Summary
技術は全体のゼブラフィッシュ胚におけるホスホ - エピトープを免疫染色した後、一次繊毛のように小さな細胞構造の二色の蛍光共焦点の局在化を行うことが記載されています。固定およびイメージングのための技術は、特定のタンパク質の出現または活性化の位置と速度を定義することができます。
Abstract
細胞の急速な増殖は、遺伝子の組織特異的発現およびシグナル伝達ネットワークの出現は、すべての脊椎動物の初期胚発生を特徴付けます。動態および信号の場所 - であっても、単一の細胞内 - 胚では、重要な発達遺伝子の同定を補完します。免疫染色技術は、一次繊毛のように小さな構造に細胞内および動物全体の信号の速度を定義することが示されているが記載されています。レーザー走査型共焦点複合顕微鏡を用いた定着、撮像処理画像のための技術は、わずか36のような時間で完了することができます。
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、手頃な価格とヒト疾患に関連する脊椎動物種の研究を行うことを求める研究者のための望ましい生物です。遺伝的ノックアウトまたはノックダウンは、実際のタンパク質産物の損失によって確認されなければなりません。タンパク質損失のような確認ここに記載された技術を用いて達成することができます。シグナル伝達経路への手がかりはまた、翻訳後リン酸化によって修飾されたタンパク質と反応する抗体を使用して解読することができます。エピトープのリン酸化状態を維持し、最適化することは、この決意することが重要であり、このプロトコルによって達成されます。
本研究では、開発の最初の72時間と共局在クッパーの小胞（KV）における繊毛と関連する様々なエピトープ、腎臓および内耳中に胚を固定するための手法について説明します。これらの技術は、切開を必要としない、単純であり、比較的短時間で完了することができます。単一の画像に共焦点画像スタックを投写することは、これらのデータを提示する有用な手段です。
Protocol
このプロトコルでのゼブラフィッシュの手順は、バージニア・コモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
試薬の調製
- 4％PFA / PBS。ドラフト内でパラホルムアルデヒドの8グラム（PFA）を秤量します。まだドラフト中ながら、50℃まで撹拌しながら加熱し、H 2 Oを蒸留〜80ミリリットルで乾燥PFAを溶解します。 PFAが完全に溶解され、溶液が明確になるまで新鮮な1NのNaOHの10滴 - 攪拌しながら、3を加えます。暑さから削除し、100ミリリットルの2×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。蒸留H 2 Oで200ミリリットルにボリュームをもたらしますRTに冷却し、使用前に7.4のpHを確認します。 4℃で暗所に保管したが1週間以内に使用します。
- 任意のサプリメントなしで、100％メタノールを使用してください。任意のサプリメントなしで、95％エタノールを使用してください。
- リン酸緩衝トゥイーン（PBT）を準備します。 0.1％のTween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を補います。 0を追加します。PBS 1×100mlに20％のTween-20のストック溶液5ml。室温で保管してください。
- リン酸緩衝トリトンX（PBTx）を準備します。 0.1％トリトンX-100を含むPBSを補います。 100mlのPBSに20％トリトンX-100株の0.5ミリリットルを追加します。室温で保管してください。
- 10％NGS / PBTxを準備します。正常ヤギ血清（NGS）ブロック非特異的結合部位。 -20℃で分量を保存NGS。使用するには、9ミリリットルPBTxに1ミリリットルを追加します。
- 50％グリセロール/ PBSを準備します。 2×PBSおよび100％グリセロールの徹底的に等しい部分を混ぜます。室温で保管してください。
2.胚の固定
- 繁殖 、野生型（ABおよびWIK）またはトランスジェニック（ 例えば 、βアクチン。：CAAX-GFP）を取得します。自然交配を通じて胚を。必要であれば、説明したように、構築物またはモルホリノで胚を注入する。15,16
- 胚を上げる。胚を収集し、説明したように色素沈着をブロックするために28.5°C 0.003％の1-フェニル-2-チオ尿素の存在下で（PTU）でインキュベートする。17 P>
- 胚は、所望の発達段階、18に達したとき。修正 、 MESABを使用して胚を麻酔、できるだけ多くのシステムの水を除去し、3のために、新鮮な4％PFA / PBSを追加 - RTで4時間。注：時々未満20時間後に受精（HPF）、前dechorionationに固定します。 20 HPF後の回では、解剖顕微鏡下で細かい点鉗子の2ペアを使用して固定する前にdechorionate。
- ソリューションを変更する。説明したように、ワイドボアピペットを用いて胚を移す。17変更ソリューションを1.5ミリリットルキャップされたマイクロ遠心チューブに、単に胚は、遠心分離することなく、重力によって沈降させることによって。
- ポスト固定剤 3の後- 。4時間、少なくとも48時間、-20℃で100％のメタノールとストアと置き換え、PFA / PBSを削除します。注：最大P-のCaMK-II免疫反応性については、1週間に合計メタノール蓄積時間を制限します。
- キャップされた1.5ミリリットルのマイクロチューブに各実験条件について10胚の最小値を置き、それらにラベルを付けます。
- 胚が解決することができます。削除し、メタノールを破棄し、次のステップに示すように、エタノールの濃度を減少さ0.5 mlを含有する進行性の洗浄で再水和します。各ステップは、ロッキングで5分間の洗浄です。
- 次第にこれらの5の溶液で再水和：66％エタノール/ 33％PBTx、33％エタノール/ 66％PBTx、100％PBTx、100％PBTx（これはPBTxの最初の繰り返しである）、100％PBTxは（これは、第二の反復でありますPBTx）。
- 最後PBTx洗浄を削除してください。 0.5ミリリットル10％NGS / PBTxを追加します。緩やかに揺り動かしながら、室温で少なくとも1時間インキュベートした後、溶液を除去し、廃棄します。
- 10％NGS / PBTxで希釈することにより、一次抗体溶液を準備します。共免疫染色した場合、最初のより高い親和性の抗体を使用しています。 500：この研究のために、1を希釈したマウス抗アセチル化チューブリンモノクローナル抗体とインキュベートします。 examplのためeは、10個のサンプルがある場合、10％NGS / PBTx 3 mlのストック抗体溶液の6マイクロリットルを結合し、各チューブに、この0.3 mlで分配します。
- すべての胚を浸漬する各チューブに希釈した一次抗体の0.5ミリリットル - 0.2を追加します。 RTで穏やかなロッキングO / Nでインキュベートします。
- 午前中は、抗体溶液を除去し、廃棄します。過剰の一次抗体を洗い流すために0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。
- 頭上の照明を暗くし、各条件は、少なくとも0.5ミリリットルを含むように、10％NGS / PBTxに適切な蛍光結合二次抗体を希釈します。マウス抗アセチル化チューブリン一次抗体と、緑色蛍光色素のヤギ抗マウスIgG 1で使用：500希釈。
- 穏やかに暗闇の中で室温で揺らしながら4時間二次抗体をインキュベートします。今から、プロセスのサンプル淡色表示灯の下で、暗い容器にまたはアルミホイルで包むことによってインキュベートします。
- インキュベーションの終了時に、二次抗体溶液を除去し、廃棄します。洗浄するために0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。
- 共免疫染色した場合、最初の一次抗体とは異なる種から第二の一次抗体を得ます。これらの研究では、赤色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体によってウサギ抗ホスホのCaMK-II抗体に従います。
- ウサギ抗リンのCaMK-II抗体1:20に希釈します。胚の各チューブについて、その後、0.3ミリリットル10％NGS / PBTxにサスペンドストック抗体溶液の15μlを添加します。
- 胚が浸漬され、ライトが淡色表示されていることを確認してください。暗闇の中で、室温で穏やかにロッキングO / Nでインキュベートします。
- 薄暗い照明の下で午前中は、抗体溶液を除去し、廃棄します。 0.5ミリリットルの2％NGS / PBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。
- 薄暗いオーバーヘッドライトを保ち、適切な蛍光conjuを十分に希釈します各条件は、少なくとも0.5ミリリットルを含むように、二次抗体をゲーティング。 500 10％NGS / PBTx：本研究では、赤色蛍光色素コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG二次抗体（赤色チャンネル）1を希釈。
- 穏やかに暗闇の中で室温で揺らしながら4時間第二の二次抗体をインキュベートします。
- このインキュベーションの終わりと薄暗い照明の下で、二次抗体溶液を除去し、廃棄します。 0.5ミリリットルPBTxを追加します。ゆっくり5分間揺すります。削除し、解決策を捨てます。二回繰り返します。撮像手順に応じてPBTxまたは50％グリセロール/ PBSのいずれかに保管してください。
4.共焦点イメージングと処理
- イメージングのためのマウント胚。スライドガラス上に5胚 - 1を配置します。メインカバースリップとチャンバーの両側にカバースリップの断片を使用してスライド間のチャンバを作成します。典型的には、4つの＃1カバーガラスをシールすることなく、これらのスペーサ・スタックを作るために使用されます。
注：いいえマウンティング培地は必要ありません。 - 100Xの油浸を使用します目的は、透過光を用いて、焦点に単一胚をもたらすために。ライトをオフにします。共焦点顕微鏡をオンにします。適切なレーザー（緑色および/または赤色）がオンし、リモートフォーカスアクセサリーが締結されていることを確認してください。
- 共焦点プログラムをオンにします。 「獲得バー、「適切な目的を選択します。 「XY基本」バーでは、1024ボタンをクリックすることで、1024に画像サイズを設定します。
- 「レーザーおよび検出器」バーでは、各チャネルのレーザーおよび検出器をオンにするために、赤488ボックスと緑の568のボックスをクリックしてください。培地にピンホール設定し、可視化するために、各チャネルの「ゲイン」バーのゲインを調整します。
- 「取得設定」バーでは、画像の収集を開始するために「ライブ」をクリックします。 「表示設定」バーで、「ライブ」ウィンドウの中央に「インテグラズームを強制」チェックボックスをオフにします。
- 「設定の取得」バーで、「Z」タブで、画像のレイヤーをステップ。 NUを選択した後光学切片のmberは、画像に組み込むz平面の「中心」にいくつかのポイントに移動します。
- 「Z」タブの下で、小さな赤い「リファレンス」ボックスをクリックします。これは、「センター」として選ばれた時点で、RFAをゼロにします。 （0.25ミクロンと2.0ミクロンの間に理想的である）、「ステップサイズ」と表示されたボックスで、層の厚さを選択します。 「ファイルサイズ」ボックスに注意を払い、1ギガバイトに制限しよう。
注：典型的には、0.5の最大40光学切片 - 1.0μm以下が得られるが、セクションの数は、経験的に決定することができます。 - 画像の上部極端を見つけるには、次の「トップ」に丸をクリックして、zの層を通って移動します。今すぐ次の「下」に丸をクリックして、コンピュータはセンターバックとして層に画像を撮影します。再度、画像の下極端を見つけるために、層を通って移動します。
- レーザーを停止するには、「取得設定」ボックスに再び「ライブ」をクリックします。取得。このパネルでは、平均およびZスタックをラベルされた赤のボックスをクリックします。これらのボックスは緑色に変わります。
- 「取得設定」ボックスで、画像のシリーズ全体を取得するために「シングル」をクリックします。それは両方のチャネルで、全体のzスタックを走査のように進行状況を監視することができます。
- 、保存ボリュームウィンドウをクリックし、クリックして「名前を付けて保存」で、ファイルに名前を付けます。 「.ids」ファイルとして保存します。 zスタックがまだ開いている間のボリュームにファイルをレンダリングし、メニューをプルダウンして「ボリュームレンダリング」をクリックしてデータを選択します。 TIFFファイルとしてレンダリングされたファイルを保存します。これは、このマニュアルに示されている投影された画像です。
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Representative Results
ホスホ-エピトープを可視化するための最適な条件
ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質エピトープの免疫学的局在を記述する方法は、in situハイブリダイゼーションを介してmRNAをローカライズするためのものに比べて比較的疎でした。ゼブラフィッシュ胚の繊毛細胞におけるタンパク質のエピトープを局在化に使用される固定剤は、メタノールとDMSOの混合物である、4％PFA / PBSとデントの固定液が含まれている。RNAの19ローカライズ全体in situハイブリダイゼーション （WISH） に取り付けることによって、典型的にはPFAを用いて達成されます100％メタノールでストレージが続く。20,21我々の研究は、WISH固定剤の組み合わせは、2〜7日後にメタノール中で時間を制限するとき、P-のCaMK-II抗体を用いた免疫学的局在のための任意の他の固定液に非常に優れていたことを明らかにしました。このPFA /メタノールの組み合わせで達成信号があったALSOデントの固定液、4％PFA / PBSまたはメタノールが胚内の発達の時間と場所に応じて、単独で用いた場合よりも著しく大きいです。
ここに使用される各固定及び発達時間に記載の技術を最適化する場合、対照試料は、一次抗体を省略したことを除いて、ここですべての手順に従った調製しました。上記と同じ条件の下で撮像されたときに、このような対照サンプルは、蛍光シグナルを欠いていました。この制御は、任意の抗体を用いて、このアプローチを複製する他の研究者のために推奨されます。
PFA /メタノール固定剤の組み合わせは最強のP-のCaMK-II信号が得られ、また、繊毛のための標準的なマーカーであるアセチル化チューブリンに対する免疫染色と互換性がありました。発達、出て、これらの研究で撮影された最初の繊毛器官はクッパーの小胞（KV）です。 12体節（15 HPF）ステージ（ 図1）に示すようにKVは脊索の後方端部に配置されています。 KVは一過性器官であると左右非対称性の原因です。これは、2体節期（12 HPF）で出て、18体節期の周りに表示されなくなります。拍動の一次繊毛はKVと別々の場所でのCaMK-IIの活性化（ 図1）を裏打ちする繊毛細胞におけるCa 2+の上昇につながる流体の円形の流れを生成します。 P-のCaMK-IIの反応性は、全体の胚のCaMK-IIレベルはまだ半分しか24 HPF時点のレベルとレベルの10分の1である表示され、この初期の段階であれば、繊毛が暴行される。12 KVの一方の側に消えます合計のCaMK-IIの発現は15 HPFでは比較的低いため、開発の3日目。11おそらく 、この段階で免疫染色技術における任意の改善が特に重要です。
Betwe開発の24および72 HPFエン、P-のCaMK-IIは、前腎管の特定の領域（ 図2,3）を裏打ちする繊毛細胞の頂端表面上に表示されます。全体の前腎管に沿って、隣接する体節（ 図2）を通じて合計のCaMK-IIの免疫反応性は、胚のCaMK-IIのサブセットのみが（P-のCaMK-II）が活性化されることを示しています。
固定条件は、GFP蛍光の保存に対応しています
これらの固定技術もまた増強することなく（ 図3）緑色蛍光タンパク質（GFP）蛍光を保持すると互換性があります。この図で使用されているGFPタグ付きのCaMK-IIの構築物では、GFPは、PFA /メタノール固定とその後の免疫染色かかわらず、十分な蛍光を保持します。前腎 管の内側を覆う細胞の高倍率ビューで（ 図3）、第GFP-のCaMK-IIの電子モザイク発現はまた、P-のCaMK-IIについて免疫染色された細胞で見ることができます。
ゼブラフィッシュ胚の耳は、Ca 2+の上昇は、のCaMK-IIを介して作用する、その開発に影響する他の組織である。14ゼブラフィッシュの耳は通常、開発の約1日で表示されます。このとき、のCaMK-IIは激しくkinociliaの基部にと運動毛（ 図4）に沿って、より低いレベルで活性化されます。画像のこのセットは、この固定および免疫局在技術は繊毛、その断面が1ミクロン未満である構造内の染色を検出することができることを示しています。これらの繊毛は、この固定および免疫染色プロセスを通してそれらの構造を保持しています。
開発の後の時点で、内耳にある2色の対比のさらなる例は、アレクサ488の両方で染色することにより達成されましたアレクサ568に続いてファロイジンおよび抗アセチル化チューブリンは（ 図5）二次抗体をタグ付けしました。すべての固定剤の真のされていない、PFA /メタノールの固定方法は、F-アクチンとチューブリンの両方を保存することは注目に値します。この例では、全体の耳のためのマージされたカラー画像のように、サブ領域について示されている。14
二色対比の最後の代表的な例は、膜標的化GFP（ 図6）を有する胚を作製魚の株で達成されました。膜標的とGFPは、任意の他のタンパク質に結合していないため、この画像が単独でPFAで固定した魚から得た、メタノールで抽出したときに失われます。この結果は、メタノール処理は、膜を抽出することを示唆しているので、それは排他的に膜に結合することができるタンパク質にはお勧めできません。この図ではP-のCaMK-II信号がメタン場合達成されたものと比較して減少しますOLも使用したが、これは胚のこの段階および位置（腎臓）に、信号はメタノール処理なしで検出されるのに十分に強いことを示しています。つまり、KVの段階では真ではありません;。 すなわち 、メタノールは、P-のCaMK-IIの免疫染色を可視化するために必要とされます。この例では、唯一の腎臓の前腎管がトランク筋肉に隣接しているマージされた画像として表示されます。
要約すると、ここで説明したPFA /メタノール固定方法は、GFPの保存とし、F-アクチンに対する染色、アセチル化チューブリン、合計のCaMK-IIおよびP-のCaMK-IIと互換性があります。
ゼブラフィッシュKVにおけるアセチル化チューブリン（繊毛） については、図1。P-のCaMK-II対比。単一生12体節期のビュー（12 ssは）胚は、ARによってKVの後方位置を明らかにしましたrowhead（側面図、A）およびボックス内のサークル（腹ビュー、B）。この段階での胚PFA /メタノールを用いて固定しました。胚は、アレクサ488 -標識二次抗体（グリーンチャンネル）に続いてアセチル化チューブリンのために免疫染色しました。次に、P-のCaMK-IIに対するウサギポリクローナル抗体は、アレクサ568-標識二次抗体（赤色チャンネル）が続きました。次第に高い倍率（C、D）に記載のように2チャネル蛍光画像投影を取得しました。 =10μmのスケールバー。この図は、以前の出版物から変更されている。12 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。P- のCaMK-II対比のためにゼブラフィッシュ腎臓に沿って合計のCaMK-II。30 HPFで単一のdechorionated胚がPFA /メタノールを用いて固定しました。胚は、その後のAlexa 488標識二次抗体（緑）に続いて合計のCaMK-IIのために染色しました。次に、P-のCaMK-II一次抗体は、アレクサ568標識二次抗体（赤色）が続きました。染色は、合計のCaMK-IIは、隣接する筋肉組織の体節界およびサルコメア全体に濃縮されているのに対し、前腎ゼブラフィッシュ腎臓の管を裏打ちする細胞の頂端面に沿って（赤）は、活性化のCaMK-IIの濃縮を明らかにする。 =50μmのスケールバー。これらの画像は、腎臓全体を可視化するためにテキストに記載されているよりも低い倍率で取得しました。この図は、以前の出版物から変更されている。13 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3。GFP のためのP-のCaMK-IIカウンター撮像されたゼブラフィッシュ腎臓細胞インチこの30 HPFの胚は、cDNAは、ドミナントネガティブGFP-のCaMK-IIをコードを注射した。13このような注射剤は、通常、モザイク発現を示します。胚はPFA /メタノールを用いて固定した後、アレクサ568標識二次抗体を使用してP-のCaMK-IIに対して免疫染色しました。イメージングは、GFPは、PFA /メタノール固定、再水和、ブロッキングおよび免疫染色を通じて持続することが明らかになりました。 =10μmのスケールバー。この図は、以前の出版物から変更されている。13 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4 アセチル化チューブリンとP-のCaMK-II対比ゼブラフィッシュ内耳インチこの30 HPFの胚は、PFA /メタノールを用いて固定しました。抗アセチル化チューブリン抗体は、アレクサ488標識二次抗体、P-のCaMK-II抗体およびAlexa 568標識二次抗体の順に続きました。染色は、P-のCaMK-IIは、内耳の繊毛に沿って存在し、アセチル化チューブリンとの共局在することを明らかに。スケールバー=5μmです。この図は、以前の出版物から変更されている。14 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ゼブラフィッシュ内耳における 図5。 アクチンおよびアセチル化チューブリン。3日齢（72 HPF）ゼブラフィッシュ胚を固定し、アセチル化トンに対して免疫染色しました。アレクサ568標識二次抗体を用いてubulin、アレクサ488ファロイジンを使用して、アクチンの可視化が続きます。繊毛だけでなく、耳の軸索神経支配は（赤で）アセチル化チューブリンによって明らかにされ、F-アクチンの構造は、（緑色）筋線維が含まれます。ゼブラフィッシュの耳の二つの繊毛の感覚の領域は、より詳細に示されている：前方黄斑（午前）と後部稜（PC）を。 =10μmのスケールバー。この図は、以前の出版物から変更されている。14 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。 ゼブラフィッシュ腎臓内膜GFP については、図 6 のP-のCaMK-IIカウンター撮像された βアクチンれたこのシングル合成画像：CAAX-GFP胚（30 HPF）が固定され、P-CaMK-のために染色しました。IIは、アレクサ568標識二次抗体が続きます。染色は前腎ゼブラフィッシュ腎臓の管を裏打ちする細胞の頂端面に沿って（赤）は、活性化のCaMK-IIの濃縮を明らかにする。これらの腎臓腺管細胞は、単に筋肉組織の下に囲まれており、両方が（緑色）の膜標的とGFPの発現によってマークされています。スケールバー=50μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
PFA /メタノール法は、ゼブラフィッシュの開発中に、ホスホT 287 -CaMK-IIエピトープの免疫局在を最適化する第一の目的と本研究室で開発されました。このメソッドは、正常にゼブラフィッシュKV、12内耳14と腎臓を含むいくつかの繊毛器官の形成時にP-のCaMK-IIをローカライズ。13、特にKV段階で、この技術が必要でした。この方法の成功は、b）は、リン酸化のCaMK-IIエピトープ及びc）の保存が抗体にエピトープのアクセシビリティを向上し、原因自家蛍光のa）の最小化との組み合わせに起因する可能性が高いです。
このアプローチの主要な制限は、メタノール中の記憶の時間です。 P-のCaMK-IIの免疫反応性は、-20℃でメタノール中で2日後に最大であるが、このエピトープの反応性は、メタノール中で1週間保存後に失われています。なお、この時点でリン酸基がHYであるかどうかは明らかではありませんdrolyzedまたは更なる変性はそれが免疫反応性を低下させるが発生します。 -20℃でメタノール/ EGTAは、初期胚の開発中にチューブリンに富んだ構造を保存するための、伝統的に迅速な固定剤である。22しかし 、メタノール単独は、アクチン細胞骨格として形態、あるいは構造を保存することは望ましくないとによって先行されなければなりませんPFA。
このアプローチのさらなる利点は、それはまた、F-アクチンおよびアセチル化チューブリンなどの他のエピトープを保持し、GFPのネイティブの蛍光を排除しないということです。このようなデントの固定剤などの他の固定剤は、他のエピトープ13とP-のCaMK-II染色はPFA /メタノールよりデントの固定液で弱いですが、P-のCaMK-II染色との互換性を維持するための優れています。リン酸化タンパク質は、初期の開発時にアクティブになっているシグナル伝達経路で流行しているので、デントの固定液とPFA /メタノールは、ZEBの他のリン酸 - エピトープのための2つの固定剤として推奨されていますrafish胚。他のタンパク質とその抗体のためのこの技術を使用してアプリケーションを開発するには、イムノブロット上にも反応性である抗体を持っているし、クローニングし、抗体を検証することが可能なタンパク質を過剰発現しているために参考にされている。12
それはa）は、タンパク質レベルでの遺伝子抑制を確認することができ、およびb）行動のモデルの開発を可能にするため、免疫局在するための技術を最適化するための努力の価値があります。この研究室では、これらのアッセイの結果は、モデルを通じてのCaMK-II機能の製剤を可能にしています。例えば、KV中のその位置は、この器官の役割のように、一時的かつ非対称です。腎臓では、前腎管細胞の頂端側の位置は、ダクトからの信号に応答する役割を示唆しています。最後に、耳kinociliaのベースに特定の激しい涙点におけるこの酵素の活性化は、ローカライズされた Ca 2+シグナルを示唆しています。方法は、ここに記載さまた、二つの蛍光チャネルにおいて任意の胚細胞型の高解像度画像を取得しようとする研究者にとって有用であるべきです。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、国立科学財団の助成金IOS-0817658によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P-7629 | 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water |
| Alexa488 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11008 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Preferentially binds to F-actin |
| Alexa568 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11004 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| Alexa568 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11011 | Goat polyclonal, use at 1:500 |
| anti-acetylated α-tubulin | Sigma | T7451 | Mouse monoclonal, use at 1:500 |
| anti-phospho-T287 CaMK-II | EMD Millipore | 06-881 | Rabbit polyclonal, use at 1:20 |
| anti-total CaMK-II | BD Biosciences | 611292 | Mouse monoclonal, use at 1:20 |
| Ethanol | Fisher | S96857 | Lab grade, 95% denatured |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Glass coverslips | VWR | 16004-330 | #1 thickness |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | Standard glass slides |
| Methanol | Fisher | A411 | Store in freezer |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | capped tubes, not sterile |
| Normal goat serum | Life Technologies | 16210-064 | Aliquot 1 ml tubes, store in freezer |
| Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | Reagent grade, crystalline |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Quality Biological | 119-069-131 | 10x stock solution or made in lab |
| Triton X-100 | Sigma | BP-151 | 10% solution in water, store at RT |
| Tween-20 | Life Technologies | 85113 | 10% solution in water, store at RT |
| Compound microscope | Nikon | E-600 | Mount on vibration-free table |
| C1 Plus two-laser scanning confocal | Nikon | C1 Plus | Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements" |
References
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