Introduction
Повсеместно и конструктивно выражается фактором транскрипции интерферон (ИФН) Нормативно-фактор 3 (IRF3) имеет решающее значение для первой линии обороны против патогенов, главным образом, через индукцию IFNβ, но и через индукцию хемокинов (CC мотив) лиганда 5 (CCL5 ) и несколько противовирусных белков, включая IFN-индуцированной белка с tetratricopeptide повторяет IFIT1 / 2/3 1-3. Активация IRF3 сообщается после инфекции с многочисленными вирусами, или воздействия полиинозиновой-полицитидиловая кислоты (поли I: C) или липополисахарида (ЛПС) 4. Важно отметить, что наиболее изученными вирусы эволюционировали механизмы, чтобы уклониться от ответа IRF3-опосредованной, и тем самым избежать хозяина врожденная иммунная защита 5. Таким образом, следить за активацией IRF3 имеет большое значение для понимания молекулярных механизмов врожденного антивирусного защиты хозяина, но и определить стратегию, используемую вирусов, чтобы противодействовать этот ответ.
ЛОР "> Многие опубликованных отчетов, однако обеспечивают лишь ограниченный анализ активации IRF3 исполнении мониторинга индукции IRF3-гена-мишени (IFNB1 и IFIT1) и / или гена люциферазы анализа в сочетании с электрофорезом додецилсульфата полиакриламидном геле с низким разрешением натрия (SDS- СТР) анализ IRF3. Тем не менее, многочисленные биохимические исследования, анализ поведения различных IRF3 мутантов и выяснения IRF3 кристаллической структуры 6-11 способствовали установить, что IRF3 подвергается сложной совокупности последовательных пост-трансляционных модификаций путем фосфорилирования в несколько сайтов. В комплект фосфорилирования, участвующих в активации IRF3, кажется, зависит от стимулов и, скорее всего, от типа клеток. В неинфицированных клеток, IRF3 сосуществует, как нефосфорилированный и hypophosphorylated видов содержащий phosphoresidues, в том числе Thr135 и Ser173, в 1 -198 аа N-терминальная область 6,12-14. Накопление этого hypophosphorylated FОРМ по IRF3 индуцируется стрессом индукторов, факторов роста и агентов, повреждающих ДНК 6. Фосфорилирование Ser / Thr остатков на С-концевой области IRF3 содержащей домен трансактивации срабатывает после активации вирусами, поли I: С или ЛПС в типа клеток зависимым образом 15-17. С-концевой фосфорилирования IRF3 не включает в себя не менее 7 различных phosphoacceptor сайты, организованные в двух основных кластеров, Ser385 / Ser386 и Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, что каждый свой вклад в активацию IRF3 через димеризации, ядерной накопления, совместно с CREB связывающий белок (СВР) / P300 коактиваторами, связывания ДНК с IFN чувствительный элемент ответа (ISRE) консенсусные последовательности и трансактивацию генов-мишеней 9,10,17-19. Фосфорилирование Thr390 также думал, внести свой вклад в вирусиндуцированного активации IRF3 20. Масс-спектрометрия анализа IRF3 показали, что Ser386, Thr390, Ser396 и Ser402 остатки непосредственно phosphorylatред ингибитора киназы кВ е (IKKε) / БАК-связывающий киназы 1 (TBK1) киназ 9,10. Фосфорилирование на остатках C-терминал также требуется для прекращения активации IRF3 через polyubiquitination и протеасомного-опосредованной деградации 10. Этот процесс также зависит от фосфорилирования Ser339 в, которое необходимо для вербовки пропильного изомераза Pin1 10,11. IRF3 видов, содержащие, по крайней мере фосфо-Ser339 / 386/396 остатков рассматриваются гиперфосфорилированного формы. Точная последовательность и функции каждого сайта по-прежнему вызывает дискуссии 10,21. Теперь ясно, что активированный IRF3 не представляют однородного состояния, но различные виды активированного проявляющие различные фосфорилирования или димеризации характеристики существуют 10,22.Для обеспечения полного понимания активации IRF3 в ответ на конкретные патогенов, он, таким образом, необходимо спaracterize котором активированных видов индуцируются. Индукция генов-мишеней IRF3, IFNB1 и IFIT1, доказала, чтобы обеспечить надежную считывание для активации IRF3. Тем не менее, мониторинг экспрессии этих генов не различать разных государств активации IRF3. Всесторонний анализ IRF3 состояниях активации в конкретных условиях зависит от детальной характеристики ее фосфорилирования и димеризации статуса 10. Нефосфорилированной (форма I) hypophosphorylated (форма II) и (гиперфосфорилированного формы III и IV), IRF3 формы 6,18,23 может быть успешно решена с помощью ограниченной подвижностью в высоком разрешении анализа SDS-PAGE. Мономерные и димерных видов IRF3 может быть эффективно определены путем анализа родном странице. Эти подходы значительно улучшена при использовании в сочетании с phosphospecific антител, направленных против различных сайтов IRF3 phosphoacceptor.
Стандартные протоколы позволяют плохой разрешениебелки, которые не позволяют эффективное разделение отличие IRF3 фосфорилированными форм. Здесь мы подробно описать процедуру, чтобы добиться самого высокого разрешения для мониторинга индукции различных вирусных активирована видов IRF3 использованием SDS-PAGE, соединенный с родной страницы в сочетании с иммуноблот помощью всего и phosphospecific антител. В естественных условиях дискриминации между различными активирована Формы IRF3 выполняется на основании их подвижности сдвигов, наблюдаемых на SDS-PAGE. Кроме того, IRF3 мономера и димера можно отличить по неденатурирующих электрофореза. Сочетание этих двух дополнительных методов с иммуноблот оказывается доступным и чувствительный подход, чтобы приобрести всю необходимую информацию для полного анализа фосфорилирования-опосредованной активации IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол, описанный здесь, используя А549 клетки, инфицированные вирусом Сендай (SeV). Однако протокол для SDS-PAGE и родной странице также работает со всеми типами человека и мыши клеток испытанных до сих пор, особенно миелоидных клеток стимулировали различными IRF3 активирующий стимулов 9,15,19,24,25.
1. Заражение клеток А549
- Поддержание клеток А549 в культуре в 15 см пластины при 37 ° С / 5% CO 2 в 20 мл F12K / Ham среду, содержащую 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (HI-FBS) и 1% L-глутамина (полный F12K / Ветчина среда).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения, используемые для культуры и лечения клеток, должны быть стерильными. - В 24 ч до заражения, аспирации среды и промыть клетки с 10 мл дистиллированной фосфатным буферным раствором (D-PBS) при комнатной температуре.
- Добавить 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в каждой пластине для покрытия ячейки и инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин.
- Остановить инкубацию, как только йе клетки начинают отделяться от пластины мягко нажав пластину с одной стороны. Инактивации трипсина путем добавления 10 мл подогретого полный F12K / Ham среды на тарелку и передать клетки в 15 мл коническую трубку.
- Центрифуга при 350 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 8 мл полной F12K / Ham среде с получением гомогенной суспензии отдельных клеток.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Семенной клеток при плотности 1 х 10 6 клеток на 60 мм чашку в 4 мл предварительно нагретой полного F12K / Ham среды. Инкубировать в течение 20 - 24 ч при 37 ° С / 5% СО 2. После 20 - 24 часов, клетки образуют сливающийся 90% монослоя (это соответствует 1,5 × 10 6 клеток).
- Удалить среду и промыть клетки с 2 мл бессывороточной F12K среде Хама / (SFM). Добавить 2 мл свежего SFM на 60 мм пластины.
- Разморозить аликвоту вирус Сендай (SeV) (хранить аликвоты при -80 ° С) на льду и вихря кратко.
- Развести йе вирус в предварительно нагретой SFM, чтобы получить 60 HAU / 100 мкл. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз мягко и добавить 100 мкл разбавленного вируса на плите, чтобы выполнить инфекции в 40 HAU / 10 6 клеток. Не добавлять вирус в не-инфицированной контрольной чашке.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° С / 5% СО 2. Перемешивают пластин вручную 3 или 4 раза, или с помощью автоматического орбитальный шейкер или помещен качалку непосредственно в инкубаторе, в течение первого часа инфекции.
- В 2 ч после инфекции, добавляют 2 мл F12K / Ham среде, содержащей 20% FBS HI-чтобы получить конечную концентрацию 10% HI-FBS.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° C / 5% CO 2 в течение дополнительного 1, 4 и 7 ч, чтобы достичь общего времени инфекция 3, 6 и 9 часов, соответственно. На каждом из этих временных точек, перейдите к шагу 2.1.
2. Подготовка всей клеточные экстракты (ЗЦЕ)
- Снимите инфекции среду. Сбора клеток путем соскабливания в 1 млледяной D-PBS и передачи клеточной суспензии в предварительно охлажденной 1,5 мл центрифужную пробирку.
- Гранул клетки центрифугированием при 16000 х г при 4 ° С в течение 20 сек и тщательно декантируют все следы D-PBS.
Примечание: На этом этапе, осадок клеток может быть непосредственно подвергают экстракции белка или быстро замораживали в жидком азоте или с сухим льдом / этанол бане и хранили при -80 ° С до лизиса. - Подготовка лизирующего буфера, содержащего 50 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 10% глицерина и 1% Nonidet P-40 в деионизированной воде (DDH 2 O). Extemporarily добавить протеазу (1 мкг / мл лейпептина и 2 мкг / мл апротинина) и ингибиторы фосфатазы (5 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадата активирована натрия, 2 мМ п-нитрофенил фосфата и 10 мМ β-глицерофосфата, рН 7,5).
Примечание: Буфер для лизиса без ингибиторов можно хранить при температуре 4 ° С. Конкретный протокол для активации ортованадат натрия описано в Таблице специфических реагентов / оборудовант. - Ресуспендируют осадок клеток в 70 мкл буфера для лизиса. Обычно концентрация лизат будет около 2 мкг / мкл.
- Инкубируют на льду в течение 20 мин. Вспышка заморозить лизат по инкубации в бане с жидким азотом в течение 15 сек. Разморозить лизат при КТ, пока она не будет полностью расплавлены и вихрь в течение 10 сек. Повторите замораживания / оттаивания / Vortex цикл 3 раза.
- Кроме того, выполнение морозильной шаг в смеси этанол / сухой лед в течение 1 мин.
- Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 20 мин. Передача супернатант (соответствующий WCE) к новой предварительно охлажденной 1,5 мл центрифужную пробирку. Держите WCE на льду во все времена.
- Количественно белки, используя любой белок процедуру количественного совместимый с буфером для лизиса, таких как Брэдфорд основе анализа белков 26.
3. Постановление ЗЦЕ высокого разрешени SDS-PAGE
- Подготовьте три денатурирующих электрофореза гели.
- Для обнаруженияIRF3 формы, залить двумя гели минимум 16 см длины с гелем разделения состоит из 7,5% акриламида / бис-акриламида (37,5: 1), 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8 (РТ), 0,1% додецилсульфата натрия (SDS ), 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 O и концентрирующий гель, состоящий из 4% акриламида, 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 0,05% ДСН, 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 О.
Внимание! Акриламид, тетраметилендиамин и SDS токсичны и / или являются раздражителями. Носите защитные перчатки и манипулировать под вытяжкой. - Для обнаружения SEV белков, залить одним гель минимум 8,5 см длины с характеристиками, аналогичными характеристикам геля, описанного в 3.1.1, за исключением того, что гель содержит разделение 12% акриламид.
- Для обнаруженияIRF3 формы, залить двумя гели минимум 16 см длины с гелем разделения состоит из 7,5% акриламида / бис-акриламида (37,5: 1), 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8 (РТ), 0,1% додецилсульфата натрия (SDS ), 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 O и концентрирующий гель, состоящий из 4% акриламида, 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 0,05% ДСН, 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 О.
- Денатурации WCE, полученного на стадии 2.6, добавив 1: 4 (об / об) 5x буфера для загрузки (125 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 10% SDS, 20% (P / V), глицерин, 0,0005% бромфенол синий и 25% β-меркаптоэтанола в DDH 2 O) с последующим нагреванием при 100 °С в течение 10 мин. Быстрый спин трубы, чтобы сбить конденсата, который формирует в крышке.
Внимание! β-меркаптоэтанол токсичен при вдыхании. Носите защитные перчатки и манипулировать под вытяжкой. - Установите гели в миграционной аппарата. Заполните верхнюю и нижнюю камеры с рабочим буфером, содержащим 25 мМ Трис-Base, 0,1% SDS и 192 мМ глицина в дистиллированной воде (DH 2 O).
- Нагрузка 14 мкл стандарта молекулярного веса в одну лунку каждого 16 см геля и 7 мкл стандарта молекулярного веса в одну лунку 8,5 см геля. Нагрузка 30 мкг денатурированной WCE (полученного, как описано на стадии 3.2) в лунке из двух гелей, полученных на шаге 3.1.1 для обнаружения IRF3 формы. Нагрузка 8 - 10 мкг денатурированной WCE (полученного, как описано на стадии 3.2) в лунке на геле, полученного на стадии 3.1.2 для анализа SeV.
- Запуск гели при 30 постоянного тока до мА миграция фронт не достигнет дна геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Миграция как правило, длится приближенииДЕТАЛЬ 3 ч в течение 16 см геля и 45 мин для 8,5 см геля. - Приступить к передаче на нитроцеллюлозные мембраны (шаг 5).
4. Анализ IRF3 димеризации по родной-PAGE
Примечание: Этот метод первоначально был описан группой доктора Т. Фуджита 27.
- Подготовьте верхние (-) и нижнюю (+) камеры электрофореза буферы. Верхняя буферная камера состоит из 25 мМ Трис-HCl рН 8,4 (РТ), 192 мМ глицина и 1% дезоксихолат натрия (DOC) в DDH 2 O. Нижняя буферная камера содержит 25 мМ Трис-HCl рН 8,4 (RT) и 192 мм глицина в DDh 2 O.
Примечание: Верхние и нижние электрофореза буферы камеры можно хранить при температуре 4 ° С до использования. Тем не менее, убедитесь, что они предварительно нагревают до комнатной температуры перед выполнением электрофореза. - Налейте неденатурирующих разрешающую гель минимуму длины 8,5 см, содержащей 7,5% акриламида / бис-акриламид (37,5: 1), 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8 (РТ), 1% патроновnium персульфат и 0,1% TEMED в DDh 2 O.
- Предварительно запустить гель при постоянном 40 мА в течение 30 мин на льду. Нажмите бега аппарат в лед примерно до уровня нижней камеры буфер для электрофореза. Важно, что гель не в лед.
- Во время предварительной перспективе, смешать WCE хранили на льду с 2x родной-PAGE загрузки буфера 1: 1 (объем / объем), содержащий 125 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 30% глицерина и 0,1% бромфенолового синего в DDH 2 O.
- Нагрузка 8 - 10 мкг WCE (полученного, как описано на стадии 4.4) непосредственно в конце предварительной перспективе.
- Запуск гель при 25 постоянного тока на мА льда, как описано выше для предварительной перспективе, пока миграция фронт не достигнет дна геля (примерно 40 мин).
5. Иммуноблот Анализ IRF3 видов
- Подготовка буфера передачи, содержащий 25 мМ Трис-Base и 192 мМ глицина в DDh 2 O. Охладить буфер передачи при 4 ° С до использования.
- Влажные три части нитроцеллюлозную мембрану сократить до размера чуть больше, чем гели в пластиковые / стекла коробке, содержащей буфер передачи. Укажите ориентацию мембраны за счет сокращения один угол. Буфер передачи может быть повторно использован в 3 раза. Хранить буфер при 4 ° С между видами.
- Uncast гели (SDS-PAGE и родной-PAGE) и сократить один угол каждой геля для правильной ориентации.
- Для родной-PAGE, инкубировать гель при комнатной температуре при осторожном перемешивании в течение по крайней мере 30 мин в управлении SDS-PAGE буфера, чтобы удалить DOC перед передачей в буфер передачи.
- Инкубируйте гели (SDS-PAGE и родной-страницы) в буфере передачи для 5 - 10 мин.
- Установите бутерброд передачи за геля в кассете передачи с мембраной в сторону положительного электрода (пена колодки / бумажный фильтр / мембрану / гель / бумажный фильтр / пены колодки). Будьте осторожны, чтобы удалить все пузырьки между слоями сэндвича.
- Выполните передачу в качестве рекомендуемых бу производителя для передачи аппарата, используемого.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубации и моет в следующих шагах на качалке или орбитальной качалке платформы. - В конце времени передачи, инкубировать мембраны в течение 15 мин в фиксирующем растворе, содержащем 7% уксусной кислоты, 40% этанола и 3% глицерина в DDH 2 O. Вымойте мембраны 3x 5 мин в PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10,2 мМ Na 2 HPO 4 и 1,8 мм KH 2 PO 4 в дН 2 O).
Внимание! Уксусная кислота является токсичным, раздражающим и воспламеняется. Носите защитные перчатки и манипулировать под вытяжкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение фиксация могут быть использованы несколько раз. - Для мембраны родной-PAGE перейдем непосредственно к шагу 5.11.
- Промыть три мембраны SDS-PAGE быстро в дН 2 O перед инкубацией их в течение 1 мин в красном пунцовый раствора, содержащего 6,57 мМ красный пунцовый и 1% уксусной кислоты в DDH 2 O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Красный раствор пунцовый может быть г eused несколько раз. - Промыть мембран в дН 2 O, пока фон не достаточно, чтобы увидеть белый белковых полос, окрашенных в красный цвет. Обратите внимание на маркеры с карандашом и вырезать лишнюю мембрану вокруг белков. Destain мембраны путем инкубации в течение 5 мин в PBS при перемешивании.
- Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С в блокирующем растворе (PBS, содержащий 0,05% Tween 20 и 5% обезжиренного сухого молока (PBS-T-молоко). Промывка мембран 3x 5 мин в PBS-T.
Примечание: для стирки PBS-T не является обязательным, и только строго необходимо при применении антител разводили в PBS-T, содержащем 5% бычий сывороточный альбумин (PBS-T-BSA) (фиг.1 и таблица 1) на следующем шаге. - Инкубируйте четыре мембраны (из SDS-PAGE и родной-PAGE) с первичными антителами в соответствии с последовательно, изображенной на рисунке 1 и в таблице 1. Выполнение 5x 5 мин моет в PBS-T.
Рисунок 1. Последовательность Иммуноблот анализов. Схема описывает отдельные SDS-PAGE и родной-PAGE гели, необходимые для обнаружения различных IRF3 фосфорилированные и мономерные / димерных форм. Удельный порядок антител, применяемых к мембране в результате каждого геля в порядке, иммуноблот описано. Следует отметить, что анти-актина антитела используют первым обеспечения равного загрузку образцов перед нанесением любых других специфических антител. Альтернативный последовательность, с анти-актина антител применяются после анти-фосфо-IRF3 антител, тоже работает. Зачистки используется между анти-актин и анти-SEV антител, или между анти-фосфо-IRF3 и анти-IRF3 антител из-за перекрытия размер сигналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Первичные антитела | Разведение | Буфер для разведения | Инкубация | Вторичные антитела | Комментарии |
| Антиактиновые | 1/10000 | PBS-T-БСА | 15 мин при комнатной температуре | Анти-мышь | Используйте после SDS-PAGE Разбавленные antibodyies могут быть повторно использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия. |
| Анти-IRF3-Р-Ser386 | 1/200 | PBS-T-БСА | O / N при 4 ° С | Анти-кроличий | Используйте после Native-ПААГ. Не рекомендуется повторно использовать разбавленный антитела |
| Анти-IRF3-Р-Ser396 | 1/10000 | PBS-T-БСА | O / N при 4 ° С | Использование после SDS-PAGE. Не рекомендуется повторно использовать разбавленный антитела анти-IRF3-П-396 также доступна с клеточной сигнализации. Оптимальное разбавление определяется как 1/1000 для этого антитела, но может изменяться между партиями. | |
| Анти-IRF3-Р-Ser398 | 1/10000 | PBS-T-БСА | O / N при 4 ° С | Анти-кроличий | Использование после SDS-PAGE. Не рекомендуется повторно использовать разбавленный антитела |
| Анти-IRF3 полная длина | 1/7500 | PBS-T-молоко | 3 ч при комнатной температуре | Анти-кроличий | Использование после SDS-PAGE. Анти-IRF3 полноразмерное антитело может быть использован после родном-PAGE, но это менее чувствительны, чтобы обнаружить мономер. Разбавленные антитела могут быть использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия. |
| Анти-IRF3-СВS | 0,5 мкг / мл | PBS-T-молоко | 3 ч при комнатной температуре | Анти-кроличий | Используйте после Native-ПААГ. Разбавленные antibodyies могут быть повторно использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия. |
| Анти-SeV | 1/14000 | PBS-T-БСА | 3 ч при комнатной температуре | Анти-кроличий | Использование после SDS-PAGE. Разбавленные antibodyies могут быть повторно использованы несколько раз при хранении при 4 ° С в присутствии 0,02% азид натрия. |
| Примечание: Разведение и буфер, используемый для HRP-антител в сочетании вторичных должны быть оптимизированы как это варьируется от одной компании к другой. | |||||
Таблица 1. Технические характеристики антител используются в порядке Иммуноблоттинг.
- Инкубируйте мембраны с пероксидазой хрена (HRР) -conjugated вторичных антител, как описано в рисунке 1 и в таблице 1. Промывка мембран 5x 5 мин в PBS-T, а затем 2 раза 5 мин в PBS, чтобы полностью удалить следы Tween.
- Инкубируйте мембраны в течение 1 мин в объеме усиленной хемилюминесценции реагента, достаточное для полного покрытия мембраны. Высушите мембраны, используя фильтровальную бумагу.
- Поместите мембраны в анализаторе люминесцентных изображений для визуализации иммунореактивных полос.
- В качестве альтернативы, выполните обнаружение иммунореактивными диапазонах чувствительные рентгеновских пленок.
- Вымойте мембраны 3x 5 мин в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мембраны могут быть сухими. Однако, если требуется дальнейшее зачистки, то лучше выполнить отпарной перед сушкой мембрану. Мембраны также могут быть сохранены на короткий срок в PBS. - Для мембран, которые не требуют зачистки между инкубации с антителами (см рисунок 1) приступить непосредственно к этапу5.20.
- При снятии требуется между антителами (см Рисунок 1), инкубируют мембраны в предварительно нагретом извлекающего раствора, содержащего 2% SDS, 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,8 (RT) и 0,7% бета-меркаптоэтанол в DDH 2 O при 50 ° С 20 мин при регулярном помешивании. Вымойте мембраны 3x 5 мин в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агитация во время процедуры зачистки является ключевым. Разборка может быть выполнена в гибридизации печи. В качестве альтернативы, зачистки может быть выполнена с использованием мембран запечатанные в пластиковые мешки и погружали в ванну с водой. В этом случае важно, чтобы перемешивать мембран 4 - 5 раз в течение инкубации. - Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С в PBS-T-молока.
- Повторите шаги 5.12 5.16 согласно фиг.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 показывает типичную иммуноблот образ IRF3 обнаружен с IRF3 общего антител и IRF3-phosphospecific антител против Ser396 и Ser398 после разрешения ЗЦЕ по высоким разрешением SDS-PAGE. В стимулированных клетках А549, IRF3 определяется двумя полосами 50 и 53 кДа на SDS-PAGE, соответствующей нефосфорилированный (форма I) и hypophosphorylated (форма II) видов IRF3. Воздействие А549 клеток Сев за 3 - 9 ч приводит к зависимости от времени сдвига медленно мигрируют гиперфосфорилированного формы III и IV, которые хорошо отличаются от форм I и II. В гиперфосфорилированного полосы мигрировать 55-57 кДа. Формы III и IV также специально иммунодетектировали помощью phosphospecific антитела против Ser396 и Ser398. Иммунологического актина служит контролем, равной нагрузке между дорожками. Контрольную СЭВ инфекции показано накоплением вируса нуклеокапсида рrotein (N), который мигрирует при 60 кДа.
На рисунке 3, профиль обнаружения IRF3 получены из WCE решены носителем-ПААГ с последующим иммуноблот с использованием анти-IRF3-NES антитела и антитела против phosphospecific Ser386 показано. В нестимулированных клетках А549, IRF3 обнаружен в виде одной полосы, соответствующей мономерной форме. После инфицирования SeV для 3 - 9 ч, уровни IRF3 мономера снижению с сопутствующим накоплением медленно мигрирующей в диапазоне, который соответствует димерной форме IRF3. В phosphospecific антитела против Ser386 только обнаружить IRF3 димер видов.
Рисунок 2. Обнаружение Отдельное IRF3 Фосфорилированные видов (форма I-IV), индуцированный SeV инфекции в клетках А549. А549 остались неинфицированных или инфицированных SeV для IndicaТед раз. WCE были проанализированы с высоким разрешением в ДСН-ПААГ с последующим иммуноблот (IB) с использованием анти-IRF3-Ser396 (IRF-3-п-Ser396) и анти-IRF3-Ser398 (IRF-3-С-Ser398) phosphospecific антител и анти -IRF3 полноразмерный белок антитела. Инфицирование контролировали с помощью анти-антител SEV (нуклеокапсида N белка показана). Антиактиновые антитела были использованы в качестве контроля загрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Контроль фосфорилированного / димеризованной IRF3 индукции SeV в клетках А549. Клетки А549 оставили неинфицированных или инфицированных SeV течение указанных промежутков времени. ЗЦЕ были решены родной странице и выявлены иммуноблот с использованием анти-IRF3-Ser386 (IRF-3-Р-Ser386) phosphospecific антитела и анти-IRF3-РЭШ Антибodies. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол описан здесь состоит из комбинации высокого разрешения SDS-PAGE и родной-PAGE в сочетании с использованием нескольких phosphospecific антител, чтобы отличить мономерный / димерный и phosphoforms I-IV из IRF3. Соответствующее определение этих видов IRF3 важно в полной мере характеризуют активацию IRF3 в определенной настройки. Например, стимуляция ЛПС активированными макрофагами приводит к образованию димеров, Ser396 / 398 фосфорилированного IRF3 который проявляет hypophosphorylated (форма II), но не гиперфосфорилированного (форма III и IV), образец в ДСН-ПААГ 15. Используя описанную протокол, этот профиль можно отличить от индуцированного вирусом гиперфосфорилированного форм, которые требуют дополнительного Ser339 фосфорилирование в дополнение к Ser386 и Ser396 фосфорилирования 10. Важно отметить, что это также позволяет различия между Ser396 фосфорилированными видов, которые не проявляют димеризации, но транскрипционно активны 10. Яportantly, он должен отметить, что форма I-IV картина IRF3 phosphoforms применяется для человека IRF3. Мышиные IRF3 не обладает той же схеме и, следовательно, активация IRF3 характеризуется только с использованием антител phosphospecific в иммуноблота после SDS-PAGE и родной-PAGE.
Достижение высокой разделения разрешение различных фосфорилированных видов IRF3 по SDS-PAGE требует специфических параметров. Для соответствующего решения, очень важно, чтобы использовать гели, которые имеют минимальную длину 16 см. Даже с этой длине разделительной геля, что является ключевым, чтобы миграция передней достигнет дна геля для получения соответствующего разделения различных форм IRF3. Кроме того, концентрирующий гель должен расширить до минимума 1 см ниже гребенки, чтобы получить четко определенные группы. Это важно, так как гиперфосфорилированного формы IRF3 мигрируют очень близко друг к другу. Плохо ориентированные полосы приведет в отсутствие различия между phosphorylaТед образует ущерба их соответствующую количественную. Кроме того, концентрация персульфата аммония и TEMED изменяться от одного протокола SDS-PAGE в другую. Изменение этих концентраций от указанных здесь было обнаружено значительно ухудшить разрешение в разделении видов IRF3.
Обнаружение образования IRF3 димера через родной-PAGE первоначально был описан группой доктора Т. Фудзита. Этот протокол использует буфер, содержащий DOC, который позволяет диссоциацию IRF3 димера с СВР / р300 27. Настоятельно рекомендуется, чтобы перейти к родной-PAGE сразу после лизиса клеток в хранении ЗЦЕ при -80 ° С было установлено, привести к значительному изменению соотношения IRF3 мономер / димер. Кроме того, очень важно, чтобы рН верхних и нижних буферов камеры доводили до рН 8,4 при комнатной температуре, а не при 4 ° С, после смешивания всех компонентов для достижения надлежащего разделения мономера против димера. Разделениегель с минимальной длиной 8,5 см дает возможность обеспечить соответствующее разделение IRF3 мономера и димера. Идеальный объем выборки плюс загрузки буфера составляет около 8 мкл для 5 мм также разрешение лучше, когда объем сведен к минимуму. Таким образом, важно использовать наименьший объем лизирующего буфера для получения WCE с высокой концентрацией. Тем не менее, следует принимать во внимание, что эффективность экстракции белка требует лизис по меньшей мере 5 раз объем клеточного осадка. Если объем образцов превышает предел, указанный выше, это может привести к плохой разрешающей способности мономеров / димеров. Это может быть решена путем добавления концентрирующий гель, содержащий 4% акриламида, 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,8 (РТ), 1% персульфата аммония и 0,1% TEMED в DDH 2 O. Очень важно, чтобы загрузить образцы, не нарушая полос. Загрузка медленно с гелем наливного наконечника вблизи дна скважины дает очень хорошие результаты.
Здесь мы опишем в естественных условиях Deteие фосфорилирования в определенных остатков с использованием имеющихся в настоящее время phosphospecific антител против Ser386 9 Ser396 19 и Ser398 15. Использование IRF3 мутантов и масс-спектрометрии анализа подтвердили, что эти остатки фосфорилируются на вирусной инфекции или гиперэкспрессией IKKε / TBK1 киназ и имеют решающее значение для активации IRF3 6,9,10,19,21. Иммунодетекции фосфо-Ser396, фосфо-Ser398 и общей IRF3 после SDS-PAGE требует использования двух одинаковых гелей (рисунок 1). Действительно, значительная потеря чувствительности наблюдается при phosphospecific антитела используют после десорбции мембраны. Поэтому, настоятельно рекомендуется использовать phosphospecific антитела первым. Следует отметить, что альтернативные первичные и вторичные антитела могут также работать, но конкретные разведения и последовательность использования должны быть оптимизированы. Для анализа IRF3, 30 мкг WCE уместно получить значительное обнаружение IRF3фосфорилирования с использованием указанных антител при использовании 4 мм ширина скважин иммуноблот. Хотя во многих типах клеток, инфицированных различными вирусами 30 мкг было установлено, что целесообразно, эта сумма может потребоваться увеличение в зависимости от типа клеток и стимуляции. Предпочтительно использовать свежие экстракты для SDS-PAGE, но обнаружение IRF3 фосфорилирования с использованием антител phosphospecific описанные в этом документе достаточно стабильна, чтобы позволить раунд хранения WCE при -80 ° C до проведения анализа. Концентрации ингибиторов фосфатазы, описанных здесь, были найдены быть достаточным при использовании клеток А549. Более высокие концентрации не были найдены, чтобы дать лучшие результаты. Тем не менее, эти концентрации может потребоваться увеличение при изучении активации IRF3 в типах клеток, которые обладают более высокий уровень активности фосфатазы. Важно отметить, что фосфорилирование IRF3 и механизмы, лежащие в основе все еще далеки от понимания. Таким образом, полный панель Ser / Thr- и Тир-фосфатазы вhibitors используется для блокировки возможные еще не охарактеризованных деятельности, которые могут повлиять обнаружение IRF3 фосфорилирования, димеризации и деградации. Для обнаружения IRF3 мономера и димера после большинства вирусных инфекций и в большинстве типов клеток, 8 - 10 мкг WCE было установлено, что достаточно. Тем не менее, большее количество белков может потребоваться для стимуляции активации IRF3 менее эффективно. В phosphospecific антитела против Ser386, используемые в данном исследовании, рекомендуется использовать в родном-страницы в качестве чувствительности в денатурирующих SDS-PAGE очень слаба. Кроме того, фосфорилирование по Ser386 предлагается коррелируют с димерной формы IRF3 9, в результате чего использование этих антител в родном-PAGE соответствующей стратегии, чтобы подтвердить эту концепцию в определенных параметров. Следует отметить, что альтернативные антитела доступны из различных компаний и, как утверждают, эффективно обнаруживать фосфо-Ser386 после SDS-PAGE. Phosphospecific антитела против Ser396 также были эффективно уСЭД для обнаружения IRF3 фосфорилирования после носителем Page 20. Важно отметить, что Ser402 в C-терминал кластера phosphoacceptor сайтов было также установлено, что важно для активации IRF3 и фосфорилирования Ser402 наблюдалось через масс-спектрометрии анализа IKKε / TBK1-фосфорилируется IRF3 10,21,28. Тем не менее, несмотря на два различных попыток (НГ, не опубликовано), не phosphospecific антитела не в настоящее время доступны следовать фосфорилирования этой конкретной остатка в естественных условиях. Следует отметить, что антитела против phosphospecific Thr157 и Ser339 также были описаны 11,13. Эти дополнительные антитела phosphospecific могут быть использованы в процедуре высоким разрешением в ДСН-ПААГ, аналогичной той, которая описана здесь. В этом случае дополнительные большие ПААГ с ДСН потребуется для каждого антитела и обрабатывается так же, как гель # 2 (фиг.1). Для наших знаний не phosphospecific антитела против Ser173 или Thr390 пока не описаны,но они могут быть легко добавлены к протоколу, описанному здесь, как только они становятся доступными 14,20.
IRF3 деятельность прекращается протеасомного-опосредованной деградации гиперфосфорилированного форм 11,17. Протокол, описанный здесь, также позволяет контролировать деградации IRF3 когда кинетическая стимуляции продлевается и соединен с применением ингибиторов протеасом MG132 (, lactacystin или bortezomid). Как правило, в клетках А549 заражены SeV на 40 HAU / 10 6 клеток, IRF3 фосфорилирования начинается, как только пост-SeV инфекции и IRF3 деградация 2 ч начинается после 12 часов. Протеасома-опосредованной деградации будет заключен с наблюдаемой уменьшения форм III и уровней IV на конце временных точках, что сторнируется в условиях с ингибиторами протеасом. Это также перевести на родной-страницы в уменьшении уровней димера IRF3, что извлекают на ингибитором протеасом лечения 29. Важно отметить, что высокое разрешение TechniQue, представленные здесь позволяет дифференцировать между процессом деградации и отсутствия активации. Действительно, и деградации и отсутствие активации результате IRF3 в отсутствие обнаружения димера / фосфо-Ser386 / 396. Однако отсутствие активации связано с обнаружением IRF3 мономера и форм первой и второй, в то время как эти виды IRF3 не определяются при IRF3 деградирует 30.
Иммунопреципитации сочетании с масс-спектрометрией на основе анализа методом выбора для определения фосфорилирования в естественных условиях IRF3 на отдельных площадках. Этот метод был использован для подтверждения фосфорилирования IRF3 на Ser173, Ser175, Ser386, Ser396 Thr390, и Ser402 остатки 10,20,21. Однако масс-спектрометрии еще не доступным / benchside метод, который может быть легко использован для ежедневного анализа активации IRF3 после нескольких раздражений в различные моменты времени. Таким образом, процедура описана здесь с помощью SDS-PAGE, соединенный с носителем PAGЕ в сочетании с использованием иммуноблота всего и phosphospecific антитела представляет собой практическое и доступное деликатный подход для обнаружения всех в настоящее время определенные формы Actived IRF3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37 °C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2 M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20 °C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40% | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45 mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20 oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80 oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20 oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20 oC. |
References
- Juang, Y. T., et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N., et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J., et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y., et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K., et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M., et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F., et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T., et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G., et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B., et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M., et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A., et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).
- Yoneyama, M., et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J., et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B., et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K., et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S., et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A., et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N., et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
