Summary
O método mais vulgarmente utilizado para a síntese transportador lipídico nanoestruturada (NLC) envolve emulsão de óleo-em-água, de homogeneização e de solidificação. Este foi modificado aqui pela aplicação de dispersão de elevado corte, após a solidificação para alcançar um NLC com tamanho desejável, uma melhor encapsulação de drogas e a eficiência de carga de fármaco como um transportador potencial para entrega dacarbazina.
Abstract
A única fórmula de dacarbazina (DAC) em utilização clínica é a infusão intravenosa, que apresenta um perfil terapêutico pobres, devido ao baixo dispersibilidade do fármaco na solução aquosa. Para superar isto, um veículo lipídico nanoestruturada (NLC) consistindo de palmitoestearato de glicerilo e miristato de isopropilo foi desenvolvido para encapsular Dac. NLCs com tamanho controlado foram alcançados usando a dispersão de alto cisalhamento (HSD) na sequência de solidificação da emulsão de óleo-em-água. Os parâmetros de síntese, incluindo a concentração de tensioactivo, a velocidade e tempo de HSD foram optimizados para conseguir o menor NLC com dimensão, o índice de polidispersão e potencial zeta de 155 ± 10 nM, 0,2 ± 0,01, e -43,4 ± 2 mV, respectivamente. Os parâmetros óptimos também foram empregues para a preparação NLC DAC-carregado. A NLC resultante carregado com Dac possuía tamanho, índice de polidispersão e o potencial zeta de 190 ± 10 nm, 0,2 ± 0,01 e -43,5 ± 1,2 mV, respectivamente. O ef encapsulamento de drogaseficiên- e carga de fármaco atingiu 98% e 14%, respectivamente. Este é o primeiro relatório sobre encapsulamento de Dac usando NLC, o que implica que NLC poderia ser um novo candidato potencial como transportadora de drogas para melhorar o perfil terapêutico de Dac.
Introduction
Dacarbazina (CAD) é um agente alquilante que exerce uma actividade anti-tumor através de metilação de ácidos nucleicos ou danos directa de ADN, levando à paragem do ciclo celular e morte celular 1.
Como um primeiro agente quimioterapêutico linha, Dac foi usado sozinho ou em combinação com outras drogas de quimioterapia para o tratamento de vários cancros 2-6. É o agente mais ativo até agora utilizada no tratamento do melanoma cutâneo e metastático, que é a forma mais agressiva de câncer de pele 3,7,8. A taxa de resposta, no entanto, é de apenas 20% no máximo, e os efeitos terapêuticos são muitas vezes acompanhada com graves efeitos secundários sistémicos.
Na sua forma natural, Dac é hidrofílico e é instável devido à sua fotossensibilidade 9. A única fórmula disponíveis para uso clínico, é actualmente um pó estéril para ser utilizado na suspensão para 7,8 infusão intravenosa. A taxa de resposta de baixa e alta toxicidade sistémica rComeram do medicamento é em grande parte atribuível à sua fraca solubilidade em água, por conseguinte, de baixa disponibilidade no local alvo, e uma distribuição elevada nos sítios não-alvo, o que limita a dose máxima do medicamento 10. A rápida degradação e metabolismo após a admissão por via intravenosa juntamente com o desenvolvimento de resistência aos fármacos limita a aplicação clínica e efeito terapêutico do fármaco 11. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver formulações alternativas do CAD para o tratamento de melanoma maligno.
Sistemas coloidais contendo lipossomas, micelas ou partículas nanoestruturados têm sido intensamente investigado por seu uso na entrega da droga como revisto por Marilene et al. 12 partículas nanoestruturados como portadores potenciais da droga têm atraído cada vez mais atenção na última década devido à sua capacidade de aumentar a carga de droga eficiência, liberação de drogas de controle, melhorar a farmacocinética e biodistribuição e, portanto, reduce droga toxicidade sistêmica 13. Apenas alguns nanoformulações, no entanto, têm sido investigados até agora para entrega Dac, que mostra a protecção da droga a partir de degeneração foto, o aumento da solubilidade do fármaco, melhorado e efeito terapêutico 10,14,15. No entanto, estas formulações sofreram de baixa eficiência de encapsulação enquanto alguns também usando nanopartículas de polímeros sintéticos que não são rentáveis.
Transportadores lipídicos nanoestruturados (NLC), constituídos por uma mistura de lípidos sólidas e líquidas, têm sido desenvolvidos para entrega de drogas 16,17. Os medicamentos a serem encapsuladas são muitas vezes solúveis em ambos os lípidos líquidos e lípidos fases sólidas 18, resultando numa carga elevada e de libertação controlada 19. Este estudo tem como objetivo desenvolver uma nova formulação Dac baseado em NLC-encapsulamento usando palmitoestearato glicerilo e miristato de isopropilo como lipídios. A preparação envolvidos óleo-em-água, a evaporação, a solidificação, e homogenization. As preparações foram caracterizadas para o tamanho do NLC, forma, ultra-estrutura, e da distribuição, eficiência de encapsulação de drogas e de carga de droga 20.
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Protocol
1. Preparação de emulsão de óleo-em-água
- Pesar palmitoestearato de glicerilo (120 mg), miristato de isopropilo (60 mg), d-α-tocoferol succinato de polietileno-glicol (30 mg) e a lecitina de soja (30 mg), e adicione-os a 12,5 ml de solventes orgânicos (6,25 ml de acetona e 6,25 ml de etanol). dissolvem-se rapidamente a mistura à temperatura de 70 ° C (5 ° C acima do ponto de fusão do lípido sólido) em banho de água.
- Adicionar tanto 125, 250 ou 375 mg de Poloxamer188 em 12,5 ml de ddH2O para atingir 1-3% (respectivamente) de solução de Poloxâmero 188, o qual é sujeito a aquecimento à mesma temperatura como acima.
- Adicionar a solução da fase aquosa do passo 1.2 para a solução de fase oleosa do passo 1.1, gota a gota, para formar emulsões, sob agitação magnética a 400 rpm. Agita-se a emulsão a 400 rpm durante mais 4 h, para permitir a evaporação dos solventes orgânicos.
2. Solidificação e homogeneização
- deixar tele emulsão numa sala fria (4 ° C) durante 2 horas para solidificar / cristalizar.
- Para obter o NLC, submeter a emulsão de alta dispersão pura (HSD) com um homogeneizador a 10.000-15.000 rpm para 10-40 min.
3. Optimização da Preparação NLC
- Retirar amostras a partir do passo 2.2 com uma concentração de surfactante de 1, 2 e 3% HSD submetido a uma velocidade de 10.000, 15.000 e 20.000 rpm, respectivamente, e intervalos de tempo de 10, 20, 30 e 40 min, respectivamente,
- Examinar as amostras para o tamanho de partículas (PS), poli índice de dispersão (PDI), morfologia e ultra-estrutura 20.
Nota: Os parâmetros que produzem partículas com o menor tamanho (155 nm) e o valor PDI (0,2) são determinadas como ideal.
4. Preparação de NLC Dac-carregado (NLC-Dac)
- Preparar a solução de fase oleosa, tal como descrito na etapa 1.1, com a adição da DAC (70 mg) antes de se dissolver a mistura a 70 ° C em banho de água.
- Prepare uma solução de fase aquosa, tal como descrito na etapa 1.2, com 1% de tensioactivo, e adicionar esta solução ao preparado no passo 4.1, gota a gota, para formar uma emulsão sob agitação magnética a 400 rpm. Agita-se a emulsão durante mais 4 horas para evaporar os solventes orgânicos.
- Deixar a emulsão numa sala fria (4 ° C) durante 2 horas para solidificar / cristalizar, tal como descrito no passo 2, e finalmente, sujeitar a emulsão de alta dispersão pura (HSD), utilizando os parâmetros óptimos determinados no passo 3.
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Representative Results
As preparações da NLC e NLC-Dac usando palmitoestearato glicerilo e miristato de isopropilo com diferentes parâmetros foram caracterizados por PS, PDI, morfologia e ultra-estrutura 20. O PS e PDI dos NLCs foram concentração de surfactante, velocidade HSD e dependente duração. Tal como avaliado pelo PS e PDI dos NLCs, os melhores resultados foram alcançados com 1% de agente tensioactivo e uma velocidade de dispersão pura de 15.000 rpm durante 30 min (Figura 1A, B e C), o que, por conseguinte, wwew seleccionado como os parâmetros óptimos para o NLC preparação neste estudo.
Figura 1. Otimização de parâmetros usados na preparação NLC. A concentração óptima de surfactante e a velocidade eo tempo de HSD foram determinados de acordo com o seu efeito sobre PS e PDI. (
Os parâmetros ideais foram utilizados para a preparação NLC-Dac. O menor tamanho alcançado foi de 150 ± 10 nm para NLC (Figura 2A) e 190 ± 10 nm para NLC-Dac (Figura 2B), ambos com PDI de 0,2 ± 0,001, indicando uma boa uniformidade.
Figura 2. DLS medição da NLC (A) A distribuição do tamanho ótimo de NLC simples.; (B) a distribuição de tamanho ótimo de NLC-Dac.
(Figura 3).
Figura 3. TEM imagem de NLC e NLC-Dac. Ambos NLC e NLC-Dac mostrou uma forma esférica. (A) de base NLC estrutura compreende uma camada de tensioactivo (seta preta sólida), matriz de lípido líquido (seta sólido branco), e cristais de lípidos sólidos (setas brancas pontilhadas); (B) NLC-Dac também exibiram a estrutura de base, como visto na NLC mas os cristais da camada de surfactante, matriz de lípido líquido e lipídicas sólidas apareceu expandida; uma sub-estrutura adicional pode ser visto no interior dos cristais sólidos de lípidos (indicadas por setas pretas a tracejado), indicativos da carga de fármaco. barra de escala: 50 nm, Ampliação: 55,000X. Esta figura foi modificada a partir de 20.
"1"> O carregamento e encapsulamento de Dac em NLC é indicado pelo tamanho e estrutura mudanças como visto nas Figuras 2 e 3, onde NLC-Dac mostra um tamanho maior e alterou estruturas internas, em comparação com o NLC. A estrutura básica de NLC compreende uma camada de tensioactivo, uma matriz de lípido líquido e cristais lipídicas sólidas (Figura 3A). NLC-Dac também exibiram a estrutura de base como um NLC mas com camada de surfactante expandido, matriz de lípido líquido e cristais de lípidos sólidas, em conjunto com uma subestrutura adicional no interior dos cristais sólidos de lípidos (Figura 3B), indicativos da carga de fármaco e de encapsulamento. Os cristais de lípidos sólidos observados em NLC apareceu mais denso do que em NLC-Dac, indicando que o lípido sólido é cristalizado em menos NLC-Dac.
A eficiência de encapsulação da droga (EF) e percentagem de carga de fármaco (DL) foram derivados a partir das seguintes equações:
"Fo: manter-together.within-page =" 1 "> EE% = W 1 - W 2 / W 1 x 100 = 98,5%DL% = W 1 - W 2 / W 3 x 100 = 14%
onde W 1 quantidade de Dac adicionado na NLC, W 2 quantidade de aprisionado-un Dac, W 3 quantidade de lípidos adicionados 20.
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Discussion
nanoestruturados partículas à base de lípidos têm sido utilizados para proporcionar um suporte altamente lipófilo para a entrega de fármacos hidrofóbicos. Um NLC é a segunda geração de transportador nanoestruturada lipídicas sólidas, que são sólidos à temperatura ambiente e corporal. A incorporação de um lípido sólido num lípido líquido num resultados NLC em uma cristalização menos perfeita, aumentando assim a eficiência de carga de droga e também reduzindo a expulsão de fármacos encapsulados durante o armazenamento.
Para a síntese NLC, o método mais vulgarmente utilizado envolve óleo-em-água, a homogeneização e a solidificação / cristalização 21,22. A homogeneização permite NLCs para dispersar bem numa fase aquosa, enquanto que a solidificação a baixa temperatura permite que a fase interior de óleo a cristalizar. Métodos de homogeneização diferentes têm sido relatadas incluindo agitação magnética, ultra-som, e HSD que são utilizados antes e / ou durante a solidificação 23,24
Neste estudo, o método vulgarmente utilizado foi inicialmente seguido para a preparação NLC. Como um resultado negativo, o método foi modificado de tal modo que HSD foi aplicado após a solidificação. Esta modificação mostrou altamente eficaz na geração de partículas, PS e PDI controle, ao mesmo tempo, fazer a síntese NLC mais simples, em comparação com relatórios anteriores sobre a preparação NLC usando os mesmos lipídios 23,25. Foi interessante notar que o comprimento da evaporação (protocolo 1.3) e solidificação (protocolo 2.1) é muito crítico quanto muito longo ou muito curto espaço de tempo teria efeitos negativos sobre a geração de NLC.
Este estudo sugere que partículas NLC e sua agregação foram formados durante a solidificação. O HSD poderia interromper a agregação, que foi possivelmente devido à interação hidrofóbica entre NLCs, e também estabilizar as partículas por remixar-los cuidadosamente com surfactante. O procedimento de síntese foi optimizada tal tchapéu do NLC e NLC-Dac foram produzidos com um tamanho de 155 ± 10 nm e 190 ± 10 nm, respectivamente, e um PDI de 0,2 ± 0,01. O elevado nível de uniformidade, com tamanhos de partículas e os pequenos valores de PDI indica que uma dispersão de energia suficiente foi conseguida e é bem distribuída dentro da solução de perturbações de agregados de partículas. Tem sido sugerido que as partículas de 100-200 nm não são propensas a absorção pelas células não-alvo, incluindo o sistema fagocítico mononuclear, tendo, assim, um longo tempo de circulação no sangue in vivo 26,27, enquanto um PDI de mais de 0,5 é uma indicação de agregados de partículas 28; Quanto menor o valor PDI, maior é a homogeneidade de tamanho entre as partículas 29. Novo aumento da velocidade HSD e hora acima do ponto ideal poderia resultar numa redução adicional PS e, consequentemente, um aumento de interações entre partículas pequenas, bem como re-agregação. A diferença no tamanho e estrutura entre NLC e NLC-Dac sugere que o carregamento e Dac encapsulação foi bem-sucedida. A ligação para a camada exterior do NLC e encapsulação dentro de matrizes lipídicas oferecem o potencial para a libertação do fármaco prolongada de drogas, que pode envolver a libertação do fármaco, em primeiro lugar a partir da camada exterior, seguida pela libertação a partir da matriz de lípido líquido e, em seguida, a partir dos cristais de lípidos sólidas do NLC 30.
Actualmente, existem quatro nanoformulações têm sido tentadas para entrega de DAC como um agente único. A última formulação relatado foi projetado para encapsulamento duelo de Dac e vitamina A 32. No entanto, estas formulações sofria de uma baixa eficiência de encapsulação e / ou procedimentos de síntese relativamente complexas. Este é o primeiro relatório para o encapsulamento de Dac com uma NLC, provando vantajosa em relação a outros encapsulamentos relatados anteriormente. NLC-Dac é fácil de fazer e apresenta maior encapsulamento de drogas e de drogas eficiência de carregamento 20. A NLC-Dac mostrou que quase 50% dosfármaco libertado nas primeiras 2 horas, enquanto os restantes liberada lentamente para até 30 h 20. A rápida libertação pode ser devido à ligação da droga com camada de surfactante na superfície da NLC, indicando que esta formulação pode não ser ideal para substituir a formulação actualmente em utilização clínica. No entanto, a droga em NLC-Dac apareceu mais estável em comparação com o nanoemulsão relatado anteriormente 10. Além disso, os veículos à base de lipidos têm sido propostos para o tratamento de melanoma cutâneo e carcinoma epidermóide através de administração de fármaco tópico 32,10, indicando que o CNT-CAD desenvolvido neste estudo também poderia ser potencialmente benéfico para aplicação tópica em que a libertação do fármaco inicial não seria potencialmente levar a toxicidade sistémica grave.
Devido às limitações coletivas com as operadoras de distribuição de drogas disponíveis desenvolvidos até o momento, é necessária mais investigação para desenvolver nanomateriais mais avançados para entrega Dac para alvejadotratamento do câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem a bolsa Arábia Saudita-financiado (I821) para fazer a pesquisa possível. Os autores agradecem ao Dr Xianwei Liu de apoio especializado em análise de TEM da Universidade de Cranfield.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dacarbazine (DAC) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | D2390-100MG | drug used for uploading |
| glyceryl palmitostearate | Gattefossé (Saint_Priest_cédex, France) | 85251-77-0 | solid lipid |
| d-α- Tocopherol polyethylene glycol succinate (TPGS) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 57668 | lipid phase surfactant |
| Poloxamer 188 | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 15759-1KG | liqiud phase surfactant |
| Acetone | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 650501-1L | organic solvent |
| Ethanol | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 459836-1L | organic solvent |
| Soybean lecithin (SL) | Cuisine Innovation (Dijon, France) | SLL1402 | lipid phase surfactant |
| Double-distilled water was collected in our laboratory from | Millipore-Q Gradient A10 ultra-pure water system (Millipore, France) | SAS - 67120 | aqueous phase |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | IKA | 3725000 | as high shear disperser |
| Hotplate Magnetic Stirrer | Scientific Support, Inc | 1454 | emulsion homogenization |
References
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