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Chemistry

पूरा पर्वत zebrafish भ्रूण की रोमक अंगों में Immunostaining फास्फो-epitopes

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

तकनीक पूरे zebrafish भ्रूण में phospho-epitopes immunostain के लिए और फिर प्राथमिक सिलिया के रूप में छोटे सेलुलर संरचनाओं में दो रंग फ्लोरोसेंट confocal स्थानीयकरण का संचालन वर्णित हैं। फिक्सिंग और इमेजिंग तकनीक के लिए स्थान और उपस्थिति या विशिष्ट प्रोटीन की सक्रियता का कैनेटीक्स परिभाषित कर सकते हैं।

Abstract

कोशिकाओं का तेजी से प्रसार, जीन के ऊतक विशेष अभिव्यक्ति और संकेत नेटवर्क के उभरने के सभी रीढ़ की जल्दी भ्रूण के विकास की विशेषताएँ। कैनेटीक्स और संकेतों के स्थान - यहां तक ​​कि एकल कक्षों के भीतर - विकासशील भ्रूण में महत्वपूर्ण विकासात्मक जीनों की पहचान के पूरक है। Immunostaining तकनीक का वर्णन किया जाता है कि प्राथमिक सिलिया के रूप में छोटे संरचनाओं में intracellular और पूरे जानवर संकेतों के कैनेटीक्स परिभाषित करने के लिए दिखाया गया है। फिक्सिंग, इमेजिंग और प्रसंस्करण छवियों को एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन यौगिक प्रयोग करने के लिए तकनीक के रूप में कुछ के रूप में 36 घंटे में पूरा किया जा सकता।

Zebrafish (Danio rerio) जांचकर्ताओं जो एक हड्डीवाला प्रजातियों कि सस्ती और मानव रोग के लिए प्रासंगिक है में अध्ययन का संचालन करने के लिए तलाश के लिए एक वांछनीय जीव है। जेनेटिक नॉकआउट या knockdowns वास्तविक प्रोटीन उत्पाद के नुकसान से पुष्टि की जानी चाहिए। प्रोटीन के नुकसान की इस तरह की पुष्टितकनीक यहाँ वर्णित का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। संकेत दे रास्ते में सुराग भी एंटीबॉडी कि प्रोटीन है कि बाद translationally फोस्फोराइलेशन द्वारा संशोधित किया गया साथ प्रतिक्रियाशील रहे हैं का उपयोग करके पढा जा सकता है। संरक्षण और एक मिलान के फॉस्फोरिलेटेड राज्य के अनुकूलन इसलिए इस संकल्प के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रोटोकॉल के द्वारा पूरा किया है।

इस अध्ययन के विकास और के पहले 72 घंटे के दौरान भ्रूण को ठीक करने के लिए तकनीक का वर्णन Kupffer के पुटिका (केवी) में सिलिया के साथ प्रासंगिक epitopes की एक किस्म है, गुर्दे और भीतरी कान सह स्थानीय बनाना। इन तकनीकों में सीधा, विच्छेदन की आवश्यकता नहीं है और समय की एक अपेक्षाकृत कम समय में पूरा किया जा सकता है। एक ही छवि में confocal छवि के ढेर में पेश इन आंकड़ों को पेश करने के लिए एक उपयोगी साधन है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में zebrafish प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) वर्जीनिया कॉमनवेल्थ विश्वविद्यालय में द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 4% पीएफए ​​/ पीबीएस। धूआं हुड में paraformaldehyde के 8 ग्राम (पीएफए) वजन। हालांकि अभी भी धूआं हुड में, 80 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ सरगर्मी और 50 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग के साथ में सूखे पीएफए ​​भंग ~। ताजा 1N NaOH के 10 बूँदें जब तक पीएफए ​​पूरी तरह भंग है और समाधान स्पष्ट किया है - सरगर्मी है, जबकि 3 जोड़ें। गर्मी से निकालें और 100 मिलीलीटर 2x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें। आसुत एच 2 ओ के साथ 200 मिलीलीटर मात्रा लाओ आरटी शांत और उपयोग करने से पहले 7.4 के पीएच की पुष्टि करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर लेकिन एक सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
  2. किसी की खुराक के बिना 100% मेथनॉल का प्रयोग करें। किसी की खुराक के बिना 95% इथेनॉल का प्रयोग करें।
  3. फॉस्फेट बफर बीच (पीबीटी) तैयार करें। अनुपूरक 0.1% बीच 20 के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)। 0 जोड़ें।पीबीएस 1x 100 मिलीलीटर के लिए एक 20% बीच 20 शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर। आरटी पर स्टोर।
  4. फॉस्फेट बफर ट्राइटन X (PBTx) तैयार करें। 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस अनुपूरक। पीबीएस के 100 मिलीलीटर के लिए एक 20% ट्राइटन X-100 शेयर के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर स्टोर।
  5. 10% NGS / PBTx तैयार करें। सामान्य बकरी सीरम (NGS) ब्लॉक गैर विशिष्ट बंधन साइटों। -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर NGS। , का उपयोग करने के लिए 9 मिलीलीटर PBTx 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए।
  6. 50% ग्लिसरॉल / पीबीएस तैयार करें। 2x पीबीएस और 100% ग्लिसरॉल का अच्छी तरह से बराबर भागों मिश्रण। आरटी पर स्टोर।

2. भ्रूण फिक्सेशन

  1. । (। जैसे, β-actin: CAAX GFP) प्रजनन प्राप्त जंगली प्रकार (एबी और Wik) या ट्रांसजेनिक प्राकृतिक matings के माध्यम से भ्रूण। अगर वांछित, के रूप में वर्णित निर्माणों या morpholinos के साथ भ्रूण इंजेक्षन। 15,16
  2. भ्रूण उठाएँ। भ्रूण लीजिए और रूप में वर्णित किया 0.003% 1-फिनाइल-2-Thiourea (पीटीयू) रंजकता को ब्लॉक करने की मौजूदगी में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 17 p>
  3. ठीक करें। जब भ्रूण वांछित विकास मंच, 18 पर पहुंच गया है,   MESAB का उपयोग भ्रूण anesthetize, जितना संभव हो उतना प्रणाली पानी निकालने और 3 के लिए नए सिरे से 4% पीएफए ​​/ पीबीएस जोड़ - आरटी पर 4 घंटा। नोट: 20 घंटा के बाद निषेचन (HPF) की तुलना में कम समय में, dechorionation करने से पहले तय कर लो। 20 HPF के बाद समय में, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ठीक बिंदु संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर निर्धारण करने से पहले Dechorionate।
  4. के रूप में वर्णित समाधान बदल रहा है। स्थानांतरण एक विस्तृत बोर pipet का उपयोग भ्रूण। छाया हुआ microcentrifuge ट्यूबों 1.5 मिलीलीटर में 17 समाधान बदलें, बस भ्रूण centrifugation बिना गंभीरता से व्यवस्थित करने की अनुमति देकर।
  5. पोस्ट-लगानेवाला 3 के बाद -। 4 घंटा, पीएफए ​​/ पीबीएस हटाने के लिए, कम से कम 48 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल और दुकान के साथ की जगह। नोट: अधिक से अधिक पी CaMK-द्वितीय immunoreactivity लिए, एक सप्ताह के लिए कुल मेथनॉल भंडारण समय सीमा।
"> 3। Immunostaining पूरे भ्रूण

  1. 10 भ्रूण की एक न्यूनतम छाया हुआ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए जगह है, और उन्हें लेबल।
  2. भ्रूण व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। निकालें और मेथनॉल त्यागने और अगले कदम के रूप में संकेत दिया, इथेनॉल की सांद्रता कम करने की 0.5 मिलीग्राम से युक्त प्रगतिशील washes के साथ rehydrate। हर कदम कमाल के साथ एक 5 मिनट धो रहा है।
  3. उत्तरोत्तर इन 5 समाधान के साथ rehydrate: 66% इथेनॉल / 33% PBTx, 33% इथेनॉल / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (इस PBTx की पहली दोहराना है), 100% PBTx (इस के दूसरे दोहराना है PBTx)।
  4. पिछले PBTx धोने निकालें। 0.5 मिलीलीटर 10% NGS / PBTx जोड़ें। कोमल कमाल के साथ आरटी पर कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं और फिर निकालें और समाधान त्यागें।
  5. 10% NGS / PBTx में गिराए द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है। सह-immunostaining हैं, तो पहले उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी का उपयोग करें। 500: इस अध्ययन के लिए, माउस विरोधी acetylated ट्यूबिलिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1 पतला के साथ सेते हैं। उदाहरण के लिएई, अगर वहाँ 10 नमूने, 10% NGS / PBTx के 3 मिलीलीटर के साथ शेयर एंटीबॉडी समाधान के 6 μl गठबंधन और उसके बाद प्रत्येक ट्यूब में इस बात का 0.3 मिलीलीटर वितरित कर रहे हैं।
  6. सभी भ्रूण को विसर्जित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 0.5 मिलीलीटर - 0.2 जोड़ें। आरटी पर सौम्य कमाल हे / एन के साथ सेते हैं।
  7. सुबह में, हटाने और एंटीबॉडी समाधान त्यागें। 0.5 मिलीलीटर 2% NGS / PBTx अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी दूर धोने के लिए जोड़ें। धीरे 5 मिनट के लिए रॉक। निकालें और समाधान त्यागें। दो बार दोहराएँ।
  8. भूमि के ऊपर रोशनी मंद और 10% NGS / PBTx में उपयुक्त fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला इतना है कि हर हालत में कम से कम 0.5 मिलीग्राम शामिल हैं। 500 कमजोर पड़ने: माउस विरोधी acetylated ट्यूबिलिन प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ, एक 1 पर हरे-फ्लोरोसेंट रंजक बकरी विरोधी माउस आईजीजी का उपयोग करें।
  9. कोमल अंधेरे में आरटी पर कमाल के साथ 4 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं। मंद रोशनी के नीचे और एक अंधेरे कंटेनर में सेते हैं या एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर द्वारा अब प्रक्रिया से नमूने हैं।
  10. ऊष्मायन के अंत में, हटाने और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें। 0.5 मिलीलीटर 2% NGS / PBTx धोने के लिए जोड़ें। धीरे 5 मिनट के लिए रॉक। निकालें और समाधान त्यागें। दो बार दोहराएँ।
  11. तो सह immunostaining, पहले प्राथमिक एंटीबॉडी की तुलना में एक अलग प्रजाति से दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी प्राप्त करते हैं। इन अध्ययनों में, लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा खरगोश विरोधी phospho CaMK-द्वितीय एंटीबॉडी का पालन करें।
  12. पतला खरगोश विरोधी phospho CaMK-द्वितीय एंटीबॉडी 1:20। भ्रूण के प्रत्येक ट्यूब के लिए, 0.3 मिलीलीटर 10% NGS / PBTx में निलंबित, तो शेयर एंटीबॉडी समाधान के 15 μl जोड़ें।
  13. सुनिश्चित करें कि भ्रूण डूब रहे हैं और रोशनी मंद कर रहे हैं। अंधेरे में आरटी पर सौम्य कमाल हे / एन के साथ सेते हैं।
  14. मंद रोशनी के तहत सुबह में, हटाने और एंटीबॉडी समाधान त्यागें। 0.5 मिलीलीटर 2% NGS / PBTx जोड़ें। धीरे 5 मिनट के लिए रॉक। निकालें और समाधान त्यागें। दो बार दोहराएँ।
  15. भूमि के ऊपर रोशनी मंद रखें और उचित fluorescently-conju के लिए पर्याप्त पतलाGated माध्यमिक एंटीबॉडी तो यह है कि हर हालत में कम से कम 0.5 मिलीग्राम शामिल हैं। 10 में 500% NGS / PBTx: इस अध्ययन में, लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल चैनल) 1 पतला।
  16. कोमल अंधेरे में आरटी पर कमाल के साथ 4 घंटे के लिए दूसरी माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं।
  17. इस ऊष्मायन के और मंद रोशनी के तहत अंत में, हटाने और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान त्यागें। 0.5 मिलीलीटर PBTx जोड़ें। धीरे 5 मिनट के लिए रॉक। निकालें और समाधान त्यागें। दो बार दोहराएँ। या तो PBTx या 50% ग्लिसरॉल / पीबीएस में स्टोर इमेजिंग प्रक्रिया पर निर्भर करता है।

4. Confocal इमेजिंग और प्रसंस्करण

  1. माउंट इमेजिंग के लिए भ्रूण। एक गिलास स्लाइड पर 5 भ्रूण - 1 जगह। मुख्य coverslip और स्लाइड चैम्बर के प्रत्येक पक्ष पर coverslip टुकड़े का उपयोग कर के बीच एक कक्ष बनाएँ। आमतौर पर, चार # 1 coverslips सील बिना इन स्पेसर ढेर बनाने के लिए उपयोग किया जाता है।
    नोट: कोई बढ़ते मध्यम आवश्यक है।
  2. एक 100X तेल विसर्जन का प्रयोग करेंउद्देश्य प्रेषित प्रकाश का उपयोग कर ध्यान में एकल भ्रूण लाने के लिए। रोशनी बंद करें। confocal खुर्दबीन पर मुड़ें। सुनिश्चित करें कि उचित लेजर (हरे और / या लाल) चालू हैं और दूरदराज के फोकस सहायक लगी हुई है।
  3. confocal कार्यक्रम चालू करें। में "मोल बार," उचित उद्देश्य का चयन करें। "XY मूल" बार में, 1024 बटन पर क्लिक करके 1024 के लिए छवि का आकार निर्धारित किया है।
  4. "लेजर डिटेक्टर और" बार में, लेजर और प्रत्येक चैनल के लिए डिटेक्टर पर बारी करने के लिए लाल और हरे रंग के बॉक्स 488 568 बॉक्स पर क्लिक करें। मध्यम करने के लिए पिनहोल सेट और प्रत्येक चैनल की कल्पना करने के लिए "लाभ" के बार में लाभ को समायोजित।
  5. "मोल सेटिंग्स" बार में, छवियों को प्राप्त करने शुरू करने के लिए "लाइव" पर क्लिक करें। "देखें सेटिंग्स" बार में, "लाइव" विंडो में केंद्र के लिए "बल इंटीग्रल ज़ूम" बॉक्स अचयनित।
  6. "मोल सेटिंग्स" बार में, "जेड" टैब के अंतर्गत, छवि की परतों के माध्यम से कदम। परमाणु चयन करने के बादऑप्टिकल वर्गों की mber छवि में शामिल करने के लिए, z विमान के "केन्द्र" में कुछ बिंदु तक ले जाएँ।
  7. "जेड" टैब के अंतर्गत, छोटे लाल "संदर्भ" बॉक्स पर क्लिक करें। इस बिंदु "केन्द्र" के रूप में चुना RFA पर शून्य होगा। लेबल बॉक्स "कदम आकार" में, परतों की (0.25 माइक्रोन 2.0 माइक्रोन के बीच और आदर्श है) मोटाई का चयन करें। "फ़ाइल का आकार" बॉक्स पर ध्यान दे और 1GB को सीमित करने का प्रयास करें।
    नोट: आमतौर पर, 40 में 0.5 की ऑप्टिकल वर्गों के लिए ऊपर - 1.0 माइक्रोन प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन वर्गों की संख्या अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है।
  8. छवि के ऊपर चरम मिल जाए, करने के लिए "टॉप" अगले चक्र क्लिक करें और जेड परतों के माध्यम से चलते हैं। अब अगले "नीचे" करने के लिए सर्कल पर क्लिक करें, कंप्यूटर सेंटर के रूप में परत करने के लिए वापस छवि ले जाएगा। फिर छवि के नीचे चरम लगाने के लिए परतों के माध्यम से चलते हैं।
  9. फिर "लाइव" "मोल सेटिंग" में बॉक्स पर क्लिक करें लेजर को रोकने के लिएअधिग्रहण। इस पैनल में, लेबल औसत लाल बक्से और जेड ढेर पर क्लिक करें। इन बक्सों में हरे रंग के हो जाएंगे।
  10. "मोल सेटिंग्स" बॉक्स में, "एकल" पर क्लिक करें छवियों की पूरी श्रृंखला के अधिग्रहण के लिए। आप के रूप में यह दोनों चैनलों में और पूरे जेड ढेर के माध्यम से स्कैन प्रगति की निगरानी कर सकते हैं।
  11. , बचाने मात्रा खिड़की पर क्लिक करें और क्लिक करने के लिए "के रूप में बचाने के लिए" और फ़ाइल नाम। एक ".ids" फ़ाइल के रूप में सहेजें। मात्रा के लिए, जबकि जेड ढेर अभी भी खुला है फ़ाइल रेंडर चयन डेटा नीचे मेनू खींचने के लिए और "मात्रा प्रस्तुत करना" पर क्लिक करें। एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में प्रदान की गई फ़ाइल को बचाओ। यह अनुमानित छवि है कि इस प्रकाशन में दिखाया जाता है।

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Representative Results

फास्फो-epitopes Visualizing के लिए इष्टतम स्थितियों

Zebrafish भ्रूण में प्रोटीन epitopes की immunolocalization का वर्णन तरीके सीटू संकरण में के माध्यम से mRNAs स्थानीयकृत के लिए उन लोगों की तुलना में अपेक्षाकृत विरल किया गया है। Zebrafish भ्रूण की रोमक कोशिकाओं में प्रोटीन epitopes स्थानीयकृत करने में इस्तेमाल किया Fixatives 4% पीएफए ​​/ पीबीएस और सेंध लगानेवाला, जो मेथनॉल और सीटू संकरण में पूरे माउंट द्वारा शाही सेना के DMSO। 19 स्थानीयकरण (चाहें तो) का एक मिश्रण है को शामिल किया है आमतौर पर पीएफए ​​का उपयोग कर हासिल की है 100% मेथनॉल में भंडारण के द्वारा पीछा किया। 20,21 हमारे अध्ययन से पता चला है कि काश लगानेवाला संयोजन, जब दो और सात के बीच दिन के लिए मेथनॉल में समय सीमित है, काफी बेहतर किसी अन्य लगानेवाला के लिए पी-CaMK-द्वितीय एंटीबॉडी के साथ immunolocalization लिए किया गया था । ए एल एस संकेत इस पीएफए ​​/ मेथनॉल संयोजन के साथ हासिल की थीओ जब सेंध लगानेवाला, 4% पीएफए ​​/ पीबीएस या मेथनॉल अकेले इस्तेमाल किया गया, भ्रूण के भीतर विकास के समय और स्थान के आधार पर की तुलना में काफी अधिक है।

जब तकनीक का इस्तेमाल किया और यहां प्रत्येक लगानेवाला और विकास समय के लिए वर्णित अनुकूलन, एक नियंत्रण नमूना सिवाय इसके कि प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़ा गया था तैयार किया गया था जिसमें सभी चरणों का पालन किया गया। जब एक ही परिस्थितियों से ऊपर वर्णित के तहत imaged इस तरह के नियंत्रण के नमूने एक फ्लोरोसेंट संकेत का अभाव है। इस पर नियंत्रण के लिए किसी भी एंटीबॉडी के साथ इस दृष्टिकोण नकल अन्य जांचकर्ताओं के लिए सिफारिश की है।

पीएफए ​​/ मेथनॉल लगानेवाला संयोजन मजबूत पी CaMK-द्वितीय संकेत मिले हैं और यह भी acetylated ट्यूबिलिन, जो सिलिया के लिए एक मानक है मार्कर के लिए immunostaining के साथ संगत था। Developmentally, पहले रोमक अंग है कि उभर रहे हैं और इन अध्ययनों में imaged किया गया है Kupffer के पुटिका (केवी) है। केवी पृष्ठदंड के पीछे के अंत में स्थित है के रूप में 12-विखंड (15 HPF) मंच (चित्रा 1) पर दिखाया गया है। केवी एक क्षणिक अंग है और बाएँ सही विषमता के लिए जिम्मेदार है। यह 2-विखंड चरण (12 HPF) पर उभर रहे हैं और 18-विखंड मंच के आसपास गायब हो जाता है। बैरंग प्राथमिक सिलिया तरल पदार्थ की एक परिपत्र प्रवाह है, जो केवी और असतत स्थानों में CaMK-द्वितीय के सक्रियण (चित्रा 1) अस्तर रोमक कोशिकाओं में सीए 2 की ऊंचाई की ओर जाता है उत्पन्न करते हैं। पी-CaMK-द्वितीय जेट प्रकट होता है और जब तक सिलिया पिटाई कर रहे हैं। 12 केवी के एक तरफ गायब हो जाता है इस प्रारंभिक चरण में, कुल भ्रूण CaMK-द्वितीय स्तर अभी भी केवल आधा 24 HPF पर के रूप में स्तर और स्तर का दसवां हैं विकास के 3 दिन में। 11 इसकी वजह शायद यह कुल CaMK-द्वितीय अभिव्यक्ति 15 HPF पर अपेक्षाकृत कम है, इस स्तर पर immunostaining तकनीक में कोई सुधार विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

betweएन 24 और 72 HPF विकास के, पी CaMK-द्वितीय pronephric नलिकाओं (आंकड़े 2,3) के विशिष्ट क्षेत्रों अस्तर रोमक कोशिकाओं के शिखर सतह पर दिखाई देता है। पूरे pronephric वाहिनी के साथ और (चित्रा 2) आसन्न somites भर में कुल CaMK-द्वितीय के immunoreactivity यह दर्शाता है कि केवल भ्रूण CaMK-द्वितीय की एक सबसेट सक्रिय होता है (पी-CaMK II)।

फिक्सेशन शर्तें GFP प्रतिदीप्ति के संरक्षण के साथ संगत कर रहे हैं

इन तकनीकों में भी निर्धारण (चित्रा 3) वृद्धि के बिना हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) प्रतिदीप्ति बनाए रखने के साथ संगत कर रहे हैं। GFP टैग CaMK-द्वितीय में निर्माण कि इस आंकड़े में प्रयोग किया जाता है, GFP प्रतिदीप्ति पर्याप्त हालांकि पीएफए ​​/ मेथनॉल निर्धारण और बाद में immunostaining बरकरार रखती है। Pronephric वाहिनी अस्तर कोशिकाओं के एक उच्च बढ़ाई ध्यान में रखते हुए (चित्रा 3), धई-GFP CaMK-द्वितीय की पच्चीकारी अभिव्यक्ति कोशिकाओं भी है कि पी-CaMK-II के लिए immunostained किया गया है में देखी जा सकती है।

Zebrafish भ्रूण कान एक और ऊतक जिसमें सीए 2 की ऊंचाई, CaMK-द्वितीय के माध्यम से अभिनय, इसके विकास को प्रभावित करती है। 14 Zebrafish कान सामान्य रूप से विकास के चारों ओर एक दिन में दिखाई देते हैं। इस समय, CaMK-द्वितीय तीव्रता kinocilia के आधार पर और kinocilium (चित्रा 4) के साथ निचले स्तर पर सक्रिय है। छवियों के इस सेट से पता चलता है कि इस निर्धारण और immunolocalization तकनीक सिलिया के भीतर धुंधला करने का पता लगा सकते हैं, एक संरचना है जिसका पार अनुभाग कम से कम 1 माइक्रोन है। ये सिलिया इस निर्धारण और immunostaining प्रक्रिया के दौरान उनकी संरचना बरकरार रहती है।

विकास का एक बाद में समय पर भीतरी कान में दो रंग counterstaining का एक अतिरिक्त उदाहरण के दोनों एलेक्सा 488 के साथ धुंधला द्वारा प्राप्त किया गया थाphalloidin और विरोधी acetylated ट्यूबिलिन एक एलेक्सा 568 के द्वारा पीछा माध्यमिक एंटीबॉडी (चित्रा 5) टैग किए गए। ऐसा नहीं है कि पीएफए ​​/ मेथनॉल निर्धारण विधि दोनों एफ actin और ट्यूबिलिन, जो सभी fixatives का सच नहीं है बरकरार रखता उल्लेखनीय है। यह उदाहरण पूरे कान के लिए एक विलय रंग छवि के रूप में और फिर उप-क्षेत्रों के लिए दिखाया गया है। 14

दो रंग counterstaining का अंतिम प्रतिनिधि उदाहरण मछली की एक तनाव है कि झिल्ली-लक्षित GFP (चित्रा 6) के साथ भ्रूण उत्पादन के साथ हासिल की थी। झिल्ली लक्षित GFP किसी अन्य प्रोटीन से जुड़ी नहीं है और जब मेथनॉल के साथ निकाली गई, इसलिए इस छवि मछली है कि पीएफए ​​के साथ अकेले तय किया गया से प्राप्त हुई थी खो दिया है। इस परिणाम से पता चलता है कि मेथनॉल उपचार झिल्ली निकालता है, तो यह प्रोटीन है कि विशेष रूप से बाध्य किया जा सकता है झिल्ली के लिए अनुशंसित नहीं है। इस आंकड़े में पी-CaMK-द्वितीय संकेत है कि प्राप्त करता है, तो methan के सापेक्ष कम हैराजभाषा भी इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह दर्शाता है कि विकासशील भ्रूण के इस स्तर और स्थान (किडनी) में, संकेत काफी मजबूत मेथनॉल उपचार के बिना पता लगाया जा रहा है। यही कारण है कि केवी स्तर पर सच नहीं है;। यानी, मेथनॉल पी CaMK-द्वितीय immunostaining कल्पना करने के लिए आवश्यक है। यह उदाहरण केवल एक मर्ज किए गए छवि जहां गुर्दे की pronephric वाहिनी ट्रंक पेशी के निकट है के रूप में दिखाया गया है।

सारांश में, पीएफए ​​/ मेथनॉल निर्धारण विधि यहाँ वर्णित GFP के संरक्षण के साथ और एफ actin के लिए धुंधला हो जाना, acetylated ट्यूबिलिन, कुल CaMK-द्वितीय और पी-CaMK-द्वितीय के साथ संगत है।

आकृति 1
चित्रा 1। पी CaMK-द्वितीय Zebrafish केवी में acetylated ट्यूबिलिन (सिलिया) के लिए counterstained। एक भी लाइव 12 विखंड चरण के दृश्य (12 एस एस) भ्रूण केवी के पीछे स्थान की गिरफ्तारी से पता चलता हैrowhead (पार्श्व दृश्य, ए) और बॉक्स के भीतर चक्र (उदर देखें, बी)। इस चरण में भ्रूण का उपयोग तय किया गया पीएफए ​​/ मेथनॉल। भ्रूण एक एलेक्सा 488 -labelled माध्यमिक एंटीबॉडी (ग्रीन चैनल) द्वारा पीछा acetylated ट्यूबिलिन के लिए immunostained गया। अगले, पी-CaMK-द्वितीय के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी एक एलेक्सा 568- लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल चैनल) द्वारा किया गया। उत्तरोत्तर अधिक आवर्धन (सी, डी) में वर्णित के रूप में दो चैनल फ्लोरोसेंट छवि अनुमानों हासिल किया गया। स्केल बार 10 माइक्रोन =। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन से संशोधित किया गया है। 12 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2। पी CaMK-II के लिए counterstainedZebrafish किडनी साथ कुल CaMK-द्वितीय। 30 HPF पर एक एकल dechorionated भ्रूण पीएफए ​​/ मेथनॉल का उपयोग कर तय किया गया था। भ्रूण तो कुल CaMK-द्वितीय एलेक्सा 488 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (हरा) के द्वारा पीछा के लिए दाग रहे थे। अगले, पी-CaMK-द्वितीय प्राथमिक एंटीबॉडी एलेक्सा 568 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल) द्वारा किया गया। एक धुंधला कि लाइन जबकि कुल CaMK-द्वितीय pronephric zebrafish गुर्दे की नलिकाओं आसन्न मांसपेशियों के ऊतकों की और sarcomeres भर विखंड सीमाओं पर समृद्ध है कोशिकाओं के शिखर सतह के साथ सक्रिय CaMK-द्वितीय के संवर्धन (लाल रंग में) का पता चलता है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। इन छवियों से आदेश पूरे गुर्दे की कल्पना करने में पाठ में वर्णित एक कम बढ़ाई हासिल किया गया। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन से संशोधित किया गया है। 13 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


GFP के लिए चित्रा 3। पी CaMK-द्वितीय काउंटर imaged Zebrafish गुर्दे की कोशिकाओं में। यह 30 HPF भ्रूण एक सीडीएनए एन्कोडिंग एक प्रमुख नकारात्मक GFP-CaMK-द्वितीय। 13 इस तरह के इंजेक्शन आम तौर पर पच्चीकारी अभिव्यक्ति दिखाने के साथ इंजेक्ट किया गया था। भ्रूण पीएफए ​​/ मेथनॉल का उपयोग कर तय है और फिर एक एलेक्सा 568 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर पी CaMK-II के लिए immunostained गया था। इमेजिंग का पता चलता है कि GFP पीएफए ​​/ मेथनॉल निर्धारण, पुनर्जलीकरण, अवरुद्ध और immunostaining के माध्यम से बनी हुई है। स्केल बार 10 माइक्रोन =। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन से संशोधित किया गया है। 13 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 पी CaMK-द्वितीय acetylated ट्यूबिलिन साथ Zebrafish भीतरी कान में counterstained। यह 30 HPF भ्रूण पीएफए ​​/ मेथनॉल का उपयोग कर तय किया गया था। विरोधी acetylated ट्यूबिलिन एंटीबॉडी क्रम में एलेक्सा 488 -labeled माध्यमिक एंटीबॉडी, पी CaMK-द्वितीय एंटीबॉडी और एलेक्सा 568 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया गया था। धुंधला पता चलता है कि पी-CaMK-द्वितीय भीतरी कान सिलिया के साथ मौजूद है और acetylated ट्यूबिलिन के साथ सह-localizes। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन से संशोधित किया गया है। 14 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5। Actin और acetylated ट्यूबिलिन Zebrafish भीतरी कान में। तीन दिन पुराने (72 HPF) zebrafish भ्रूण तय की और Acetylated टी के लिए immunostained गया थाएलेक्सा 568 -labeled माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग ubulin, एलेक्सा 488 phalloidin का उपयोग कर actin दृश्य द्वारा पीछा किया। सिलिया के साथ ही कान की axonal इन्नेर्वतिओन (लाल रंग में) acetylated ट्यूबिलिन से पता चला है और एफ actin संरचनाओं मांसपेशी फाइबर (हरे रंग में) शामिल हैं। दो zebrafish कान की रोमक संवेदी क्षेत्रों और अधिक विस्तार में दिखाया जाता है: पूर्वकाल मैक्युला (एएम) और पीछे शिखा (पीसी)। स्केल बार 10 माइक्रोन =। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन से संशोधित किया गया है। 14 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
। चित्रा 6 पी CaMK-द्वितीय काउंटर झिल्ली GFP के लिए Zebrafish गुर्दे में imaged यह एकल मर्ज किए गए छवि जिसमें β-actin:। CAAX-GFP भ्रूण (30 HPF) तय की गई थी और पी CaMK- के लिए दागद्वितीय एलेक्सा 568 लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया। एक धुंधला कि pronephric zebrafish गुर्दे की नलिकाओं लाइन कोशिकाओं के शिखर सतह के साथ सक्रिय CaMK-द्वितीय के संवर्धन (लाल रंग में) का पता चलता है। ये गुर्दे की कोशिकाओं नलीपरक सिर्फ मांसपेशियों के ऊतकों के नीचे बसे हैं और दोनों झिल्ली लक्षित GFP की अभिव्यक्ति (हरे रंग में) से चिह्नित कर रहे हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पीएफए ​​/ मेथनॉल विधि zebrafish विकास के दौरान phospho-टी 287 -CaMK-द्वितीय मिलान के immunolocalization के अनुकूलन के प्राथमिक उद्देश्य के साथ इस प्रयोगशाला में विकसित किया गया था। इस पद्धति को सफलतापूर्वक zebrafish केवी, 12 भीतरी कान 14 और गुर्दे की। विशेष रूप से केवी चरण में 13, इस तकनीक जरूरी हो गया था सहित कई रोमक अंगों के गठन के दौरान पी CaMK-द्वितीय स्थानीय। इस विधि की सफलता क) autofluorescence के न्यूनतम, ख) phospho-CaMK-द्वितीय मिलान के संरक्षण और ग) एंटीबॉडी के लिए मिलान का बढ़ाया पहुँच का एक संयोजन के कारण होने की संभावना है।

इस दृष्टिकोण का एक प्राथमिक सीमा मेथनॉल में भंडारण के लिए समय है। जबकि पी CaMK-द्वितीय के immunoreactivity -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में दो दिनों के बाद अधिक से अधिक है, इस मिलान की जेट मेथनॉल में भंडारण के एक सप्ताह के बाद खो दिया है। यह स्पष्ट नहीं है कि इस समय फॉस्फेट समूह hy हैdrolyzed या आगे विकृतीकरण होता है कि immunoreactivity कम हो जाती है। मेथनॉल / -20 डिग्री सेल्सियस पर EGTA जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान tubulin युक्त संरचनाओं के संरक्षण के लिए एक पारंपरिक रूप से तेजी से लगानेवाला है। 22 हालांकि, अकेले मेथनॉल नहीं आकृति विज्ञान या यहां तक कि संरचनाओं के संरक्षण के लिए वांछनीय ऐसे actin cytoskeleton के रूप में है और से पहले किया जाना चाहिए पीएफए।

इस दृष्टिकोण का अतिरिक्त लाभ यह है कि यह भी इस तरह के एफ actin और acetylated ट्यूबिलिन के रूप में अन्य epitopes को बरकरार रखता है और GFP प्रतिदीप्ति के मूल को खत्म नहीं करता हैं। ऐसे सेंध लगानेवाला के रूप में अन्य fixatives, अन्य epitopes 13 के लिए बेहतर होते हैं और पी CaMK-द्वितीय धुंधला के साथ संगत बने हुए हैं, हालांकि पी CaMK-द्वितीय धुंधला पीएफए ​​/ मेथनॉल से सेंध लगानेवाला में कमजोर है। चूंकि phospho-प्रोटीन मार्ग है कि प्रारंभिक विकास के दौरान सक्रिय हैं संकेतन में प्रचलित हैं, सेंध लगानेवाला और पीएफए ​​/ मेथनॉल Zeb में अन्य phospho-epitopes के लिए दो fixatives के रूप में सिफारिश कर रहे हैंrafish भ्रूण। अन्य प्रोटीन और उनके एंटीबॉडी के लिए इस तकनीक के साथ अनुप्रयोगों के विकास में, यह एंटीबॉडी कि immunoblots पर भी प्रतिक्रियाशील रहे है और क्लोन और overexpressed प्रोटीन के साथ जो एंटीबॉडी मान्य किया जा सकता है, के मददगार दिया गया है। 12

इसकी वजह यह है कि यह एक) प्रोटीन के स्तर पर जीन दमन पुष्टि कर सकते हैं और ख) कार्रवाई के मॉडल के विकास के लिए सक्षम बनाता है immunolocalization के लिए तकनीक का अनुकूलन करने के प्रयास के लायक है। इस प्रयोगशाला में, इन assays के परिणामों को मॉडल के माध्यम से जो CaMK-द्वितीय कार्यों के निर्माण की अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, केवी में अपने स्थान के इस अंग की भूमिका की तरह, क्षणिक और विषम है। गुर्दे में, pronephric नलीपरक कोशिकाओं के शिखर पक्ष पर अपने स्थान भूमिकाओं कि वाहिनी से संकेतों का जवाब पता चलता है। अंत में, कान kinocilia के आधार पर विशिष्ट तीव्र puncta में इस एंजाइम की सक्रियता के एक स्थानीय सीए 2 संकेत पता चलता है। यहाँ वर्णित विधियोंयह भी किसी भी अन्वेषक जो दो फ्लोरोसेंट चैनलों में किसी भी भ्रूण कोशिका प्रकार के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करना चाहता है के लिए उपयोगी होना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान IOS-0817658 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

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References

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रसायन विज्ञान अंक 108 फिक्सेशन phospho-epitopes कैल्शियम सिलिया माइक्रोस्कोपी Kupffer के पुटिका गुर्दे कान zebrafish
पूरा पर्वत zebrafish भ्रूण की रोमक अंगों में Immunostaining फास्फो-epitopes
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Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

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