להסיר את DOC לפני העברתה למאגר שההעברה.
- דגירה ג'לי (SDS-PAGE וילידים-עמוד) במאגר ההעברה ל5 - 10 דקות.
- הר כריך העברה לג'ל בקלטת העברה עם הקרום כלפי האלקטרודה החיובית (נייר כרית / מסנן קצף / קרום / ג'ל / נייר סינון / משטח קצף). להיות זהיר כדי להסיר את כל הבועות בין השכבות של הכריך.
- לבצע את ההעברה כב מומלץy היצרן למנגנון ההעברה משמש.
הערה: בצע את כל incubations ושוטף בשלבים הבאים על פלטפורמה רועדת נדנדה או מסלולית. - בסופו של זמן ההעברה, דגירה הקרומים במשך 15 דקות בתמיסה המכילות קיבעון 7% חומצה אצטית, 40% אתנול וגליצרול 3% בDDH 2 O. שטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10.2 מ"מ Na 2 HPO 4 ו -1.8 מ"מ KH 2 PO 4 ב DH O 2).
זְהִירוּת! חומצה אצטית היא רעיל, גירוי ודליק. ללבוש כפפות מגן ולטפל מתחת למכסת מנוע קטר.
הערה: פתרון הקיבעון ניתן לעשות שימוש חוזר מספר רב של פעמים. - לילידי הקרום-עמוד להמשיך ישירות לשלב 5.11.
- יש לשטוף שלושה קרומי SDS-PAGE במהירות בDH 2 O לפני דוגרים אותם דקות 1 בפתרון Ponceau אדום המכיל 6.57 מ"מ Ponceau האדום ו -1% חומצה אצטית בDDH 2 O.
הערה: פתרון Ponceau האדום יכול להיות r eused מספר פעמים. - יש לשטוף את הקרומים בDH 2 O עד שהרקע הוא לבן מספיק כדי לראות את להקות החלבון מוכתמות באדום. שים לב לסמנים בעיפרון ולחתוך את הקרום העודף סביב החלבונים. Destain הקרומים ידי דגירה במשך 5 דקות בPBS תחת תסיסה.
- דגירה ממברנות עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C. בפתרון החסימה (PBS המכיל 0.05% Tween 20 וחלב יבש 5% דלי שומן (PBS-T-חלב). לשטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS-T.
הערה: לשטוף PBS-T הוא אופציונאלי ורק הנדרש במדוקדק בעת החלת נוגדנים מדולל PBS-T המכיל 5% אלבומין בסרום שור (PBS-T-BSA) (איור 1 וטבלה 1) בשלב הבא. - דגירה ארבעה קרומים (מSDS-PAGE וילידים-עמוד) עם הנוגדנים העיקריים לפי הסדר רציף המפורט באיור 1 וטבלה 1. בצע 5x 5 שטיפות דקות ב PBS-T.
רצף איור 1. ניתוח immunoblot. סכמטי מתאר את ג'לי SDS-PAGE וילידים-עמוד האישי הנדרש כדי לזהות צורות פוספורילציה וmonomeric / dimeric IRF3 השונות. סדר המסוים של נוגדנים להחיל את הקרום כתוצאה מכל ג'ל בהליך immunoblot מתואר. שים לב שהנוגדנים נגד אקטין משמשים ראשון כדי להבטיח טעינה שווה של הדגימות לפני החלת נוגדנים ספציפיים אחרים. הרצף החלופי, עם נוגדנים נגד אקטין מיושם לאחר הנוגדנים נגד phospho-IRF3, גם עובד. הפשטה משמשת בין אנטי-אקטין ואנטי-sev נוגדנים, או בין אנטי-phospho-IRF3 ונוגדנים נגד IRF3 בגלל חפיפת גודל של האותות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| נוגדנים ראשוניים | מְהִילָה | חיץ דילול | דְגִירָה | נוגדנים משני | תגובות |
| אנטי-אקטין | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | 15 דקות ב RT | אנטי עכבר | השתמש לאחר SDS-PAGE ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול antibodyies כמה פעמים אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד. |
| אנטי-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N ב 4 ° C | נגד ארנב | השתמש לאחר ילידים-עמוד. לא מומלץ לשימוש חוזר נוגדן המדולל |
| אנטי-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | O / N ב 4 ° C | השתמש לאחר SDS-PAGE. לא מומלץ לשימוש חוזר אנטי-IRF3-P-396 נוגדן המדולל זמינים גם איתות תא. דילול אופטימלי הוגדר כ1 / 1000 לנוגדן זה, אבל עשוי להשתנות בין המון. | |
| אנטי-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | O / N ב 4 ° C | נגד ארנב | השתמש לאחר SDS-PAGE. לא מומלץ לשימוש חוזר נוגדן המדולל |
| באורך מלא אנטי-IRF3 | 1/7500 | PBS-T-חלב | 3 שעות ב RT | נגד ארנב | השתמש לאחר SDS-PAGE. נוגדן באורך מלא אנטי-IRF3 ניתן להשתמש לאחר ילידים-עמוד, אבל זה פחות רגיש כדי לזהות מונומר. ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול נוגדנים כמה פעמים אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד. |
| אנטי-IRF3-NES | 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר | PBS-T-חלב | 3 שעות ב RT | נגד ארנב | השתמש לאחר ילידים-עמוד. ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול antibodyies כמה פעמים אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד. |
| אנטי-sev | 1 / 14,000 | PBS-T-BSA | 3 שעות ב RT | נגד ארנב | השתמש לאחר SDS-PAGE. ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול antibodyies כמה פעמים אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בנוכחות 0.02% נתרן יזיד. |
| הערה: דילול וחיץ המשמש לנוגדנים משני מצמידים HRP צריכים להיות מותאם כפי שמשתנה מחברה אחת לשנייה. | |||||
1. מפרט השולחן של נוגדנים המשמש בהליך immunoblotting.
- דגירה הקרומים עם peroxidase החזרת (HRP) -conjugated נוגדנים משני כמפורט באיור 1 וטבלה 1. שטוף את הקרומים 5x 5 דקות ב PBS-T, ואחרי 5 דקות ב2x PBS להסיר באופן מלא עקבות של Tween.
- דגירה ממברנות דקות 1 בנפח של מגיב chemiluminescence המשופר מספיק כדי לכסות באופן מלא את הקרומים. ייבש את הקרומים באמצעות נייר סינון.
- מניחים את הקרומים במנתח תמונה זורח לדמיין להקות immunoreactive.
- לחלופין, לבצע זיהוי של להקות immunoreactive באמצעות צילומי רנטגן רגישים.
- שטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS.
הערה: בשלב זה יכול להיות כל הזמן יבש הקרומים. עם זאת, אם נדרשת הפשטה נוספת, עדיף לבצע את ההפשטה לפני ייבוש הקרום. קרומים גם יכולים להיות מאוחסנים במשך קצר-טווח ב- PBS. - לקרומים שאינם דורשים הפשטה בין הדגירה עם נוגדנים (ראה איור 1) להמשיך ישירות לשלב5.20.
- כאשר הפשטה נדרשת בין נוגדנים (ראה איור 1), דגירה ממברנות בטרום חימם תמיסה המכילה 2% SDS, 62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT) ושל 0.7% β-mercaptoethanol DDH 2 O הפשטה על 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות תחת תסיסה רגילה. שטוף את הקרומים 3x 5 דקות ב PBS.
הערה: התסיסה במהלך הליך הפשטה היא מפתח. הפשטה יכולה להתבצע בתנור הכלאה. לחלופין, הפשטה יכול להתבצע באמצעות ממברנות אטומות בשקיות פלסטיק ושקועות באמבט מים. במקרה זה, חשוב כדי להתסיס את הקרומים 4 - 5 פעמים במהלך הדגירה. - דגירה ממברנות עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C ב PBS-T-חלב.
- חזור על שלבים 5.12-5.16 פי איור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מציג תמונת immunoblot טיפוסית של IRF3 המזוהה עם נוגדני IRF3 כולל ונוגדני IRF3-phosphospecific נגד Ser396 וSer398 לאחר ההחלטה של WCE ידי רזולוציה גבוהה SDS-PAGE. בתאי A549 unstimulated, IRF3 מזוהה כשתי להקות בגיל 50 ו -53 kDa על SDS-PAGE המתאים (אני טופס)-phosphorylated אינו וhypophosphorylated (הטופס השני) מינים של IRF3. חשיפה של תאי A549 לsev ל3-9 שעות בתוצאות שינוי תלוי זמן להעברה לאט צורות hyperphosphorylated III ו- IV, שהם גם מכובדים מהצורות I ו- II. להקות hyperphosphorylated להעביר ב55-57 kDa. צורות III ו- IV גם immunodetected במיוחד באמצעות הנוגדנים נגד phosphospecific Ser396 וSer398. Immunodetection של אקטין משמש כשליטה של טעינה שווה בין הנתיבים. שליטה של זיהום sev מוצגת על ידי ההצטברות של p nucleocapsid הווירוסrotein (N), שנודד ב 60 kDa.
באיור 3, הפרופיל של זיהוי של IRF3 מתקבל מWCE נפתר על ידי ילידים-עמוד ואחרי immunoblot באמצעות נוגדנים נגד IRF3-נס ונוגדנים נגד phosphospecific Ser386 מוצג. בתאי A549 unstimulated, IRF3 מזוהה כלהקה יחידה המתאימה לצורת monomeric. על זיהום עם sev ל3-9 שעות, הרמות של ירידת מונומר IRF3 עם הצטברות נלווית של להקה נודדת לאט שמתאימה לצורת dimeric של IRF3. הנוגדנים נגד phosphospecific Ser386 לזהות רק מיני דימר IRF3.
איור 2. איתור של IRF3 מובחן המינים פוספורילציה (טופס I-IV) הנגרם על ידי זיהום sev בתאי A549. תאי A549 נותרו נגוע או נגוע בsev לאינדיקהפעמים טד. WCE נותח על ידי ברזולוציה גבוהה SDS-PAGE ואחרי immunoblot (IB) באמצעות אנטי-IRF3 Ser396 (IRF-3-P-Ser396) ואנטי-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) נוגדני phosphospecific ואנטי נוגדני חלבון באורך מלאים -IRF3. הזיהום היה פיקוח באמצעות נוגדנים נגד sev (חלבון N nucleocapsid מוצג). נוגדני Anti-אקטין שמשו כביקורת טעינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניטור של האינדוקציה IRF3 phosphorylated / dimerized ידי sev בתאי A549. תאי A549 נותרו נגוע או נגוע בsev לזמנים שצוינו. WCE נפתרו על ידי ילידים-עמוד ונחשף על ידי immunoblot באמצעות אנטי-IRF3 Ser386 (IRF-3-P-Ser386) נוגדני phosphospecific ואנטי-IRF3-נס antibodies. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול אנו מתארים כאן מורכב משילוב של רזולוציה גבוהה SDS-PAGE וילידים-עמוד מצמידים את השימוש של כמה נוגדני phosphospecific להבחין I-IV monomeric / dimeric וphosphoforms של IRF3. גילוי נאות של מיני IRF3 אלה הוא חיוני לאפיון הפעלת IRF3 באופן מלא בהגדרה ספציפית. לדוגמא, גירוי LPS של מקרופאגים מופעלים מוביל להיווצרות של IRF3 phosphorylated dimeric, Ser396 / 398 המציגה hypophosphorylated (טופס השני), אבל לא hyperphosphorylated (טופס III ו- IV), דפוס בSDS-PAGE 15. באמצעות הפרוטוקול המתואר, פרופיל זה ניתן להבחין בין צורות hyperphosphorylated מושרה-וירוס הדורשות זירחון Ser339 נוסף, בנוסף לSer386 וSer396 זירחון 10. חשוב לציין, זה גם מאפשר להפלות בין מיני phosphorylated Ser396 שאינו מציגים dimerization, אבל הם תעתיק פעיל 10. Importantly, זה צריך להיות ציין כי דפוס הטופס I-IV של phosphoforms IRF3 להחיל IRF3 האנושי. עכברי IRF3 אינו תערוכה דפוס דומה, ולכן הפעלה של IRF3 מאופיינת רק שימוש בנוגדני phosphospecific בimmunoblot לאחר SDS-PAGE ועל ידי ילידים-עמוד.
ההישג של הפרדה ברזולוציה גבוהה של המינים שונים של פוספורילציה IRF3 ידי SDS-PAGE דורש פרמטרים ספציפיים. לרזולוציה מתאימה, זה מאוד חשוב להשתמש ג'לי שיש אורך מינימאלי של 16 סנטימטר. אפילו עם אורך של ג'ל הפרדה, זה מפתח לבואו חזית ההגירה להגיע לתחתית של ג'ל להשיג הפרדה מתאימה של צורות IRF3 השונות. כמו כן, ג'ל לערום חייב להאריך עד למינימום של 1 סנטימטר מתחת למסרק להשיג להקות מוגדרות היטב. זה חשוב, כמו צורות hyperphosphorylated של IRF3 להעביר קרובות מאוד אחד לשני. גרוע להקות ממוקדות תביא לחוסר הבחנה בין phosphorylaטד מהווה פגיעה הכימות שלהם. בנוסף, הריכוז של persulfate אמוניום וTEMED להשתנות מפרוטוקול SDS-PAGE אחד למשנהו. וריאציה בריכוזים אלה מאלה שצוינו כאן נמצאה לפגוע ברזולוציה בהפרדת מיני IRF3 באופן משמעותי.
איתור של היווצרות דימר IRF3 דרך הילידים-עמוד תואר במקור על ידי הקבוצה של ד"ר ט Fujita. פרוטוקול זה משתמש DOC מאגר המכיל המאפשר הניתוק של דימר IRF3 מCBP / P300 27. מומלץ מאוד להמשיך לילידים-עמוד מייד לאחר תמוגה תא אחסון של WCE ב -80 ° C נמצא לגרום לשינוי משמעותי של יחס מונומר IRF3 / דימר. בנוסף, זה מאוד חשוב שאת ה- pH של מאגרי התא העליונים ותחתונים מותאם לחומציות 8.4 ב RT, ולא על 4 מעלות צלזיוס, לאחר ערבוב כל המרכיבים כדי להשיג הפרדה נאותה של מונומר לעומת דימר. הפרדהג'ל עם אורך מינימאלי של 8.5 סנטימטרים מאפשר הפרדה מתאימה של מונומר IRF3 ודימר. הנפח האידיאלי של מדגם בתוספת חיץ טעינה הוא כ 8 μl ל5 מ"מ גם הרזולוציה טובה יותר כאשר עוצמת הקול למינימום. לכן, חשוב להשתמש בנפח הנמוך ביותר של חיץ תמוגה להשיג WCE עם ריכוז גבוה. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי מיצוי חלבון יעיל דורש תמוגה בלפחות פי 5 הנפח של התא גלולה. אם הנפח של הדגימות חורגת מהמגבלה שצוינה לעיל, זה יביא, ברזולוציה נמוכה של מונומר / דימר. זה יכול להיפתר על ידי הוספת ג'ל לערום מכיל acrylamide 4%, 62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8 (RT), 1% persulfate אמוניום ושל 0.1% בTEMED DDH 2 O. זה מאוד חשוב כדי לטעון את הדגימות מבלי להפריע פסים. טוען לאט עם קצה קרוב ג'ל טעינה לתחתית הבאר נותן תוצאות טובות מאוד.
כאן אנו מתארים בvivo Detection של זירחון בשאריות ספציפיות באמצעות נוגדני phosphospecific זמינים כרגע נגד 9 Ser386, Ser396 19 ו -15 Ser398. השימוש במוטנטים IRF3 וספקטרומטר מסת הניתוחים אישרו כי שאריות אלה פוספורילציה על זיהום בנגיף או ביטוי יתר של קינאזות / TBK1 IKKε והם קריטיים ל6,9,10,19,21 הפעלת IRF3. Immunodetection של phospho-Ser396, phospho-Ser398 וIRF3 הכולל לאחר SDS-PAGE מחייב השימוש בשני ג'לים זהה (איור 1). ואכן, אובדן משמעותי של רגישות נצפה כאשר נוגדני phosphospecific משמשים לאחר ההפשטה של הקרום. לכן, מומלץ מאוד להשתמש בנוגדנים הראשונים phosphospecific. שים לב שנוגדנים ראשוניים ומשניים חלופיים יכולים גם לעבוד, אבל צריכים להיות מותאמים דילולים ורצף של שימוש הספציפיים. לניתוח IRF3, 30 מיקרוגרם של WCE ראוי לקבל זיהוי משמעותי של IRF3זירחון על ידי immunoblot באמצעות הנוגדנים הצביעו בעת שימוש 4 מ"מ בארות רוחב. למרות בסוגי תאים רבים נגועים בוירוסים שונים 30 מיקרוגרם נמצאו מתאים, סכום זה ייתכן שיהיה צורך מוגבר בהתאם לסוג תא וגירוי. עדיף להשתמש בתמציות טריות לSDS-PAGE, אבל זיהוי של זירחון IRF3 באמצעות נוגדני phosphospecific המתוארים במאמר זה הוא יציב מספיק כדי לאפשר סיבוב של אחסון של WCE ב -80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. הריכוזים של מעכבי phosphatase המתוארים כאן נמצאו מספיק בעת השימוש בתאי A549. ריכוזים גבוהים יותר לא נמצאו להניב תוצאות טובות יותר. עם זאת, ריכוזים אלה ייתכן שיהיו צורך מוגבר כאשר לומדים הפעלת IRF3 בסוגי תאים שמפגינים רמות פעילות phosphatase גבוהות יותר. חשוב לציין, זירחון של IRF3 והמנגנונים עדיין רחוק מלהיות מובן. לכן, פנל מלא של סר / Thr- וTyr-phosphatase בהמעכבים משמש לחסימת פעילות עדיין uncharacterized אפשרי שיכול להשפיע על זיהוי של IRF3 זירחון, dimerization והשפלה. לגילוי של מונומר IRF3 ודימר לאחר שרוב זיהומי וירוס, וברוב סוגי תאים, 8 - WCE מיקרוגרם 10 נמצא מספיק. עם זאת, סכום גבוה יותר של חלבונים ייתכן שיידרש לגירוי הפעלת IRF3 פחות יעילה. הנוגדנים נגד phosphospecific Ser386 שימשו במחקר זה מומלץ להשתמש במולדת-עמוד כרגישות בdenaturing SDS-PAGE הוא חלש מאוד. יתר על כן, זירחון בSer386 מוצע לתאם עם טופס dimeric של IRF3 9, ובכך הופך את השימוש בנוגדנים אלה במולדת-עמוד אסטרטגיה מתאימה כדי לאשר את המושג הזה בהגדרה ספציפית. ראוי לציין, נוגדנים חלופיים זמינים מחברות שונות והם טענו לאתר phospho-Ser386 יעילות לאחר SDS-PAGE. גם נוגדנים נגד Phosphospecific Ser396 היו יעילות used כדי לזהות זירחון IRF3 לאחר ילידים-עמוד 20. חשוב לציין, Ser402 באשכול C-מסוף אתרי phosphoacceptor נמצא גם להיות חשוב להפעלת IRF3 וזירחון של Ser402 נצפה באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה של IKKε /-phosphorylated TBK1 IRF3 10,21,28. עם זאת, למרות שני ניסיונות שונים (NG, לא פורסם), אין נוגדני phosphospecific זמינים כעת לעקוב זירחון של השאריות הספציפיות הזה in vivo. שים לב שהנוגדנים נגד phosphospecific Thr157 וSer339 גם תוארו 11,13. נוגדני phosphospecific נוספים אלה יכולים לשמש בהליך של הרזולוציה גבוהה SDS-PAGE דומה לזה שתואר כאן. במקרה זה, ג'לי SDS-PAGE גדול נוסף היה נדרש לכל נוגדן ומעובד באותו אופן כמו ג'ל # 2 (איור 1). למיטב ידיעתנו אין נוגדנים נגד phosphospecific Ser173 או Thr390 עדיין תוארו,אבל הם יכולים להוסיף בקלות לפרוטוקול המתואר כאן ברגע שהם הופכים לזמינים 14,20.
פעילות IRF3 הוא הופסק על ידי השפלה תיווך פרוטאזום של צורות hyperphosphorylated 11,17. הפרוטוקול המתואר כאן גם מאפשר ניטור של השפלה IRF3 כאשר הקינטית של גירוי ממושך, והוא מצמידים את השימוש במעכבי פרוטאזום (MG132, lactacystin או bortezomid). בדרך כלל, בתאי A549 נגועים בsev 40 HAU / 10 6 תאים, זירחון IRF3 מתחיל ברגע ששפלת זיהום וIRF3 2 שעות שלאחר sev מתחילה לאחר 12 שעות. השפלה תיווך פרוטאזום תהיה הסיקה מההפחתה שנצפתה של צורות שלישית ורמות IV בנקודות זמן מאוחר שמתהפכות בתנאים עם מעכבי פרוטאזום. זה יהיה גם לתרגם במולדת-עמוד בהפחתה של רמות דימר IRF3 שהם התאוששו על טיפול מעכבי פרוטאזום 29. חשוב לציין, techni ברזולוציה הגבוההque מוצג כאן מאפשר הבחנה בין תהליך השפלה וחוסר ההפעלה. ואכן, שתי השפלה וחוסר ההפעלה של תוצאת IRF3 בהעדר זיהוי של דימר / phospho-Ser386 / 396. עם זאת, חוסר ההפעלה קשור לזיהוי של מונומר IRF3 ושל צורות I ו- II, ואילו מיני IRF3 אלה אינם מזוהים כאשר IRF3 נפגעת 30.
Immunoprecipitation בשילוב עם הניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסה הוא שיטה של בחירה כדי לזהות זירחון vivo של IRF3 באתרים שונים. טכניקה זו משמשת כדי לאשר את זירחון של IRF3 בSer173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 וSer402 שאריות 10,20,21. עם זאת, ספקטרוסקופיית מסות עדיין לא טכניקה סביר / benchside שיכול לשמש בקלות לניתוח יומי של הפעלת IRF3 הבאה כמה גירויים בנקודות זמן שונים. לכן, ההליך מתואר כאן באמצעות SDS-PAGE מצמידים את הילידים-PAGE בשילוב עם immunoblot באמצעות נוגדנים כולל וphosphospecific מהווה גישה מעשית, במחיר סביר ורגישה כדי לזהות את כל הצורות מוגדרות כיום של IRF3 actived.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
