Summary
Tekniker beskrivs till immunostain fosfor-epitoper i hela zebrafisk embryon och sedan genomföra två-färg fluorescerande konfokal lokalisering i cellstrukturer så små som primär cilier. Teknikerna för fixering och bildbehandling kan definiera platsen och kinetik av utseende eller aktivering av specifika proteiner.
Abstract
Den snabba spridningen av celler, vävnadsspecifika uttrycket av gener och framväxten av signalledningar karakterisera tidig embryonal utveckling av alla ryggradsdjur. Kinetik och lokalisering av signaler - även inom enskilda celler - i det utvecklande embryot kompletterar identifieringen av viktiga utvecklings gener. Immunfärgning tekniker beskrivs som har visat att definiera kinetiken för intracellulära och hela djursignaler i strukturer så små som primär cilier. Teknikerna för fäst, imaging och bearbeta bilder med hjälp av en laserskanning konfokala mikroskop kan fyllas i så lite som 36 timmar.
Zebrafisk (Danio rerio) är en önskvärd organism för utredare som vill genomföra studier i ett ryggradsdjur som är prisvärd och relevanta för mänskliga sjukdomar. Genetiska knockouts eller knockdowns måste bekräftas av förlusten av själva proteinprodukten. En sådan bekräftelse av proteinförlustkan uppnås med användning av de tekniker som beskrivs här. Ledtrådar till signalvägar kan också dechiffreras genom användning av antikroppar som är reaktiva med proteiner som har posttranslation modifieras av fosforylering. Bevara och optimera fosforylerade tillståndet för en epitop är därför avgörande för denna bestämning och åstadkoms genom detta protokoll.
Denna studie beskriver tekniker för att åtgärda embryon under första 72 timmar av utveckling och samarbete lokalisera ett antal relevanta epitoper med cilier i Kupffer s vesikel (KV), njurarna och i innerörat. Dessa tekniker är enkel, inte kräver dissektion och kan fyllas i på en relativt kort tidsperiod. Utskjutande konfokala bildstaplar i en enda bild är ett användbart sätt att presentera dessa data.
Protocol
Zebrafisk förfaranden i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Virginia Commonwealth University.
1. Beredning av reagenser
- 4% PFA / PBS. Väg 8 g paraformaldehyd (PFA) i dragskåp. Medan fortfarande i dragskåp, upplösa den torra PFA i ~ 80 ml destillerat H2O under omröring och upphettning till 50 ° C. Under omrörning, tillsätt 3 - 10 droppar färsk 1N NaOH tills PFA är fullständigt upplöst och lösningen klargörs. Ta bort från värmen och tillsätt 100 ml 2x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Bringa volymen till 200 ml med destillerat H2O Svalna till RT och bekräfta pH på 7,4 före användning. Förvara i mörker vid 4 ° C, men använd inom en vecka.
- Använd 100% metanol utan tillägg. Använd 95% etanol utan tillägg.
- Förbered Fosfatbuffrad Tween (PBT). Komplettera Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,1% Tween-20. Lägg 0.5 ml av en 20% Tween-20 stamlösning till 100 ml 1 x PBS. Förvara vid RT.
- Förbereda Fosfatbuffrad Triton-X (PBTx). Komplettera PBS med 0,1% Triton X-100. Tillsätt 0,5 ml av en 20% Triton X-100 lager till 100 ml PBS. Förvara vid RT.
- Förbered 10% NGS / PBTx. Normalt getserum (NGS) blockerar icke-specifika bindningsställen. Butiks NGS i alikvoter vid -20 ° C. Om du vill använda, tillsätt 1 ml till 9 ml PBTx.
- Förbered 50% glycerol / PBS. Blanda väl lika delar av 2x PBS och 100% glycerol. Förvara vid RT.
2. Embryo Fixering
- . (. T.ex. β-aktin: CAAX-GFP) avel Skaffa vild typ (AB och WIK) eller transgena embryon genom naturlig parning. Om så önskas, injicera embryon med konstruktioner eller morpholinos, som beskrivs. 15,16
- Höj embryon. Samla embryon och inkubera vid 28,5 ° C i närvaro av 0,003% 1-fenyl-2-tiourea (PTU) för att blockera pigmentering såsom beskrivits. 17 p>
- Fix. När embryona har nått önskad utvecklingsstadiet, 18, söva embryona med hjälp MESAB, ta bort så mycket system vatten som möjligt och tillsätt färsk 4% PFA / PBS under 3-4 timmar vid rumstemperatur. OBS: Ibland mindre än 20 timmar efter befruktning (HPF), fixa före dechorionation. Ibland efter 20 HPF, dechorionate före fixering med hjälp av två par av fin spets pincett under ett dissektionsmikroskop.
- Ändra lösningar. Överför embryon med hjälp av ett stort hål pipett, såsom beskrivits. 17 Ändra lösningar i 1,5 ml förslutna mikrocentrifugrör, helt enkelt genom att låta embryon sedimentera genom gravitation utan centrifugering.
- Post-fixativ Efter tre -. 4 timmar, ta bort PFA / PBS, ersätt med 100% metanol och förvara vid -20 ° C under minst 48 timmar. OBS: För maximal P-CaMK-II immunreaktivitet, begränsa den totala metanollagringstiden till en vecka.
- Placera minst 10 embryon för varje experimentell tillstånd utjämnade 1,5 ml mikrocentrifugrör, och märka dem.
- Låt embryon att lösa. Avlägsna och kassera metanol och rehydrera med progressiva tvättar innehållande 0,5 ml av minskande koncentrationer av etanol, vilket indikeras i nästa steg. Varje steg är en 5 min tvätt med gunga.
- Progressivt rehydrera med dessa 5 lösningar: 66% etanol / 33% PBTx, 33% etanol / 66% PBTx, PBTx, 100% PBTx (detta är 100% 100% PBTx (detta är den första rapporten av PBTx), den andra upprepning av PBTx).
- Ta bort förra PBTx tvätt. Tillsätt 0,5 ml 10% NGS / PBTx. Inkubera under minst 1 h vid RT med försiktig skakning och sedan ta bort och kasta lösning.
- Förbered primära antikroppen lösning genom att späda i 10% NGS / PBTx. Om samtidig immunfärgning, använder högre affinitet antikropp först. För denna studie, inkubera med mus-anti-acetylerad tubulin monoklonal antikropp utspädd 1: 500. för example, om det finns 10 sampel, kombinera 6 pl av beståndet antikroppslösningen med 3 ml 10% NGS / PBTx och sedan distribuerar 0,3 ml av denna in i varje rör.
- Tillsätt 0,2 - 0,5 ml av den utspädda primära antikroppen till varje rör för att fördjupa alla embryon. Inkubera med försiktig skakning O / N vid RT.
- På morgonen, ta bort och kasta antikroppslösning. Tillsätt 0,5 ml 2% NGS / PBTx att tvätta bort överflödigt primära antikroppen. Skaka i 5 min. Ta bort och kassera lösningen. Upprepa två gånger.
- Dim lampor och späd lämplig fluorescerande-konjugerad sekundär antikropp i 10% NGS / PBTx så att varje tillstånd innehåller minst 0,5 ml. Med mus-anti-acetylerad tubulin primär antikropp, använda den gröna-fluorescerande färgämnet get-anti-mus-IgG vid en 1: 500 spädning.
- Inkubera sekundär antikropp under 4 h med försiktig skakning vid RT i mörker. Från och med nu, process prov under nedtonade ljus och inkubera i en mörk behållare eller genom att linda i aluminiumfolie.
- Vid slutet av inkubationen, ta bort och kasta den sekundära antikroppslösningen. Tillsätt 0,5 ml 2% NGS / PBTx att tvätta. Skaka i 5 min. Ta bort och kassera lösningen. Upprepa två gånger.
- Om samtidig immunfärgning, få den andra primära antikroppen från en annan art än den första primära antikroppen. I dessa studier, följa kanin anti-fosfor CaMK-II-antikropp genom röda fluorescerande färgämne-konjugerad get anti-kanin IgG sekundär antikropp.
- Späd kanin-anti-fosfor CaMK-II-antikropp 01:20. För varje rör av embryon, suspendera i 0,3 ml 10% NGS / PBTx, lägg sedan till 15 l av beståndet antikroppslösningen.
- Se till att embryon är nedsänkta och ljuset dämpas. Inkubera med försiktig skakning O / N vid RT i mörker.
- På morgonen i svag belysning, ta bort och kasta antikroppslösning. Tillsätt 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Skaka i 5 min. Ta bort och kassera lösningen. Upprepa två gånger.
- Håll taklampa dim och späd nog av den lämpliga fluorescerande-conjugated sekundär antikropp, så att varje tillstånd innehåller minst 0,5 ml. I denna studie, späd röda fluorescerande färgämnet-konjugerad get-anti-kanin IgG sekundär antikropp (röd kanal) 1: 500 i 10% NGS / PBTx.
- Inkubera andra sekundär antikropp under 4 h med försiktig skakning vid RT i mörker.
- Vid slutet av denna inkubation och under svag belysning, ta bort och kasta den sekundära antikroppen lösning. Tillsätt 0,5 ml PBTx. Skaka i 5 min. Ta bort och kassera lösningen. Upprepa två gånger. Butik i antingen PBTx eller 50% glycerol / PBS beroende på avbildningsproceduren.
4. Confocal Imaging och Processing
- Mount embryon för avbildning. Placera 1 - 5 embryon på ett objektglas. Skapa en kammare mellan huvudtäckglas och objektglaset med hjälp av täckglas fragment på vardera sidan av kammaren. Normalt är fyra # 1 täck används för att göra dessa distans högar utan tätning.
OBS: Ingen monteringsmedium är nödvändig. - Använd en 100X oljeimmersionmålet att föra enda embryo i fokus genomfallande ljus. Stäng av ljus. Slå på konfokalmikroskop. Se till att lämpliga lasrar (grön och / eller röd) är påslagna och fjärrfokus medhjälpare bedriver.
- Slå på konfokal programmet. I "Acquire bar," välja rätt mål. I "XY Basic" bar, ställ bildstorleken till 1024 genom att klicka på 1024-knappen.
- I "Laser och detektor" bar, klicka på den röda 488 lådan och den gröna 568 rutan för att aktivera laser och detektor för varje kanal. Ställa pinhole till medium och justera förstärkningen i "Gain" bar för varje kanal för att visualisera.
- I "Hämta inställningar" bar, klicka på "Live" för att börja hämta bilder. I "Visa inställningar" bar, avmarkera "Tvinga Integral Zoom" rutan till centrum i "Live" fönstret.
- I "Hämta inställningar" bar under "Z" -fliken, steg genom lagren av bilden. Efter att ha valt number av optiska sektioner för att införliva i bilden, flytta till någon punkt i "centrum" av z-planet.
- Under "Z" -fliken, klicka på den lilla röda "Referens" rutan. Detta kommer att nollställa RFA vid den punkt som valts som "centrum". I rutan "Stegstorlek", väljer tjockleken av skikten (mellan 0,25 um och 2,0 um är perfekt). Var uppmärksam på "filstorlek" box och försöka begränsa till 1 GB.
OBS: Vanligtvis upp till 40 optiska sektioner av 0,5-1,0 um erhålls, men antalet sektioner kan bestämmas empiriskt. - För att hitta toppen extrema av bilden, klicka på cirkeln bredvid "Top" och gå igenom z skikten. Klicka nu på cirkeln bredvid "Bottom", kommer datorn att ta bilden tillbaka till skiktet som centrum. Återigen rör sig genom lagren för att hitta den nedre extrema bilden.
- Klicka på "Live" igen i "Hämta inställningar" rutan för att stoppa lasernförvärv. I denna panel, klicka på den röda rutorna Average och Z-stack. Dessa boxar blir grön.
- I "Hämta inställningar" klickar "Single" för att förvärva hela serie bilder. Du kan följa utvecklingen som den skannar i båda kanalerna och genom hela z-stack.
- För att spara genom att klicka på volymfönstret och klicka på "Spara som" och namnge filen. Spara som ett ".ids" fil. Till volym göra filen medan z-stack är fortfarande öppen, väljer datarullgardinsmenyn och klicka på "volym render". Spara den renderade filen som en TIFF-fil. Detta är den projicerade bilden som visas i denna publikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimala förhållanden för att visualisera fosfor-epitoper
Metoder som beskriver immunlokalisering av proteinepitoper i zebrafiskembryon har varit relativt gles jämfört med dem för att lokalisera mRNA via in situ hybridisering. Fixativ som används i lokalisera proteinepitoper i cilierade celler av zebrafiskembryon har inkluderat 4% PFA / PBS och buckla fixativ, som är en blandning av metanol och DMSO. 19 Lokalisering av RNA genom hela montera in situ hybridisering (WISH) uppnås typiskt med användning av PFA följt av lagring i 100% metanol. 20,21 Våra studier visade att WISH fixerings kombination, när begränsa tiden i metanol till mellan två och sju dagar, var vida överlägsen alla andra fixativ för immunlokalisering med P-CaMK-II-antikropp . Signalen uppnås med denna PFA / metanol kombinationen var also betydligt större än när Dent fixativ, 4% PFA / PBS eller metanol användes ensamt, beroende på utvecklingstiden och läge inom embryot.
När man optimerar den teknik som beskrivs här och för varje fixeringsmedel och utvecklande tid användes, var ett kontrollprov ställas, i vilket alla steg följdes, med undantag av att den primära antikroppen uteslöts. Sådana kontrollprover saknade en fluorescerande signal när avbildas under samma betingelser som beskrivits ovan. Denna kontroll rekommenderas för andra forskare replikera detta tillvägagångssätt med någon antikropp.
PFA / metanol fixativ kombination gav den starkaste P-CaMK-II-signalen och var också förenlig med immunfärgning för acetylerad tubulin, som är en standardmarkör för cilier. Utvecklings, den första flimmer organ som framträder och har avbildats i dessa studier är Kupffer s vesikler (KV). KV ligger vid den bakre änden av notochord som visas vid 12-somit (15 HPF) steg (Figur 1). KV är en övergående organ och är ansvarig för vänster-höger asymmetri. Den kommer ut vid 2-somit steget (12 HPF) och försvinner runt 18-somit skede. Slå primära cilier generera ett cirkulärt flöde av fluid, vilket leder till en förhöjning av Ca2 + i cilierade celler som kantar KV och aktiveringen av CaMK-II i diskreta ställen (figur 1). P-CaMK-II reaktivitet visas och försvinner på ena sidan av KV så länge cilier slår. 12 På detta tidiga stadium, totalt embryonala CaMK-II-nivåerna är fortfarande bara hälften av den nivå som vid 24 HPF och en tiondel av nivån på 3 dagar av utveckling. 11 Kanske eftersom total CaMK-II uttryck är relativt låg på 15 HPF, är särskilt viktig någon förbättring i immunfärgning tekniken i detta skede.
betwesv 24 och 72 HPF utveckling förefaller P-CaMK-II på den apikala ytan av cilie celler som kantar specifika regioner av pronephric kanalerna (figurer 2,3). Immunreaktiviteten hos totala CaMK-II längs hela pronephric kanalen och hela intilliggande somiter (Figur 2) visar att endast en delmängd av embryonal CaMK-II är aktiverad (P-CaMK-II).
Fixering kraven är förenliga med Bevara GFP fluorescens
Dessa fixeringstekniker är också kompatibla med fäst grönt fluorescerande protein (GFP) fluorescens utan förstärkning (Figur 3). I GFP-märkta CaMK-II konstruera som används i denna figur, GFP behåller tillräcklig fluorescens men PFA / metanol fixering och efterföljande immunfärgning. I en hög förstoring vy av celler som kantar pronephric kanal (figur 3), the mosaik uttryck av GFP-CaMK-II kan ses i celler som också har immunostained för P-CaMK-II.
Zebrafisk embryonala örat är en annan vävnad där höjden av Ca2 +, som verkar genom CaMK-II, påverkar dess utveckling. 14 Zebrafish öron visas normalt på omkring en dag av utveckling. Vid denna tidpunkt, är CaMK-II intensivt aktiveras vid basen av kinocilia och på lägre nivåer längs kinocilium (Figur 4). Denna uppsättning av bilder visar att denna fixering och immunlokalisering teknik kan detektera färgning inom cilier, är en struktur vars tvärsnitt är mindre än 1 um. Dessa cilier behåller sin struktur under denna fixering och immunfärgning processen.
Ett ytterligare exempel på två-färg motfärgning i innerörat vid en senare tidpunkt av utvecklingen uppnåddes genom färgning med både Alexa 488falloidin och anti-acetylerade tubulin följt av en Alexa 568 taggade sekundär antikropp (figur 5). Det är anmärkningsvärt att PFA / metanol fixeringsmetod bevarar både F-aktin och tubulin, vilket inte är sant av alla fixerings. Detta exempel visas som en sammanslagen färgbild för hela örat och sedan för underregioner. 14
Ett slutligt representativt exempel på tvåfärgad motfärgning uppnåddes med en stam av fisk som producerade embryon med membran riktade GFP (Figur 6). Membran riktade GFP är inte kopplad till något annat protein och försvinner när extraheras med metanol, därför denna bild erhölls från fisk som fixerades med PFA ensam. Detta resultat tyder på att metanol behandling utvinner membran, så det rekommenderas inte för proteiner som kan endast membranbundna. P-CaMK-II-signalen i denna figur minskar i förhållande till den som uppnås om metanol användes också, men detta visar att i detta skede och plats (njure) av det utvecklande embryot, är stark nog att upptäckas utan metanol behandling signalen. Det är inte sant KV stadiet,. Dvs metanol krävs för att visualisera P-CaMK-II immunfärgning. Detta exempel är endast visas som en sammanslagen bild där njurens pronephric kanal ligger i anslutning till stammen muskler.
Sammanfattningsvis är den PFA / metanol fixering här beskrivna metoden förenlig med bevarandet av GFP och med färgning för F-aktin, acetylerad tubulin, total CaMK-II och P-CaMK-II.
Figur 1. P-CaMK-II motfärgades för Acetylerad tubulin (cilier) i Zebrafish KV. Visningar av en enda levande 12 somit stadiet (12 ss) embryo avslöjar den bakre placeringen av KV av arrowhead (lateral vy, A) och cirkeln i rutan (ventrala vy, B). Embryon i detta skede fixerades med hjälp av PFA / metanol. Embryon immun för acetylerade tubulin följt av en Alexa 488 -märkt sekundär antikropp (grön kanal). Därefter tillsattes kanin-polyklonal antikropp mot P-CaMK-II, följt av en Alexa 568- märkt sekundär antikropp (röd kanal). Tvåkanaliga fluorescerande bild prognoser förvärvades enligt beskrivningen i allt högre förstoringar (C, D). Skalstreck = 10 | im. Denna siffra ändras från en tidigare publikation. 12 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. P-CaMK-II motfärgades förTotalt CaMK-II längs Zebrafish njure. En enda dechorionated embryo vid 30 HPF fastställdes med hjälp av PFA / metanol. Embryon färgades sedan för total CaMK-II följt av Alexa 488 märkt sekundär antikropp (grön). Härnäst tillsattes P-CaMK-II primär antikropp följt av Alexa 568 märkt sekundär antikropp (röd). Färgning avslöjar en anrikning av aktiverad CaMK-II (i rött) längs den apikala ytan av celler som klär kanalerna i pronephric zebrafisk njure medan total CaMK-II är berikad på somit gränserna för angränsande muskelvävnad och hela sarkomerer. Skalstreck = 50 | im. Dessa bilder förvärvades vid en lägre förstoring än vad som beskrivs i texten för att visualisera hela njuren. Denna siffra ändras från en tidigare publikation. 13 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. P-CaMK-II Counter avbildas för GFP i Zebrafish njurceller. Denna 30 HPF embryo injicerades med ett cDNA som kodar en dominant negativ GFP-CaMK-II. 13 Sådana injektioner visar vanligtvis mosaik uttryck. Embryot fastställdes med hjälp av PFA / metanol och sedan immun för P-CaMK-II med hjälp av en Alexa 568 märkt sekundär antikropp. Imaging visar att GFP kvarstår genom PFA / metanol fixering, rehydrering, blockering och immunfärgning. Skalstreck = 10 | im. Denna siffra ändras från en tidigare publikation. 13 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
figur 4 P-CaMK-II motfärgades med Acetylerad tubulin i Zebrafish innerörat. Detta 30 HPF embryo fastställdes med hjälp av PFA / metanol. Anti-acetylerade tubulin antikropp följdes för av Alexa 488 -märkt sekundär antikropp, P-CaMK-II-antikropp och Alexa 568 märkt sekundär antikropp. Färgning avslöjar att P-CaMK-II är närvarande längs innerörat cilier och co-lokaliserar med acetylerad tubulin. Skalstreck = 5 | j, m. Denna siffra ändras från en tidigare publikation. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Aktin och Acetylerad tubulin i Zebrafish innerörat. En tre dagar gammal (72 HPF) zebrafisk embryo var fast och immun för acetylerade tubulin använder Alexa 568 -märkta sekundära antikroppar, följt av aktin visualisering med hjälp av Alexa 488 falloidin. Cilia liksom axonal innervation av örat avslöjas av acetylerade tubulin (rött) och F-aktin strukturer inkluderar muskelfibrer (i grönt). Två cilierade sensoriska regioner i zebrafisk örat är visade mer i detalj: den främre gula fläcken (am) och posterior crista (pc). Skalstreck = 10 | im. Denna siffra ändras från en tidigare publikation. 14 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 6 P-CaMK-II Counter avbildas för Membrane GFP i Zebrafish Kidney Denna enda sammanslagna bild där β-aktin:. CAAX-GFP embryo (30 HPF) fixerades och färgades för P-CaMK-II följt av Alexa 568 märkt sekundär antikropp. Färgning avslöjar en anrikning av aktiverad CaMK-II (i rött) längs den apikala ytan av celler som klär kanalerna i pronephric zebrafisk njuren. Dessa njur duktala celler är inbäddat precis nedanför muskelvävnad och båda markeras med uttrycket av membran riktade GFP (grön). Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PFA / metanol metod utvecklades i detta laboratorium med det primära målet att optimera immunlokalisering av fosfor-T 287 -CaMK-II-epitopen under zebrafisk utveckling. Denna metod framgångsrikt lokaliserad P-CaMK-II under bildandet av flera cilie organ inklusive zebrafisk KV, 12 innerörat 14 och njure. 13 Särskilt vid KV skede var nödvändig denna teknik. Framgången med denna metod är sannolikt på grund av en kombination av a) minimering av autofluorescens, b) bevarande av den fosfo-CaMK-II-epitopen och c) ökad tillgänglighet av epitopen till antikroppar.
En primär begränsning med detta tillvägagångssätt är tiden för lagring i metanol. Medan immunoreaktivitet av P-CaMK-II är maximal efter två dagar i metanol vid -20 ° C, är reaktiviteten hos denna epitop förloras efter en veckas lagring i metanol. Det är inte klart om vid denna tidpunkt fosfatgruppen är hydrolyzed eller vidare denaturering inträffar som minskar immunreaktivitet. Metanol / EGTA vid -20 ° C är en traditionellt snabb fixativ för att bevara tubulin rika strukturer under utvecklingen av tidiga embryon. 22 är emellertid inte önskvärt för att bevara morfologi eller ens strukturer enbart metanol såsom aktin cytoskelettet och måste föregås av PFA.
Ytterligare fördelar med detta tillvägagångssätt är att det bevarar även andra epitoper såsom F-aktin och acetylerade tubulin och eliminerar inte den nativa fluorescens av GFP. Andra fixativ, såsom Dent fixativ, är överlägsna andra epitoper 13 och förblir kompatibla med P-CaMK-II färgning, även om P-CaMK-II färgningen är svagare i Dent fixativ än PFA / metanol. Eftersom fosfor-proteiner är vanliga i signalvägar som är aktiva under tidig utveckling, är Dent fixativ och PFA / metanol rekommenderas som två fixerings för andra fosfor-epitoper i zebrafish embryon. Att utveckla applikationer med denna teknik för andra proteiner och deras antikroppar har det varit bra att ha antikroppar som också är reaktiva på immunblot och har klonat och överuttryckt proteiner med vilka antikroppar kan valideras. 12
Det är värt mödan att optimera tekniker för immunlokalisering eftersom det a) kan kontrollera genen dämpning på proteinnivå och b) möjliggör utveckling av modeller för åtgärder. I detta laboratorium, har resultaten av dessa analyser får utformningen av modeller genom vilka CaMK-II funktioner. Till exempel, är dess läge i KV gående och asymmetrisk, liksom rollen av detta organ. I njuren, antyder dess läge på den apikala sidan av pronephric duktala celler roller som svarar på signaler från kanalen. Slutligen föreslår aktiveringen av detta enzym i specifik intensiv puncta vid basen av örat kinocilia en lokaliserad Ca2 + signal. De metoder som beskrivs härbör också vara till nytta för någon utredare som syftar till att erhålla högupplösta bilder av någon embryonal celltyp i två fluorescerande kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation IOS-0.817.658.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
- Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
- Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
- Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
- Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
- Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
- Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
- Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
- Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
- Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
- Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
- Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
- Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
- Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
- Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
- Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).
