Summary
对于纳米结构的脂质载体(NLC)的合成中最常用的方法包括油包水乳化,均质和凝固。这是由凝固后施加高剪切分散,实现与希望的尺寸,提高了药物包封和药物负载效率为达卡巴嗪传递一个潜在的载体NLC在这里进行修改。
Abstract
在临床使用达卡巴嗪(DAC)的唯一配方是静脉内输注,呈现较差治疗特性由于在水溶液中药物的低分散度。为了克服这个,包括棕榈酸甘油酯和异丙基肉豆蔻酸酯的纳米结构的脂质载体(NLC)的开发,以封装DAC。具有受控尺寸联络委员会采用以下油包水乳状液的凝固的高剪切分散(HSD)来实现的。合成参数,包括表面活性剂浓度,速度和HSD的时间进行了优化,以实现与尺寸,多分散指数为155±10nm的ζ电位最小NLC,0.2±0.01,和-43.4±2毫伏,分别。最佳工艺参数也用于DAC加载NLC的准备。装有DAC所得NLC分别具有尺寸,多分散指数为190±10nm的ζ电位,0.2±0.01,和-43.5±1.2毫伏。该药物包封EFFICIENCY和载药量分别达到98%和14%。这是使用NLC的DAC封装的第一份报告,这意味着NLC可能是一个新的潜在的候选者作为药物载体,以提高DAC的治疗特性。
Introduction
达卡巴嗪(DAC)是施加通过核酸甲基化或直接DNA损伤的抗肿瘤活性,从 而导致细胞周期停滞和细胞死亡1烷化剂。
作为第一线化疗剂,DAC已单独或与其它化疗药物用于治疗各种癌症2-6组合使用。它是用于治疗皮肤和转移性黑色素瘤,这是皮肤癌3,7,8的最积极的形式迄今使用的最活性剂。的响应速度,但是,只有20%在最好的,并且治疗效果往往伴随着严重的全身性副作用。
在其天然形式中,DAC是亲水性的并且是不稳定的,由于其光敏性9。临床使用的唯一可用的式目前是在悬浮液用于静脉内输注7,8所用的无菌粉末。低响应速度和高的全身毒性ř吃的药物,主要是由于其水溶性较差,因此低可用性目标在现场,和高配的非靶部位,从而限制了药物10的最大剂量。静脉入院耐药性的发展一起后快速降解和代谢限制临床应用和药物11的治疗效果。因此,迫切需要开发替代DAC制剂用于治疗恶性黑色素瘤。
含有脂质体的胶体体系,胶束或纳米颗粒已经集中研究了其在药物递送中使用如由Marilene 等人 12纳米粒子作为潜在药物载体已被吸引在过去十年中越来越多的关注,因为它们增加载药量的能力审查效率,控制药物释放,提高药物的药代动力学和生物分布,并由此计算的r-得出药全身毒性13。只有少数nanoformulations然而,迄今已对DAC递送研究,表示从相片变性药,增加药物溶解度的保护,以及改进的治疗效果10,14,15。然而,这些制剂有些还使用的是不符合成本效益的合成聚合物的纳米颗粒封装低效率受到影响。
纳米结构的脂质载体(NLC)由固体和液体脂质的混合物,已经开发了用于药物递送16,17。待包封的药物通常可溶于所述液体脂质和固体脂质相18,导致高的负荷和控制释放19。本研究旨在开发基于使用棕榈酸甘油酯和肉豆蔻酸异丙酯脂类NLC封装一个新的DAC配方。制备涉及油包水乳液,蒸发,凝固,和homogenizatioñ。该制剂已被表征为NLC尺寸,形状,超微结构,和分散度,药物包封率和药物负载20。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.油包水乳液的制备
- 称重硬脂酸棕榈酸甘油酯(120毫克),肉豆蔻酸异丙酯(60毫克)中,d-α生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(30毫克)和大豆卵磷脂(30毫克),并把它们添加到12.5毫升有机溶剂(6.25毫升丙酮和6.25毫升乙醇)。在该温度70℃(5℃固体脂质的熔点以上)的水浴迅速溶解该混合物。
- 添加任一125,250或375毫克泊洛沙姆188的在12.5 DDH 2 O的毫升实现泊洛沙姆188溶液,这是受在与上述相同的温度下加热(分别)1-3%。
- 从步骤1.2至来自步骤1.1的溶液的油相溶液中添加水相溶液在400rpm以形成磁力搅拌下乳剂。搅拌该乳液以400rpm再进行4小时,使有机溶剂蒸发。
2.固化和同质化
- 离开ŧ他乳剂在冷室(4℃)2小时,以固化/结晶。
- 为了获得NLC,若使乳液纯粹的高分散(HSD)用一均在10,000-15,000转10-40分钟。
3. NLC制备优化
- 采取从步骤2.2样品在10000 15000和20000转的速度1,2和3%经受HSD的表面活性剂浓度,分别为10,20,30和40分钟的时间间隔,分别
- 检查粒度(PS),聚分散指数(PDI),形态和超微结构20的样品。
注:产生具有最小尺寸(155纳米)和PDI(0.2)值的颗粒被确定为最佳参数。
4.准备DAC加载NLC的(NLC-DAC)
- 如在水浴将混合物在70℃溶解之前加入DAC(70毫克)的在步骤1.1中所述制备的油相溶液。
- P如在步骤1.2和1%的表面活性剂描述repare水相溶液,并加入该溶液至该准备在步骤4.1中滴加在400rpm以形成磁力搅拌下的乳液。搅拌另外4小时,该乳液以蒸发有机溶剂。
- 离开该乳液在冷室(4℃)2小时,以固化/如在步骤2中所述结晶,最后,若使乳液使用在步骤3中确定的最佳参数高剪切分散(HSD)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
国家图书馆和国家图书馆-DAC采用棕榈酸甘油酯和肉豆蔻酸异丙酯使用不同的参数的筹备工作特点是PS,PDI,形态和超微结构20。各国联络委员会的PS和PDI分别为表面活性剂浓度,HSD速度和持续时间有关。作为判断PS和联络委员会的PDI,最好的结果是用表面活性剂的1%和15,000rpm的30分钟( 图1A,B和C)一种纯粹的分散速度,因此这wwew选定为NLC最佳参数来实现准备在这项研究中。
图1.在NLC制备中使用的参数优化。HSD的最佳表面活性剂浓度和速度和时间根据其在PS和PDI效果进行了测定。 ( PS(B)的影响; HSD速度和时间的(C)对PDI。这个数字已经从20修改。的3个重复±标准差的数据表示为平均值(平均值±SD)。
最佳参数用于NLC-DAC准备。取得的最小尺寸是NLC( 图2A)150±10纳米和190为NLC-DAC( 图2B)±10纳米,都为0.2±0.001 PDI,这表明了良好的均匀性。
图2. DLS NLC的测量 ( 一 )普通NLC的最佳大小分布。 (B)NLC-DAC的最佳尺寸分布。
图3)。
图3. NLC NLC和-DAC,两个NLC NLC和-DAC 的TEM成像呈球形。 (A)的基本NLC结构包括表面活性剂层(实心黑色箭头),液体脂质基质(白色实线箭头),和固体脂质晶体(虚线白箭头); (B)NLC-DAC还展出了其基本结构为NLC观察,但表面活性剂层,液体脂类基质和固体脂质结晶出现扩大;一个额外的子结构可以看出的固体脂质晶体(由虚线的黑色箭头指示),指示载药的内部。酒吧规模:50纳米,放大率:55,000X。这个数字已经从20修改。
“1”> DAC的NLC的上传和封装由大小和结构的变化表示为在图2和3可见,其中NLC-DAC示出了更大的尺寸和与NLC相比改变内部结构。 NLC的基本结构包括一表面活性剂层,液体脂质基质和固体脂质晶体( 图3A)。 NLC-DAC也表现出的基本结构作为一个NLC但具有扩展表面活性剂层,液体脂质基质和固体脂质的结晶,用固体脂质晶体( 图3B),表明药量和封装内的额外子在一起。在NLC看到的固体脂质结晶出现比NLC-DAC致密,这表明该固体类脂是在NLC-DAC更少结晶。
药物包封率(EF)和载药(DL)百分比由下列公式得出:
“FO:保together.within页=”1“> EE%= W 1 - W 2 / W 1×100 = 98.5%DL%= W 1 - W 2 / W 3×100 = 14%
凡在NLC增加DAC W的量1,W 2量未包埋的DAC,W增加20 3量脂质。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
基于脂质的纳米颗粒已被用于递送疏水性药物提供高度亲脂性载体。一个NLC是第二代固体脂质纳米结构载体,其在室温和体温固体。固体脂质掺入在NLC结果的液体脂质中一个不太完美结晶,从而增加了药物装载效率和也减少储存期间包封药物的驱逐。
为NLC合成中,最常用的方法包括油包水乳化,均质和固化/结晶21,22。均质化可以联络委员会到在水相中完全分散,同时在低温下的固化允许内油相结晶。不同均化的方法已被报道,包括磁力搅拌,超声,和HSD之前和/或固化23,24期间使用
在这项研究中,通常使用的方法最初是遵循NLC制备。其结果是不能令人满意的,该方法被修改,使得HSD被固化之后施加。该变形例证明在粒子产生,PS和PDI的控制非常有效,同时也使得NLC合成简单,与使用相同的脂质23,25上NLC制备以前的报告进行比较。值得指出的是,蒸发(协议1.3)和凝固(协议2.1)的长度是非常关键的过长或过短的时间内将会对NLC的产生负面影响。
这项研究表明,NLC的粒子和它们聚集在凝固过程中形成的。在HSD可能扰乱的聚集,这是可能是由于联络委员会之间的疏水相互作用,并且还通过用表面活性剂充分再混合这些稳定的颗粒。合成过程进行了优化,这种T帽子的NLC和NLC-DAC被生产具有尺寸155±10纳米和190±10纳米,分别为0.2±0.01的PDI。用颗粒尺寸和小PDI值的均匀性的高级别表示充分的分散的能量达到和颗粒聚集体的破坏的溶液内分布均匀。它已被认为纳米不容易100-200颗粒由非靶细胞,包括单核巨噬细胞系统摄取,因此在体内具有26,27长的血液循环时间,而超过0.5的PDI是一个指示粒子聚集28;的PDI值越低,颗粒29之间的尺寸均匀性越高。在HSD的速度和时间超过最佳点的进一步增加,可能会导致进一步的PS减少,并因此增加了小颗粒,以及再聚集之间的相互作用。在国家图书馆和N之间的大小和结构上的差异LC-DAC表明,DAC装载和封装是成功的。该药物结合到NLC的外层和封装内的脂质基质提供延长药物释放的可能性,可能会从外层首先涉及药物释放,随后从液体脂类基质的释放,然后从固体脂质晶体的NLC 30。
目前,有四名nanoformulations已尝试递送DAC的作为单一药剂。报告的最新配方是专为DAC的决斗封装和维生素A 32。然而这些制剂从低包封率和/或相对复杂的合成方法遭遇。这是一个NLC DAC封装的第一份报告,证实了此前报道的其他封装有利。 NLC-DAC很容易使,并提出更高的药物包封和药物装载效率20。该NLC-DAC显示,近50%药物的第2小时内释放,而其余的缓慢释放长达30小时20。早期的版本可能是由于与NLC表面上表面层中的药物的结合,表明这一提法可能不是很理想,以取代目前的制定在临床上使用。然而,在NLC-DAC将药物与此前10日报道,纳米乳相比,出现了较稳定。此外,基于脂质的车辆已经提出了用于通过局部药物递送32,10治疗皮肤黑素瘤和表皮样癌,表明在本研究中开发的NLC-DAC也可以用于局部应用潜在有益,其中早期药物释放不会潜在地导致严重的全身毒性。
由于迄今研制出可用的药物传递载体集体局限性,还需要进一步研究,制定DAC传递更先进的纳米材料进行有针对性的癌症治疗。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者承认为使研究成为可能沙特资助的奖学金(I821)。作者感谢显威刘博士在克兰菲尔德大学的TEM分析专家的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dacarbazine (DAC) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | D2390-100MG | drug used for uploading |
glyceryl palmitostearate | Gattefossé (Saint_Priest_cédex, France) | 85251-77-0 | solid lipid |
d-α- Tocopherol polyethylene glycol succinate (TPGS) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 57668 | lipid phase surfactant |
Poloxamer 188 | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 15759-1KG | liqiud phase surfactant |
Acetone | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 650501-1L | organic solvent |
Ethanol | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 459836-1L | organic solvent |
Soybean lecithin (SL) | Cuisine Innovation (Dijon, France) | SLL1402 | lipid phase surfactant |
Double-distilled water was collected in our laboratory from | Millipore-Q Gradient A10 ultra-pure water system (Millipore, France) | SAS - 67120 | aqueous phase |
T 25 digital ULTRA-TURRAX | IKA | 3725000 | as high shear disperser |
Hotplate Magnetic Stirrer | Scientific Support, Inc | 1454 | emulsion homogenization |
References
- Loo, T. L., Housholder, G. E., Gerulath, A. H., Saunders, P. H., Farquhar, D. Mechanism of action and pharmacology studies with DTIC (NSC 45388). Cancer Treat Rep. 60 (2), 149-152 (1976).
- Behringer, K., et al. Omission of dacarbazine or bleomycin, or both, from the ABVD regimen in treatment of early-stage favourable Hodgkin's lymphoma (GHSG HD13): An open-label, randomised, non-inferiority trial. The Lancet. 385 (9976), 1418-1427 (2014).
- Carvajal, R. D., et al. A phase 2 randomised study of ramucirumab (IMC-1121B) with or without dacarbazine in patients with metastatic melanoma. Eur J Cancer. 50 (12), 2099-2107 (2014).
- Jiang, G., Li, R., Sun, C., Liu, Y., Zheng, J. Dacarbazine combined targeted therapy versus dacarbazine alone in patients with malignant melanoma: A meta-analysis. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Lazar, V., et al. Sorafenib plus dacarbazine in solid tumors: A phase i study with dynamic contrast-enhanced ultrasonography and genomic analysis of sequential tumor biopsy samples. Invest New Drugs. 32 (2), 312-322 (2014).
- Niemeijer, N. D., Alblas, G., Van Hulsteijn, L. T., Dekkers, O. M., Corssmit, E. P. M. Chemotherapy with cyclophosphamide, vincristine and dacarbazine for malignant paraganglioma and pheochromocytoma: Systematic review and meta-analysis. Clin Endocrinol (Oxf). 81 (5), 642-651 (2014).
- Bedikian, A. Y., Garbe, C., Conry, R., Lebbe, C., Grob, J. J. Dacarbazine with or without oblimersen (a Bcl-2 antisense oligonucleotide) in chemotherapy-naive patients with advanced melanoma and low-normal serum lactate dehydrogenase: 'The AGENDA trial'. Melanoma Res. 24 (3), 237-243 (2014).
- Daponte, A., et al. Phase III randomized study of fotemustine and dacarbazine versus dacarbazine with or without interferon-a in advanced malignant melanoma. J Trans Med. 11 (1), (2013).
- Jiao, J., Rhodes, D. G., Burgess, D. J. Multiple Emulsion Stability: Pressure Balance and Interfacial Film Strength. J Colloid Interface Sci. 250 (2), 444-450 (2002).
- Kakumanu, S., Tagne, J. B., Wilson, T. A., Nicolosi, R. J. A nanoemulsion formulation of dacarbazine reduces tumor size in a xenograft mouse epidermoid carcinoma model compared to dacarbazine suspension. Nanomedicine. 7 (3), 277-283 (2011).
- Xie, T., Nguyen, T., Hupe, M., Wei, M. L. Multidrug resistance decreases with mutations of melanosomal regulatory genes. Cancer Res. 69 (3), 992-999 (2009).
- Estanqueiro, M., Amaral, M. H., Conceição, J., Lobo, J. M. S. Nanotechnological carriers for cancer chemotherapy: the state of the art. Colloids Surf., B. 126, 631-648 (2015).
- Koziara, J. M., Whisman, T. R., Tseng, M. T., Mumper, R. J. In-vivo efficacy of novel paclitaxel nanoparticles in paclitaxel-resistant human colorectal tumors. J Controlled Release. 112 (3), 312-319 (2006).
- Ding, B., et al. Biodegradable methoxy poly (ethylene glycol)-poly (lactide) nanoparticles for controlled delivery of dacarbazine: Preparation, characterization and anticancer activity evaluation. Afr J Pharm Pharacol. 5 (11), 1369-1377 (2011).
- Ding, B., et al. Anti-DR5 monoclonal antibody-mediated DTIC-loaded nanoparticles combining chemotherapy and immunotherapy for malignant melanoma: target formulation development and in vitro anticancer activity. Int J Nanomedicine. 6, 1991-2005 (2011).
- Jenning, V., Thünemann, A. F., Gohla, S. H. Characterisation of a novel solid lipid nanoparticle carrier system based on binary mixtures of liquid and solid lipids. Int J Pharm. 199 (2), 167-177 (2000).
- Müller, R. H., Radtke, M., Wissing, S. A. Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs. Int J Pharm. 242 (1-2), 121-128 (2002).
- Pouton, C. W. Lipid formulations for oral administration of drugs: Non-emulsifying, self-emulsifying and 'self-microemulsifying' drug delivery systems. Eur. J. Pharm. Sci. 11 (Suppl. 2), S93-S98 (2000).
- Jores, K., Mehnert, W., Drechsler, M., Bunjes, H., Johann, C., Mäder, K. Investigations on the structure of solid lipid nanoparticles (SLN) and oil-loaded solid lipid nanoparticles by photon correlation spectroscopy, field-flow fractionation and transmission electron microscopy. J Controlled Release. 95 (2), 217-227 (2004).
- Almousallam, M., Zhu, H. Encapsulation of cancer therapeutic agent dacarbazine using nanostructured lipid carrier. Int nano lett. , (2015).
- Ng, W. K., et al. Thymoquinone-loaded nanostructured lipid carrier exhibited cytotoxicity towards breast cancer cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7) and cervical cancer cell lines (HeLa and SiHa). BioMed Research International. , (2015).
- Sun, M., et al. Quercetin-nanostructured lipid carriers: Characteristics and anti-breast cancer activities in vitro. Colloids Surf., B. 113, 15-24 (2014).
- Savla, R., Garbuzenko, O. B., Chen, S., Rodriguez-Rodriguez, L., Minko, T. Tumor-Targeted Responsive Nanoparticle-Based Systems for Magnetic Resonance Imaging and Therapy. Pharm Res. 31 (12), 3487-3502 (2014).
- Chen, Y., et al. Formulation, characterization, and evaluation of in vitro skin permeation and in vivo pharmacodynamics of surface-charged tripterine-loaded nanostructured lipid carriers. Int J Nanomedicine. 7, 3023 (2012).
- Sanna, V., Caria, G., Mariani, A. Effect of lipid nanoparticles containing fatty alcohols having different chain length on the ex vivo skin permeability of Econazole nitrate. Powder Technol. 201 (1), 32-36 (2010).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Adv Drug Deliv Rev. 54 (5), 631-651 (2002).
- Visaria, R. K., et al. Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-a delivery. Mol Cancer Ther. 5 (4), 1014-1020 (2006).
- Tripathi, A., Gupta, R., Saraf, S. A. PLGA nanoparticles of anti tubercular drug: Drug loading and release studies of a water in-soluble drug. Int J PharmTech Res. 2 (3), 2116-2123 (2010).
- Joshi, M., Patravale, V. Nanostructured lipid carrier (NLC) based gel of celecoxib. Int J Pharm. 346 (1-2), 124-132 (2008).
- Lim, W. M., Rajinikanth, P. S., Mallikarjun, C., Kang, Y. B. Formulation and delivery of itraconazole to the brain using a nanolipid carrier system. Int J Nanomedicine. 9 (1), 2117-2126 (2014).
- Bei, D., Zhang, T., Murowchick, J. B., Youan, B. C. Formulation of dacarbazine-loaded cubosomes. Part III. physicochemical characterization. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1243-1249 (2010).
- Lei, M., et al. Dual drug encapsulation in a novel nano-vesicular carrier for the treatment of cutaneous melanoma: Characterization and in vitro/in vivo evaluation. RSC Advances. 5 (26), (2015).