Introduction
Yayg ve yapısal olarak ifade transkripsiyon faktörü İnterferon (IFN) Düzenleyici Faktör 3 (IRF3) çoğunlukla IFNβ indüksiyonu yoluyla patojenlere karşı ilk savunma hattı için kritik değil, aynı zamanda kemokin (CC motif) indüksiyonu ligandı 5 (CCL5 yoluyla ) ve tetratricopeptide ile IFN ile uyarılan proteini dahil olmak üzere birçok antiviral proteinlerdir IFIT1 / 2/3 3/1 tekrarlar. Ya da lipopolisakkarid (LPS) 4: IRF3 aktivasyonu poli-inozinik-polisitidilik asit (poli I Cı) için aşağıdaki sayıda virüs enfeksiyonu veya maruz kalma bildirilmiştir. Önemlisi, en çok çalışılan virüsler IRF3 aracılı yanıtı kaçmasına ve böylece ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık savunma mekanizmaları 5 kaçmak için gelişmiştir. Böylece, IRF3 aktivasyon izleme doğuştan antiviral konak savunma moleküler mekanizmalarını anlamak için değil, aynı zamanda bu tepkiyi ortadan kaldırmak için virüsler tarafından kullanılan stratejiyi belirlemek için büyük önem taşımaktadır.
ent "> yayınlanmış bir çok rapor Ancak düşük çözünürlüklü, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezine bağlanmış IRF3-hedef gen indüksiyonu izlenmesi (IFNB1 ve IFIT1) tarafından gerçekleştirilen IRF3 aktivasyonu ve / veya lusiferaz raportör geni deneyinde sadece sınırlı analizi sağlar (SDS- PAGE) IRF3 analizi. Ancak, çok sayıda biyokimyasal çalışmalar çeşitli IRF3 mutantlar ve IRF3 kristal yapısı 6-11 aydınlatılması davranış analizi de fosforilasyonu ile sıralı post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi karmaşık tabi tutulması IRF3 kurmak katkıda Birden çok siteleri. IRF3 aktivasyonunda rol fosforilasyon grubu hücre tipine uyarıcı bağlıdır ve en muhtemel görünmektedir. enfekte edilmemiş hücrelerde, IRF3 fosforilatlanmamış ve hipofosforile türleri 1, Thr135 ve Ser173 içeren phosphoresidues, ihtiva eden birlikte görülmektedir -198 aa N-terminal bölgesi 6,12-14. Bu hipofosforile f birikimiIRF3 biçiminde olabilecektir stres indükleyicileri, büyüme faktörleri ve DNA'ya hasar veren ajanlar 6 tarafından indüklenir. Transaktivasyon domenini ihtiva eden IRF3 C-terminal bölgesinde Ser / Thr tortularının fosforilasyonu virüs ile aktivasyonunun takiben tetiklenmektedir, poli I: bir hücre tipine bağlı bir şekilde 15-17 C ve LPS. IRF3 C-terminal fosforilasyonu her dimerizasyonu yoluyla IRF3 aktivasyonu, nükleer birikimi, CREB ile birlikte katkı yapan iki ana grupta, Ser385 / Ser386 ve Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 düzenlenen en az 7 farklı phosphoacceptor sitesi içermektedir bağlayıcı protein (CBP) / p300 koaktivatör, hassas tepki elemanı (ISRE) konsensüs dizileri ve hedef genlerin 9,10,17-19 transaktivasyonunu IFN bağlama DNA. Thr390 fosforilasyonu, aynı zamanda, virüs kaynaklı IRF3 aktivasyonu 20 katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Kütle spektrometrisi IRF3 analizleri Ser386, Thr390, Ser396 ve Ser402 tortuları doğrudan doğruya phosphorylat olduğunu göstermiştirkB kinaz inhibitörü ε (IKKε) tarafından ed / TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1) 9,10 kinaz. C-terminal tortularının fosforilasyonu de, aynı zamanda polıubikutın eklemeyi ve proteazom aracılı degradasyon 10 boyunca IRF3 aktivasyon sonlandırılması için gereklidir. Bu süreç aynı zamanda propil izomeraz Pin1 10,11 alımı için gerekli olan Ser339 de fosforilasyonu, bağlıdır. En az fosfo-Ser339 / 386/396 kalıntıları içeren IRF3 türleri hiperfosforile formlar olarak kabul edilir. Her sitenin tam sırası ve fonksiyon tartışma 10,21 meselesi olmaya devam etmektedir. Bu aktive IRF3 homojen bir devleti temsil etmez, ancak farklı fosforilasyon veya dimerizasyon karakteristiklerini gösteren farklı aktif türlerin 10,22 mevcut olduğu açıktır.Belirli patojenlere karşı yanıt olarak IRF3 aktivasyon tam bir anlaşılmasını sağlamak için, ch böylece gerekli olanuyarılmaktadır aktifleştirilen türlerin bu aracterize. IRF3 hedef genlerin, IFNB1 ve IFIT1 indüksiyonu, IRF3 aktivasyonu için güvenilir bir okunmasını sağladığı kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, bu genlerin ekspresyonunu takip ve kontrol IRF3 farklı aktivasyon durumları arasında ayrım yapmaz. Belirli bir ortamda IRF3 aktivasyon devletler kapsamlı bir analizi onun fosforilasyon ve dimerizasyon durumunun 10 detaylı karakterizasyonu dayanır. Fosforlanmamış (Biçim I), (Biçim II) ve hiperfosforile hipofosforile (formlar III ve IV) IRF3 formları 6,18,23 başarılı bir şekilde yüksek çözünürlük, SDS-PAGE analizinde azalan hareketlilik çözülebilir. Monomerik ve dimerik IRF3 türleri etkili bir nativ-PAGE analizi ile tespit edilebilir. Farklı IRF3 phosphoacceptor sitelerinin karşı fosfospesifık antikorlar ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman bu yaklaşımlar büyük ölçüde daha iyidir.
Standart protokoller kötü bir çözünürlük izinfarklı IRF3 fosforilatlanmış biçimlerine etkili ayrılmasına izin vermez proteinler. Burada, toplam ve fosfospesifık antikorlar kullanılarak bağışıklık beneklenme ile kombinasyon halinde doğal-PAGE bağlanmış SDS-PAGE kullanılarak farklı virüs aktive IRF3 türlerinin meydana getirmenin gözlenmesi için en yüksek çözünürlük elde etmek için detaylı bir prosedür açıklanmaktadır. Etkin arasında farklı in vivo ayrımı IRF3 formları SDS-PAGE üzerinde görülen hareketlilik vardiya dayalı yapılır. Buna ek olarak, IRF3 monomer ve dimer denatüre edici olmayan elektroforez ile ayırt edilebilir. İmmunoblotta bu iki tamamlayıcı tekniklerin kombinasyonu IRF3 fosforilasyonu aracılı aktivasyonu tam bir analizi için gerekli tüm bilgileri elde etmek için bir ekonomik ve duyarlı bir yaklaşım olduğunu kanıtlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: protokol Sendai virüsü (SeV) ile enfekte A549 hücreleri kullanılarak burada açıklanmıştır. Bununla birlikte, SDS-PAGE ve yerel PAGE için protokol aynı zamanda bugüne kadar test edilen tüm insan ve kemirgen hücre tipleri, çeşitli IRF3 aktive uyarıcı 9,15,19,24,25 ile uyarılmış, özellikle miyeloid hücrelerin ile çalışır.
A549 Hücrelerinin 1. Enfeksiyon
- 37 ° C /% 5 CO2 20 bir 15 sm'lik plaka içinde kültür içinde A549 hücreleri korumak mi 10% ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (HI-FBS) ve% 1 L-glutamin içeren F12K / Ham ortamı (komple F12K / Ham ortamı).
NOT: hücre kültürü ve tedavi için kullanılan bütün çözeltiler steril olması gerekmektedir. - Enfeksiyondan önce 24 saat sonra, ortam aspire ve damıtılmış fosfat tamponlu tuzlu su, oda sıcaklığında (D-PBS) 10 ml yıkama hücreleri.
- Hücrelerin kapak ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyona her plaka,% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1 ml ilave edilir.
- En kısa sürede inci gibi inkübasyon durdurune hücreler yumuşak bir yandan plaka dokunarak plakadan kopmaya başlar. Plaka başına önceden ısıtılmış tam bir F12K / Ham vasatı içinde 10 ml ilave etmek suretiyle, tripsin inaktive ve 15 ml konik bir tüp hücreleri transferi.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 350 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve özellikle de homojen tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tam bir F12K / Ham vasatı 8 ml hücre pelletini.
- Hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Önceden ısıtılmış tam bir F12K / Ham vasatı içinde 4 ml 60 mm plaka başına 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda hücreler Seed. 20 inkübe - 37 ° C /% 5 CO 2. 24 saat sonra, 20 - 24 saat, hücreler% 90 konfluent tek tabaka (bu, 1.5 x 10 6 hücre karşılık gelir) oluşturur.
- Ortamı çıkarın ve serumsuz F12K / Ham vasatı içinde 2 ml (SFM) ile hücrelerin yıkayın. 60 mm plaka başına taze SFM 2 ml ekleyin.
- Kısaca buz ve vorteks (saklanan -80 ° C'de aliquoted) Sendai virüsü (SeV) bir kısım çözülme.
- Th seyreltinÖnceden ısıtılmış SFM e virüsü 60 HAU / 100 ul elde etmek. Aşağı usulca yukarı pipetleme karıştırın ve 40 HAU / 10 6 hücre enfeksiyon gerçekleştirmek için plaka başına seyreltilmiş virüsün 100 ul ekleyin. Enfekte olmayan kontrol plakası virüs katmayın.
- 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörde inkübe hücreleri. Elle 3 veya 4 kere plakaları ajitasyon ya da enfeksiyon ilk bir saat boyunca, inkübatör doğrudan yerleştirilir otomatik yörüngesel veya sallanan karıştırıcı kullanılarak.
- 2 saat sonrası enfeksiyon,% 10 HI-FBS bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere% 20 HI-FBS içeren F12K / Ham orta 2 ilave edin.
- Sırasıyla, 3, 6 ve 9 saat toplam enfeksiyon süreleri için ek bir 1, 4 ve 7 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörde inkübe hücreleri. Bu zaman noktalarının her birinde, 2.1 adıma devam eder.
Tüm Cep Ekstraktlarının 2. Hazırlık (BOA)
- Enfeksiyon orta çıkarın. 1 ml kazıma yoluyla hücreler hasatve buz gibi soğuk D-PBS önceden soğutulmuş bir 1,5 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
- 20 sn için 4 ° C'de 16,000 x g'de santrifüj ile hücreler Pelet ve dikkatli bir şekilde, D-PBS tüm izlerini süzün.
NOT: Bu adımda, hücre peleti, doğrudan protein ekstraksiyonu ve flaş dondurulmuş sıvı azot ya da kuru buz / etanol banyosu içinde liziz kadar -80 ° C'de saklanır tabi tutulabilir. - 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA,% 10 gliserol ve% 1 Nonidet P-40 deiyonize su içinde ihtiva eden liziz tamponu (GKD 2 O). Irticalen proteazı (1 ug / ml löpeptin ve 2 ug / ml aprotinin) ve fosfataz inhibitörleri ekleyin (5 mM sodyum fluorür, 1 mM sodyum ortovanadat, 2 mM p-nitrofenil fosfat ve 10 mM β-gliserofosfat pH 7.5 aktive edilmiş).
Not: inhibitörsüz lizis tamponu, 4 ° C'de saklanabilir. Sodyum ortovanadat aktivasyonu için özel bir protokol, spesifik reaktifler / sanayii Tablo anlatılannt. - Liziz tamponu 70 ul hücre pelletini. Tipik lizat konsantrasyonu / ul yaklaşık 2 mg olacak.
- 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 15 sn için bir sıvı azot banyosu içinde inkübe edilerek, lizat flaş dondurma. Tamamen 10 sn için eritilmiş ve vorteks kadar oda sıcaklığında lizat çözülme. Donma / çözülme / Vortex döngüsü 3 kez tekrarlayın.
- Seçenek olarak ise, 1 dakika süre ile, bir etanol / kuru buz banyosu içinde dondurma adımı gerçekleştirin.
- 20 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g'de santrifüjleyin. Yeni ön soğutulmuş 1,5 ml santrifüj tüpüne süpernatant (WCE tekabül eder) aktarın. Her zaman buz üzerinde KKE tutun.
- Örneğin Bradford bazlı protein tahlili 26 olarak liziz tamponu ile uyumlu herhangi bir protein ölçümü prosedürü kullanılarak proteinleri ölçmek.
Yüksek Çözünürlüklü SDS-PAGE ile KKE 3. Çözünürlük
- Üç denatüre elektroforez jelleri hazırlayın.
- Saptanması için(1: 37,5), 375 mM Tris-HCI pH 8.8 (RT),% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS IRF3 formları,% 7.5 akrilamid / bis-akrilamid oluşan bir ayırma jel ile 16 cm uzunluğunda en az iki jeller dökün ),% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 GKD 2 O TEMED ve% 4 akrilamit oluşan bir istifleme jeli, 62,5 mM Tris-HCI, pH 6.8 (RT),% 0.05 SDS,% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 GKD 2 TEMED O.
Dikkat! Akrilamid, TEMED ve SDS zehirli ve / veya tahriş edici bulunmaktadır. Koruyucu eldiven giyin ve davlumbaz altında manipüle. - SeV proteinlerinin tespiti için, ayırma jeli% 12 akrilamid içeren hariç 3.1.1'de tarif jele benzer özelliklere sahip 8.5 cm uzunluğunda en az bir jel dökün.
- Saptanması için(1: 37,5), 375 mM Tris-HCI pH 8.8 (RT),% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS IRF3 formları,% 7.5 akrilamid / bis-akrilamid oluşan bir ayırma jel ile 16 cm uzunluğunda en az iki jeller dökün ),% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 GKD 2 O TEMED ve% 4 akrilamit oluşan bir istifleme jeli, 62,5 mM Tris-HCI, pH 6.8 (RT),% 0.05 SDS,% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 GKD 2 TEMED O.
- 1 eklenerek adım 2.6 'de elde edilen denatüre WCE: 4 (h / h) 5x yükleme tamponu (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT),% 10 SDS,% 20 (p / v) gliserol,% 0.0005 bromofenol mavi ve 100 ° C'de, ardından bir ısıtma GKD 2 O içinde% 25 β-merkaptoetanol)10 dakika işleme sokuldu. Hızlı sıkma tüpleri kap formları yoğunlaşmayı çökertmek için.
Dikkat! β-merkaptoetanol Teneffüs edilmesi toksiktir. Koruyucu eldiven giyin ve davlumbaz altında manipüle. - Geçiş tertibatında jeller monte edin. 25 mM Tris-Base,% 0.1 SDS ve damıtılmış su içinde 192 mM glisin (dH 2 O) ihtiva eden tampon maddesi ile, üst ve alt bölmeleri doldurun.
- Yük, her 16 cm jel bir oyuk moleküler ağırlık standart 14 ul 8.5 cm jel bir oyuk moleküler ağırlık standart 7 ul. IRF3 formları tespiti için aşama 3.1.1 hazırlanan iki jellerin oyuk başına denatüre BOA'da yük 30 ug (adım 3.2 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). Yük 8 - SeV analizi için aşama 3.1.2 hazırlanan jel üzerinde oyuk başına denatüre BOA'da 10 ug (adım 3.2 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır).
- Göç ön jel alt ulaşıncaya kadar 30 mA sabit akımda jeller çalıştırın.
NOT: Göç genellikle approxima sürertely 16 cm jel 3 saat ve 8.5 cm jeli 45 dk. - Nitroselüloz membranlar (aşama 5) üzerine transfer edin.
Yerli-PAGE ile IRF3 dimerizasyonunu 4. Analizi
Not: Bu yöntem ilk olarak Dr. T. Fujita 27 grubu tarafından tanımlanmıştır.
- (-) Ve alt (+) odası elektroforez tamponlar, üst hazırlayın. Üst bölme tamponu GKD 2 O. 25 mM Tris-HCl, pH 8,4 (RT), 192 mM glisin ve% 1 sodyum deoksikolat (DOC) oluşmaktadır Alt bölme tamponu GKD 2 O. 25 mM Tris-HCl, pH 8,4 (RT) ve 192 mM glisin içeren
Not: Üst ve alt bölme elektroforez tamponlar, kullanılana kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Ancak, elektroforez gerçekleştirmeden önce oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış emin olun. - , 375 mM Tris-HCI pH 8.8 (RT),% 1 cephane:% 7.5 akrilamid / bis-akrilamid (1 37,5) ihtiva eden 8.5 cm uzunlukta, en az bir denatüre edici olmayan çözme jel dökünGKD 2 O. TEMED nium persülfat ve% 0.1
- Buz üzerinde 30 dakika boyunca 40 mA sabit akımda jel ön çalıştırın. Yaklaşık alt kamara elektroforez tamponunun seviyesine buz içine koşu aparatı basın. Jel buz değildir önemlidir.
- 1 (h / h) ile kombine 2 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT),% 30 gliserol ve% 0.1 bromofenol mavisi ihtiva eden O.: ön çalışma sırasında, WCE 2x nativ-PAGE yükleme tamponu 1 ile buz üzerinde tutulmalıdır karıştırın
- Yük 8 - hemen önce çalışma sonunda (adım 4.4 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), 10 ug WCE.
- Ön çalıştırmak için yukarıda tarif edildiği gibi geçiş cephesinin, jel (yaklaşık 40 dakika) alt ulaşıncaya kadar, buz üzerinde 25 mA sabit akımda jel çalıştırın.
IRF3 Türlerin 5. İmmüno-lekeleme Analizi
- GKD 2 O. 25 mM Tris-Base ve 192 mM glisin içeren transfer tampon hazırlayın Buzdolabında kullanımdan önce 4 ° C'de transfer tamponu.
- Nitroselüloz zarın ıslak üç adet aktarma tampon içeren bir plastik / cam kutuda jeller biraz daha büyük bir boyutta kesilir. Bir köşesini keserek zarın yönünü belirtiniz. Transfer tamponu 3 kez tekrar edilebilir. Kullanımlar arasında 4 ° C'de tampon saklayın.
- Uncast jelleri (SDS-PAGE ve ana-PAGE) ve doğru şekilde her jel bir köşesinde kesmek.
- Nativ-PAGE için, transfer tampon maddesi aktarmadan önce DOC kaldırmak için SDS-PAGE tamponu içinde çalışan en az 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak, oda sıcaklığında jel inkübe edilir.
- 10 dakika - 5 transfer tampon maddesi içinde jelleri (SDS-PAGE ve yerli-PAGE) ile inkübe edin.
- Pozitif elektrot (köpük yastık / filtre kağıdı / zar / jel / filtre kağıdı / köpük yastık) doğru membranı ile bir transfer kasetinde jel başına bir transfer sandviç monte edin. Sandviç katmanları arasındaki tüm kabarcıklarını çıkarmak için dikkatli olun.
- Tavsiye b gibi transferini gerçekleştirmeky kullanılan transfer cihazları için üretici.
NOT: sallanan veya orbital sallayarak platformda bir sonraki adımda tüm inkubasyon ve yıkama yapın. - Transfer süresi sonunda, GKD 2 O. 7% asetik asit,% 40 etanol ve% 3 gliserol içeren sabitleme çözeltisi içinde 15 dakika boyunca zarların inkübe Membranları yıkamak PBS içinde 3 kez 5 dakika (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10.2 mM Na 2 HPO 4 ve 1,8 mM KH 2 PO 4 dH 2 O).
Dikkat! Asetik asit toksik, tahriş edici ve yanıcı olduğunu. Koruyucu eldiven giyin ve davlumbaz altında manipüle.
NOT: sabitleme çözümü birden çok kez tekrar edilebilir. - Yerli-PAGE membran için 5.11 adıma geçin.
- GKD 2 O. 6,57 mM kırmızı ponceau ve 1% asetik asit içeren kırmızı bir ponceau çözeltisi içinde 1 dakika boyunca kuluçkalanmadan önce dH 2 O hızla üç SDS-PAGE membranlar durulayın
NOT: Kırmızı ponceau çözüm r olabilir birkaç kez eused. - Arka plan kırmızı lekeli protein bantları görmek için yeterli beyaz olana kadar dH 2 O membranlar durulayın. Bir kalem ile işaretçileri Not ve proteinlerin çevresinde aşırı membran kesti. Çalkalama altında PBS içinde 5 dakika boyunca kuluçkalama ile membranlar destain.
- Bloke çözeltisi içinde 4 ° C'de (PBS,% 0.05 Tween 20 ve% 5 yağsız kuru süt ihtiva eden en RT veya O / N oranında 1 saat süreyle inkübe edin membranlar (PBS-T-süt). Membranlar 3x 5 dakika yıkayın PBS-T.
Not: PBS-T yıkama isteğe bağlıdır ve% 5 bovin serum albümini (PBS-T-BSA), bir sonraki aşamada (Şekil 1 ve Tablo 1) içeren PBS-T ile seyreltilmiş antikor uygulanırken, yalnızca sıkı olarak gereklidir. - . Şekil 1 ve Tablo 1 'de ayrıntılı olarak, sırayla uygun primer antikorlar ile (SDS-PAGE ve yerli-PAGE'den) Dört membranlar inkübe PBS-T içinde 5x 5 dakika yıkama yapın.
İmmünoblot Analizi Şekil 1. Sıra. Şematik çeşitli IRF3 fosforlu ve dimerik / monomerik formlar tespit etmek için gerekli olan tek tek SDS-PAGE ve nativ-PAGE jelleri açıklar. Immünoblot prosedürü her jelden elde edilen zarın tatbik antikorların spesifik sırası tarif edilmektedir. Anti-aktin antikor başka spesifik antikorların uygulanmasından önce numune eşit yüklemeyi sağlamak için, ilk kullanıldığı göz önünde bulundurulmalıdır. Anti-aktin antikor ile diğer dizisi de çalışır, anti-fosfo-IRF3 antikorlar sonra tatbik edildi. Sıyırma, anti-aktin ve anti-SeV antikorları veya anti-fosfo-IRF3 nedeniyle sinyallerin büyüklüğünü örtüşen anti-IRF3 antikorlar arasındaki kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Birincil antikorlar, | Seyreltme | Seyreltme tamponu | Kuluçka | İkincil antikorlar, | Yorumlar |
| Anti-Aktin | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | Oda sıcaklığında 15 dakika | Anti-fare | SDS-PAGE sonra kullanın % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antibodyies birkaç kez tekrar edilebilir. |
| Anti-IRF3-P-Ser386 | 1/200 | PBS-T-BSA | O / N 4 ° C'de | Anti-tavşan | Yerli-PAGE sonra kullanın. Bu seyreltilmiş antikor tekrar tavsiye edilmez |
| Anti-IRF3-P-Ser396 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | O / N 4 ° C'de | SDS-PAGE sonra kullanın. Bu seyreltilmiş antikoru Anti-IRF3-P-396 hücre haberleşmesi edinilebilir yeniden tavsiye edilmez. Optimal seyreltme Bu antikor için 1 / 1.000 olarak tanımlanmıştır, ancak çok değişebilir. | |
| Anti-IRF3-P-Ser398 | 1 / 10,000 | PBS-T-BSA | O / N 4 ° C'de | Anti-tavşan | SDS-PAGE sonra kullanın. Bu seyreltilmiş antikor tekrar tavsiye edilmez |
| Anti-IRF3 tam uzunlukta | 1/7500 | PBS-T-süt | Oda sıcaklığında 3 saat | Anti-tavşan | SDS-PAGE sonra kullanın. Anti-IRF3 tam uzunlukta antikor, bir nativ-PAGE sonra kullanılabilir, ancak monomer tespit etmek için daha az duyarlıdır. % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antikorlar birkaç kez tekrar edilebilir. |
| Anti-IRF3-NES | 0,5 ug / ml | PBS-T-süt | Oda sıcaklığında 3 saat | Anti-tavşan | Yerli-PAGE sonra kullanın. % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antibodyies birkaç kez tekrar edilebilir. |
| Anti-SeV | 1 / 14.000 | PBS-T-BSA | Oda sıcaklığında 3 saat | Anti-tavşan | SDS-PAGE sonra kullanın. % 0.02 sodyum azid mevcudiyetinde 4 ° C 'de depolandığı takdirde Seyreltilmiş antibodyies birkaç kez tekrar edilebilir. |
| Not: HRP-bağlı sekonder antikor için kullanılan seyreltme ve tampon bunun bir şirketten diğerine değişir optimize edilmesi gerekir. | |||||
Antikorların Tablo 1. Teknik İmmünoblotting Prosedürü kullandı.
- (HR yaban turpu peroksidaz ile membranlar inkübeP) Şekil 1 ve Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi sekonder antikor ile konjüge edilmiş. Tam Tween izlerini ortadan kaldırmak için membranlar PBS içinde 2 x 5 dakika süre ile, PBS-T içinde 5x 5 dak, yıkayın.
- Tam membranlar karşılamak için yeterli geliştirilmiş kimyasal parıltı maddesi bir hacimde 1 dakika boyunca zarların inkübe edin. Filtre kağıdı kullanarak membranlar kurutun.
- Immunreaktif bantları görselleştirmek için bir ışık saçan görüntü analizörü membranlar yerleştirin.
- Alternatif olarak, duyarlı X-Ray filmler kullanılarak immunorekatif bantlar algılaması gerçekleştirmek.
- PBS içinde 5 dakika 3x membranlar yıkayın.
NOT: Bu aşamada membranlar kuru tutulabilir. Daha sıyırma gereklidir, ancak, bu membran kurumadan sıyırma gerçekleştirmek için daha iyidir. Zarlar da PBS kısa dönem için saklanabilir. - Antikorlar ile inkübasyondan arasındaki sıyırma gerektirmeyen zarlar için doğrudan adım devam (Şekil 1 e bakınız)5,20.
- Sıyırma antikorlar, 50 ° C 'de GKD 2 O% 2 SDS, 62,5 mM Tris-HCI, pH 6.8 (RT) ve% 0.7 β-merkaptoetanol ihtiva eden önceden ısıtılmış sıyırma çözelti içinde inkübe membranlar (Şekil 1 e bakınız) arasındaki gerekli olduğunda Normal ajitasyon altında 20 dakika karıştırıldı. PBS içinde 5 dakika 3x membranlar yıkayın.
NOT: sıyırma işlemi sırasında ajitasyon anahtarıdır. Sıyırma, bir hibridizasyon etüvü içinde gerçekleştirilebilir. Seçenek olarak ise, bir su banyosu içinde, plastik torbalara ve batırma membranlar kullanılarak gerçekleştirilebilir sökülmesi. Inkübasyon sırasında 5 kez - Bu durumda, bu membranlar 4 çalkalanması için önemlidir. - PBS-T-süt 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N C'da 1 saat için membranlar inkübe edin.
- Yineleyin Şekil 1'e göre 5.16 ile 5.12 arasındaki adımları yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2, yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ile BOA'da giderilmesinden sonra, Ser396 ve Ser398 karşı IRF3 toplam antikorlar ve IRF3-fosfospesifık antikorlar ile IRF3 tipik bir immunoblot görüntüsünü göstermektedir. Uyarılmamış A549 hücrelerinde, IRF3 50 ° C'de iki grup ve olmayan fosforile (form I) 'e uygun SDS-PAGE üzerinde 53 kDa ve hipofosforile (Biçim II) IRF3 türleri olarak tespit edilir. Zamana bağımlı vardiyada 9 saat sonuçlar yavaş yavaş I biçimlerinden de ayırt edilirler ve II hiperfosforilize formları III ve IV, göç etmek - A549 hücrelerinin Poz 3 Sev için. Hiperfosforilize bantlar kDa 55-57 de göç ederler. Formlar III ve IV de özellikle Ser396 ve Ser398 karşı fosfospesifık antikorlar kullanılarak immünodeteksiyona edilir. Aktin immunodeteksiyon şerit arasında eşit bir yükleme kontrolü olarak görev yapar. SeV enfeksiyonun bir kontrol virüsü nükleokapsid p birikimi ile gösterilir60 kDa'da göç eder rotein (N).
Şekil 3'te, IRF3 saptanması profili gösterilmektedir anti-IRF3-NES antikorlar ve Ser386 karşı fosfospesifık antikorlar kullanılarak bağışıklık beneklenme ardından nativ-PAGE ile yeniden çözülmüş BOA'da elde edilen. Uyarılmamış A549 hücrelerinde, IRF3 monomerik formda tekabül eden tek bir bant olarak algılanır. 3 Sev enfeksiyonu üzerine - 9 saat, IRF3 dimerik forma karşılık yavaş yavaş göç bandın eşlik eden birikimiyle IRF3 monomer azalma seviyeleri. Ser386 karşı fosfospesifık antikorlar tek IRF3 dimer türler olarak algılar.
Farklı IRF3 Fosforile Türlerin Şekil 2. Algılama (Biçim I-IV). A549 hücrelerinde SeV enfeksiyonunun sebep olduğu A549 hücreleri indica için şev ile enfekte edilmeden bırakılmıştır veya enfekte edildited kez. WCE anti-IRF3-Ser396 (IRF-3-P-Ser396) kullanılarak bağışıklık beneklenme (IB) takip yüksek çözünürlüklü, SDS-PAGE ve anti-IRF3-Ser398 (IRF-3-P-Ser398) fosfospesifık antikorlar ve anti ile analiz edildi -IRF3 tam uzunluktaki protein antikorları. Enfeksiyon, anti-SeV antikorlar kullanılarak gözlenmiş (nükleokapsit N proteini gösterilir). Anti-aktin antikorları yükleme kontrol olarak kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil A549 hücrelerinde sev tarafından fosforile / dimerize IRF3 indüksiyon 3. İzleme. A549 hücreleri belirtilen zamanlar için enfekte edilmeden bırakılmıştır ya sev ile enfekte edilmiştir. WCE anti-IRF3-Ser386 (IRF-3-P-Ser386) fosfospesifık antikorlar ve anti-IRF3-NES antib kullanarak yerel-PAGE ile çözülmüş ve immunoblotting ortaya çıkarılmıştırto Odies. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif protokolü IRF3 dimerik / monomerik ve phosphoforms I-IV ayırt birçok fosfospesifık antikorların kullanımı bağlanmış yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ve nativ-PAGE bir kombinasyonundan oluşur. Bu IRF3 türlerin uygun algılama tam belirli bir ortamda IRF3 aktivasyonunu tanımlamak için gereklidir. Örneğin, aktive makrofajlar LPS uyarımı, hipofosforile edilmiş (Biçim II) sahip dimerik, Ser396 / 398 fosforile IRF3 oluşmasına yol açar, ancak SDS-PAGE 15 (Form III ve IV), desen hiperfosforile değildir. Tarif edilen protokol kullanılarak, bu profil Ser386 ve Ser396 fosforilasyon 10 ek olarak, ek bir Ser339 fosforilasyonunu gerektiren virüs kaynaklı hiperfosforile formlardan ayırt edilebilir. Önemli olarak, bu aynı zamanda dimerizasyonunun sergiler, ancak transkripsiyonel olarak 10 aktif olmayan Ser396 fosforile türler arasında ayrım sağlar. Importantly, bu IRF3 phosphoforms formu I-IV model, insan IRF3 için de geçerli olduğunu belirtmek gerekir. Murin IRF3 sadece SDS-PAGE'nin ardından İmmunoblotta fosfospesifık antikor kullanılarak ve yerli-PAGE ile benzer bir model ve bu nedenle IRF3 aktivasyonu özelliği sergilemez.
SDS-PAGE ile IRF3 belirgin fosforile türlerin yüksek çözünürlüklü ayırma kazanılan özel parametreleri gerektirir. Uygun çözünürlük için, 16 cm minimum uzunluğa sahip jeller kullanmak çok önemlidir. Hatta ayrılık jel bu uzunluğu ile, bu göç ön değişik IRF3 formlarının uygun ayırım elde etmek jel alt ulaşmak izin anahtarıdır. Ayrıca, istifleme jel iyi tanımlanmış bantları elde etmek için tarak altında 1 cm minimum genişletmeniz gerekir. IRF3 ve hiperfosforilize formları birbirine çok yakın göç gibi bu, çok önemlidir. Kötü odaklanmış bantları phosphoryla arasındaki ayrımın olmaması neden olacaktırted ilgili kantifikasyon zarar oluşturur. Buna ek olarak, amonyum persülfat ve TEMED konsantrasyonu bir SDS-PAGE protokolü diğerine değişir. Burada belirtilenler bu konsantrasyonlarda değişimi belirgin IRF3 türlerin ayrılması çözünürlüğü bozduğu bulunmuştur.
Nativ-PAGE yoluyla IRF3 dimer oluşumu tespiti başlangıçta Dr. T. Fujita grubu tarafından tanımlanmıştır. Bu protokol, p300 CBP / 27 IRF3 dimer ayrışmasını sağlar tamponu ihtiva eden DOC kullanır. Bu son derece hemen -80 ° C 'de BOA'da depolanması olarak hücre lizizi sonrasında ana-PAGE devam etmek için tavsiye edilir IRF3 monomer / dimer oranı önemli bir değişikliğe neden olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, üst ve alt bölme tamponlarının pH'si oda sıcaklığında pH 8.4 ayarlanır ve 4 ° C 'de, tüm bileşenleri karıştırıldıktan sonra dimer vs monomer doğru ayrılmasını sağlamak için çok önemlidir. Bir ayrılık8,5 cm'lik bir minimum uzunluğa sahip jel IRF3 monomer ve dimer uygun bir ayrım sağlar. Numune artı yükleme tamponu ideal hacim hacmi minimumda tutulması olduğunda çözünürlük iyidir sıra 5 mm yaklaşık 8 ul. Bu nedenle, bu yüksek konsantrasyonlu WCE elde etmek üzere lizis tamponu düşük hacmi kullanılması önemlidir. Bununla birlikte, etkili bir ekstraksiyon, en azından hücre peleti hacmi 5 kat olarak parçalanması, dikkate alınmalıdır. Numunelerin hacmi, yukarıda belirtilen sınır değeri aşarsa, bu monomer / dimer zayıf bir çözünürlük sonucunu doğurabilir. Bu GKD 2 O. TEMED% 4 akrilamit, 62,5 mM Tris-HCI, pH 6.8 (RT),% 1 amonyum persülfat ve% 0.1 ihtiva eden bir istifleme jel eklenerek çözülebilir Bu bantlama bozmadan örnekleri yüklemek çok önemlidir. Kuyunun dibine bir jel yükleme ucu yakın yavaş yükleniyor çok iyi sonuçlar verir.
Burada, tarif in vivo deteSer386 9, Ser396 19 ve Ser398 15 karşı mevcut fosfospesifık antikorlar kullanılarak özel artıklarda fosforilasyon ction. IRF3 mutantları ve kütle spektrometresi kullanımı bu artıklar virüs enfeksiyonu veya IKKε / TBK1 kinazların aşırı ekspresyonu üzerine fosforile ve IRF3 aktivasyon 6,9,10,19,21 için kritik olduğu teyit analizi yapılmıştır. SDS-PAGE'nin ardından fosfo-Ser396, fosfo-Ser398 ve total IRF3 bir immunodeteksiyon iki özdeş jeller (Şekil 1) kullanımını gerektirir. Fosfospesifık antikorlar zar sıyrılması sonra kullanılır Gerçekte, ciddi hassaslık kayıpları gözlenir. Bu nedenle, bu, ilk önce fosfospesifık antikorlar kullanılması tavsiye edilir. Alternatif birincil ve ikincil antikorlar da çalışabilir unutmayın, ancak belirli seyreltmeler ve kullanım sırası optimize edilmelidir. IRF3 analizi için, WCE 30 ug IRF3 önemli bir algılama almak için uygun olan4 mm genişliğindeki kuyu kullanıldığında belirtilen antikorlar kullanılarak imüno lekelemesi ile fosforilasyonu. Çeşitli virüsler ile enfekte bir çok hücre tipinde in 30 ug, uygun olduğu bulunmuştur, ancak bu miktar, hücre tipine ve uyarılmasına bağlı olarak artırılması gerekebilir. Bu, SDS-PAGE için taze ekstreler kullanılması tercih edilir, ancak bu yazıda anlatılan fosfospesifık antikor kullanılarak IRF3 fosforilasyonunun saptanması analizinden önce -80 ° C'de BOA'da depolama yuvarlak izin verecek kadar stabildir. Burada tarif edilen fosfataz inhibitörleri konsantrasyonları A549 hücreleri kullanıldığında yeterli olduğu bulunmuştur. Daha yüksek konsantrasyonlar daha iyi sonuçlar elde etmek bulunmamıştır. Bununla birlikte, bu konsantrasyonlar daha fosfataz aktivitesi seviyeleri gösterirler hücre tiplerinde IRF3 aktivasyonunu incelenirken artırılması gerekebilir. Önemlisi, IRF3 fosforilasyonu ve altında yatan mekanizmaları hala çok anlaşılmaktadır vardır. Bu nedenle, Ser / thr ve Tyr-fosfataz tam panelindeönleyicileri de IRF3 fosforilasyon, dimerizasyonu ve bozulma saptanmasını etkileyebilir muhtemel henüz karakterize aktivitelerini engellemek için kullanılır. Çoğu virüs enfeksiyonundan sonra ve en çok hücre tipinde IRF3 monomer ve dimer saptanması için, 8-10 ug WCE yeterli olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, proteinlerin daha yüksek miktarda daha az etkin IRF3 aktive uyarılması için gerekli olabilir. Bu çalışmada kullanılan Ser386 karşı fosfospesifık antikorları SDS-PAGE denatüre hassasiyet gibi yerli-PAGE kullanılmak üzere tavsiye edilir çok zayıf. Ayrıca, Ser386 de fosforilasyonu, böylece, belirli bir ortamda bu kavramı doğrulamak için nativ-PAGE bu antikorların kullanımına uygun bir strateji hale IRF3 9 dimerik formu ile ilişkili olduğu önerilmiştir. Dikkat çekici, alternatif antikorlar çeşitli firmalardan temin edilebilir ve verimli SDS-PAGE sonra fosfo-Ser386 algılamak iddia edilmektedir. Ser396 karşı fosfospesifık antikorlar da etkili bir şekilde u olmuşturyerli-PAGE 20 sonra IRF3 fosforlanmasını tespit sed. Önemli olarak, phosphoacceptor sitelerinin C-terminal kümede Ser402 da IKKε / TBK1-fosforile IRF3 10,21,28 kütle spektrometresi analizi ile izlendi IRF3 aktivasyonu ve Ser402 fosforilasyonu için önemli olduğu tespit edildi. Bununla birlikte, iki farklı denemeden (NG, yayınlanmamış) rağmen fosfospesifık antikorlar, in vivo olarak, bu özel tortu fosforilasyonunu izlemek için şu anda mevcuttur. Thr157 ve Ser339 karşı fosfospesifık antikorlar 11,13 tarif edilmiştir edin. Bu ek fosfospesifık antikorlar burada tarif edilene benzer yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE bir prosedürde kullanılabilir. Bu durumda, ek büyük SDS-PAGE jelleri, her antikor için gerekli olan ve jel # 2 (Şekil 1) ile aynı şekilde işleme tabi olur. Bildiğimiz kadarıyla Ser173 ve Thr390 karşı fosfospesifık antikorlar şimdiye kadar tarif edilmiş,ama onlar kolayca onlar 14,20 kullanılabilir hale kez burada açıklanan protokole eklenebilir.
IRF3 aktivitesi hiperfosforile formları 11,17 proteazom aracılı degradasyon ile sonlandırılır. Burada açıklanan protokol, aynı zamanda uyarılması kinetik uzamakta ve proteazom inhibitörleri (MG132, Laktasistin ya bortezomid) kullanılarak birleştirilir IRF3 bozulması izlenmesini mümkün kılar. Tipik olarak, A549 hücrelerinde 40 HAU de sev bulaşmış / 10 6 hücre, IRF3 fosforilasyonu kısa sürede 2 saat sonrası SeV enfeksiyonu ve IRF3 yıkımı 12 saat sonra başlar başlar. Proteozom aracılı yıkımı proteasom inhibitörleri ile şartlarında tersine çevriliyor geç zaman noktalarında formları III ve IV düzeyleri gözlenen azalma sonucuna edilecektir. Bu aynı zamanda proteazom inhibitörü tedavisi 29 üzerine geri kazanıldığı IRF3 Dimer düzeyleri bir azalma yerli-PAGE üzerinde çevirmek olacaktır. Önemlisi, yüksek çözünürlüklü technique Burada sunulan bozulması süreci ve aktivasyon eksikliği ayırt verir. Aslında, her iki bozulma ve dimer / fosfo-Ser386 / 396 tespiti yokluğunda IRF3 sonucu aktivasyonu eksikliği. IRF3 30 bozulduğu zaman, bu IRF3 türleri algılanmaz Bununla birlikte, aktivasyon eksikliği, I ve II IRF3 monomer algılama ve formların ilişkilidir.
Kütle spektrometrisi bazlı analiz ile birlikte imüno-çökeltilmesi farklı bölgelerde IRF3 in vivo fosforilasyonunu tespit etmek için tercih edilen bir yöntemdir. Bu teknik, Ser173, Ser175, Ser386, Thr390, Ser396 de IRF3 fosforilasyonunu teyit etmek için kullanıldı ve Ser402 10,20,21 kalıntıları. Bununla birlikte, kütle spektrometrisi kolayca farklı zaman noktalarında birkaç stimülasyondan, aşağıdaki IRF3 aktivasyon günlük analiz için kullanılabilir uygun / benchside tekniği henüz mevcut değildir. Bu nedenle, işlem nativ-PAG bağlanmış SDS-PAGE kullanılarak burada açıklananToplam ve fosfospesifık antikorlar kullanarak immunoblotun ile birlikte E actived IRF3 tüm şu anda tanımlanmış formlarını tespit etmek için bir pratik, ekonomik ve duyarlı bir yaklaşım oluşturmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
