Summary
ナノ構造脂質担体（NLC）を合成するための最も一般的に使用される方法は、水中油型エマルジョン、均質化および凝固を含みます。これは、ダカルバジンの送達のための潜在的な担体として薬物封入および薬物積載効率を改善し、望ましいサイズのNLCを達成するために、固化した後、高剪断分散液を塗布することによりここに変更されました。
Abstract
臨床的に使用されているダカルバジン（DAC）の唯一の式が原因で、水溶液中の薬物の低分散性に乏しい治療プロフィールを提示し、静脈内注入です。これを克服するために、パルミトステアリン酸グリセリル及びミリスチン酸イソプロピルからなるナノ構造脂質担体（NLC）はダックをカプセル化するために開発されました。制御されたサイズのNLCsのは、水中油型エマルジョンの凝固以下の高せん断分散（HSD）を用いて達成されました。 HSDの界面活性剤濃度、速度、時間などの合成パラメータは、それぞれ155±10nmで、0.2±0.01、および-43.4±2 mVで、サイズ、多分散指数とゼータ電位と最小NLCを達成するように最適化しました。最適なパラメータは、DAC-ロードNLC調製のために用いました。ダックを搭載した、得られたNLCは190±10nmで、0.2±0.01、それぞれ-43.5±1.2 mVの、の大きさ、多分散指数及びゼータ電位を有していました。薬物封入EFFICIENCYおよび薬物負荷は、それぞれ、98％および14％に達しました。これは、NLCは、DACの治療プロフィールを改善するために、薬物担体としての新たな潜在的な候補であり得ることを示唆しているNLCを使用して、DACのカプセル化に関する最初の報告です。
Introduction
ダカルバジン（DAC）は、細胞周期の停止および細胞死をもたらす1、核酸のメチル化または直接DNA損傷を介した抗腫瘍活性を発揮するアルキル化剤です。
最初の行の化学療法剤としては、DACは、単独で、または様々な癌2-6を治療するための他の化学療法剤と組み合わせて使用されてきました。それは、これまで皮膚癌3,7,8の最も積極的な形態であり、皮膚および転移性黒色腫の治療に使用される最も活性剤です。応答速度は、しかしながら、せいぜい20％のみであり、治療効果は、多くの場合、重篤な全身性副作用を伴います。
その天然の形態では、DACは親水性であり、原因でその感光9に不安定です。臨床使用のためにのみ利用可能式は、現在、静脈内注入の7,8用サスペンションに使用する無菌の粉末です。低い回答率と高い全身毒性rを薬の食べた薬剤10の最大投与量を制限する、大部分が標的部位で、したがって低可用性、その難水溶性に起因し、非標的部位で高い分布です。薬剤耐性の発生と一緒に静脈内入学後の迅速な分解と代謝が臨床応用と薬剤11の治療効果を制限します。したがって、悪性黒色腫を治療するための代替のDAC製剤を開発することが急務です。
らの潜在的な薬物担体としての12ナノ粒子が10年間で注目を増加集めているによる薬物負荷を増加させる能力にMarileneによってレビューとしてリポソームを含むコロイド系は、ミセルまたはナノ構造粒子が集中的薬物送達におけるそれらの使用のために検討されています効率は、薬物動態及び生体内分布を改善し、薬物放出を制御するため、R薬全身毒性13を引き出します。ほんの数nanoformulationsは、しかしながら、フォト変性、増大した薬物溶解性、及び改善された治療効果10,14,15からの薬物の保護を示すと、DACの送達のためにこれまでに研究されてきました。しかし、いくつかはまた、費用対効果がされていない合成ポリマーナノ粒子を用いながら、低カプセル化効率に苦しんでこれらの製剤。
固体及び液体脂質の混合物からなるナノ構造脂質担体（NLC）は、薬物送達16,17のために開発されています。カプセル化される薬物は、高い負荷が生じるとリリース19を制御し、多くの場合、液体脂質および固形脂質相18の両方に可溶性です。この研究は、パルミトステアリン酸グリセリルや脂質などのミリスチン酸イソプロピルを使用して、NLC-カプセル化に基づいて、新しいDAC製剤を開発することを目的とします。調製関与する水中油型エマルジョン、蒸発、凝固、およびhomogenization個。調製物は、NLCのサイズ、形状、超微細構造、および分散、薬物封入効率および薬物負荷20のために特徴付けられています。
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Protocol
水中油型エマルジョンの調製
- パルミトステアリン酸グリセリル（120 mg）を、ミリスチン酸イソプロピル（60 mg）を、D-αトコフェロールポリエチレングリコールサクシネート（30 mg）を大豆レシチン（30 mg）を秤量し、有機溶剤の12.5ミリリットル（6.25 mlのアセトンおよび6.25に追加mlのエタノール）。迅速水浴中で温度70°C（固体脂質の融点より5℃）で混合物を溶解します。
- 上記と同じ温度での加熱の対象となるポロクサマー188溶液の百分の1から3（それぞれ）を達成するためのddH 2 Oの12.5ミリリットルでPoloxamer188の125、250または375 mgのいずれかを追加します。
- ステップ1.1からステップ1.2からの油相液に、水相溶液を追加し、400rpmで磁気撹拌しながらエマルジョンを形成するために滴下しました。有機溶媒の蒸発を可能にするためにさらに4時間400rpmでエマルジョンを撹拌しました。
2.凝固および均質化
- トンを残します彼は2時間固化/結晶化するために、低温室（4℃）中のエマルジョン。
- NLCを得るために、10から40分間、10,000〜15,000 rpmでホモジナイザーで高せん断分散（HSD）のエマルションを施します。
NLCの調製3.最適化
- 、それぞれ、それぞれ、10,000 15,000 20,000 RPMの速度でHSDを受けて1、2、3％の界面活性剤濃度、10、20、30及び40分の時間間隔でステップ2.2からのサンプルを取ります
- 粒子サイズ（PS）、ポリ分散指数（PDI）、形態および超微細構造20のためのサンプルを調べます。
注：最小サイズ（155 nm）を有する粒子を生成パラメータとPDI（0.2）値が最適として決定されます。
DAC-ロードNLC（NLC-DAC）の4準備
- 水浴中で70℃で混合物を溶解する前に、DAC（70 mg）を添加して工程1.1に記載のように、油相溶液を調製します。
- P1％の界面活性剤を工程1.2に記載のように水性相溶液をrepare、そして400rpmで磁気撹拌しながらエマルジョンを形成するステップで4.1滴下し、その準備にこの溶液を添加します。有機溶剤を蒸発させるために、さらに4時間エマルションを攪拌します。
- ステップ2で説明したように固化/結晶化、そして最後に、ステップ3で決定された最適なパラメータを使用して高剪断分散（HSD）にエマルジョンを施すこと2時間、低温室（4℃）でエマルジョンを残します。
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Representative Results
異なるパラメータでパルミトステアリン酸グリセリルおよびミリスチン酸イソプロピルを使用して、NLCとNLC-DACの製剤はPS、PDI、形態および超微細構造20について特徴付けました。 PSおよびNLCsののPDIは、界面活性剤濃度、HSD速度と持続時間依存性でした。 PSおよびNLCsののPDIによって判断されるように、最良の結果が1界面活性剤の％、従ってwwew NLCのための最適なパラメータとして選択30分（ 図1A、BおよびC）を15,000rpmの薄手の分散速度で達成されました本研究で準備。
NLC調製に使用されるパラメータの、図1の最適化最適な界面活性剤濃度およびHSDの速度および時間は、PS及びPDIに対するそれらの効果に応じて決定しました。 （
最適なパラメータは、NLC-DACの調製のために使用しました。達成最小サイズは、良好な均一性を示し、0.2±0.001のPDIの両方で、NLC（ 図2A）のために150±10 nmおよびNLC-DAC（ 図2B）のために190±10 nmでした。
NLCの図2. DLS測定 （A）無地NLCの最適なサイズ分布。 （B）NLC-DACの最適なサイズ分布。
図3）の下で観察されるようにキープtogether.withinページ= "1"> NLCの両方とNLC-DACは球形を示しました。
NLCとNLC-DACの図3. TEM画像。NLCとNLC-DACの両方が球形を示しました。 （A）基本NLC構造は、界面活性剤層（黒塗りの矢印）、液体脂質マトリックス（白色実線矢印）、及び固体脂質結晶（点線白矢印）を含みます。 （B）NLC-DACもNLCに見られるように、基本的な構造を示したが、界面活性剤層、液体脂質マトリックスと固体の脂質結晶を拡大登場します。余分な下部構造は、薬物負荷の指標、（点線の黒い矢印で示される）固体脂質結晶の内部を見ることができました。バースケール：50nmで、倍率：55,000X。この図20から変更されています。
"1"> NLCで、DACのアップロード及びカプセル化はNLC-DACはNLCと比較して、より大きなサイズと変更された内部構造を示す図2及び図 3に見られるような大きさおよび構造の変化によって示されます。 NLCの基本構造は、界面活性剤層、液体脂質マトリックスと固体の脂質結晶（ 図3A）を含みます。 NLC-DACも一緒に薬物負荷およびカプセル化を示す固体脂質結晶（ 図3B）、内部の余分な下部構造で、NLCとしてではなく、拡張界面活性剤層、液体脂質マトリックスおよび固体脂質結晶を基本構造を示しました。 NLCに見られる固体脂質結晶、固体脂質NLC-DACが少ない結晶化であることを示す、NLC-DACに比べて密に見えました。
薬物封入効率（EF）および薬物負荷（DL）の割合は、以下の式から導出されました：
「FO：キープtogether.within-ページは= "1">のEE％= W 1 - W 2月1日 ×100 W = 98.5％DLの％= W 1 - W 2 / W 3×100 = 14％
脂質の3量が20を追加したWどこのDAC W 1量は、未捕捉され、DACの2量W、NLCに追加されました。
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Discussion
脂質ベースのナノ構造粒子は、疎水性薬物の送達のための高度に親油性の担体を提供するために利用されてきました。 NLCは、室温と体温で固体である固体脂質ナノ構造担体の第二世代です。あまり完璧な結晶でNLC結果で液体脂質への固体脂質の取り込みは、このような薬物積載効率を高め、また、保存中に封入された薬物の放出を減少させます。
NLC合成のために、最も一般的に使用される方法は、水中油型エマルジ ョン、均質化及び固化/結晶21,22を含みます。低温で凝固が内部油相が結晶化することを可能にしながら均質化は、NLCsの水相中に十分に分散させることができます。別の均質化方法は、前および/ または凝固23,24の間に使用される磁気攪拌、超音波処理、およびHSDなどが報告されています
この研究では、一般的に使用される方法は、最初にNLC調製のために行きました。結果が不十分であったように、この方法は、HSDは、固化後に適用されるように改変しました。また、同じ脂質23,25を使用して、NLC調製に関する以前の報告と比較して、NLC合成シンプルな作りながらこの修正は、粒子生成、PSおよびPDI制御に非常に有効であることが判明しました。それは長すぎるか短すぎる時間はNLCの世代に負の影響を持っていると同じように、蒸発（プロトコル1.3）および凝固（プロトコル2.1）の長さは非常に重要であることは注目に値しました。
この研究は、NLC粒子およびその凝集が、凝固の間に形成されたことを示唆しています。 HSDは、おそらくNLCsの間の疎水性相互作用に起因した凝集を、混乱させる、とも徹底的に界面活性剤とそれらをリミックスすることにより、粒子を安定化させることができます。合成手順は、そのようなTを最適化しました帽子NLCとNLC-DACはサイズ155±10 nmおよび190±10 nmで、それぞれ、0.2±0.01のPDIを用いて製造されました。粒子サイズと小さいPDI値の均一性の高いレベルは、十分な分散エネルギーが達成されてよく、粒子凝集体の破壊のために溶液中に分散されることを示しています。以上0.5のPDIを示すものである一方、従って、インビボ 26,27 の長い血液循環時間を有する、100〜200の粒子は、単核食細胞系を含む非標的細胞による取り込みを受けにくいnmであることが示唆されています粒子凝集28。粒子29間の大きさの均一性が高い、PDI値が低いです。最適点以上のHSD速度と時間のさらなる増加は、さらにPS削減、小さな粒子だけでなく、再凝集の間の相互作用で、結果として増加をもたらす可能性があります。 NLCとNの間の大きさや構造の違いLC-DACは、DACのロードとカプセル化が成功したことを示唆しています。脂質マトリックスの内側、外側NLCの層およびカプセル化に結合する薬剤は、液体脂質マトリックスからの放出が続く外側の層、からまず薬物放出を伴い、次いで固体脂質結晶からの可能性があり、長期の薬物放出の可能性を提供しますNLC 30の。
現在、4 nanoformulationsは、単剤として、DACの送達のために試みられています。報告された最新の製剤は、32決闘のダックのカプセル化とビタミンのために設計されました。しかしながら、これらの配合物は、低いカプセル化効率及び/又は比較的複雑な合成手順に苦しみました。これは、以前に報告された他のカプセル化よりも有利で証明NLCと、DACのカプセル化のための最初の報告です。 NLC-DACは、作成が容易で、より高い薬物カプセル化および薬物負荷効率20を提示します。 NLC-DACはほぼ50％を示しました。最大30時間20ためにゆっくりと放出されたままながら、最初の2時間以内に放出された薬物。初期のリリースでは、この製剤は、現在臨床的に使用されている製剤を交換するのが理想的ではないかもしれないことを示す、NLCの表面に界面活性剤層に薬物の結合によるものである可能性があります。しかしNLC-DACにおける薬物は、以前に10に報告ナノエマルジ ョンと比べて、より安定登場しました。また、脂質ベース車両はNLC-DACは、本研究で開発したことを示すことも、初期の薬物放出は、潜在的につながらない局所適用のための潜在的に有益であり得る、局所薬物送達32,10を介して皮膚黒色腫と扁平上皮癌を治療するために提案されています重度の全身毒性に。
標的化のために起因し、これまでに開発された利用可能な薬物送達担体と集合的制限のため、さらなる研究は、DACの送達のための、より高度なナノ材料を開発するために必要とされます癌治療。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、研究を可能とするためにサウジアラビアの資金による奨学金（I821）を認めます。著者らは、クランフィールド大学のTEM分析の専門家支援のための博士Xianwei劉に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dacarbazine (DAC) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | D2390-100MG | drug used for uploading |
| glyceryl palmitostearate | Gattefossé (Saint_Priest_cédex, France) | 85251-77-0 | solid lipid |
| d-α- Tocopherol polyethylene glycol succinate (TPGS) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 57668 | lipid phase surfactant |
| Poloxamer 188 | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 15759-1KG | liqiud phase surfactant |
| Acetone | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 650501-1L | organic solvent |
| Ethanol | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 459836-1L | organic solvent |
| Soybean lecithin (SL) | Cuisine Innovation (Dijon, France) | SLL1402 | lipid phase surfactant |
| Double-distilled water was collected in our laboratory from | Millipore-Q Gradient A10 ultra-pure water system (Millipore, France) | SAS - 67120 | aqueous phase |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | IKA | 3725000 | as high shear disperser |
| Hotplate Magnetic Stirrer | Scientific Support, Inc | 1454 | emulsion homogenization |
References
- Loo, T. L., Housholder, G. E., Gerulath, A. H., Saunders, P. H., Farquhar, D. Mechanism of action and pharmacology studies with DTIC (NSC 45388). Cancer Treat Rep. 60 (2), 149-152 (1976).
- Behringer, K., et al. Omission of dacarbazine or bleomycin, or both, from the ABVD regimen in treatment of early-stage favourable Hodgkin's lymphoma (GHSG HD13): An open-label, randomised, non-inferiority trial. The Lancet. 385 (9976), 1418-1427 (2014).
- Carvajal, R. D., et al. A phase 2 randomised study of ramucirumab (IMC-1121B) with or without dacarbazine in patients with metastatic melanoma. Eur J Cancer. 50 (12), 2099-2107 (2014).
- Jiang, G., Li, R., Sun, C., Liu, Y., Zheng, J. Dacarbazine combined targeted therapy versus dacarbazine alone in patients with malignant melanoma: A meta-analysis. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Lazar, V., et al. Sorafenib plus dacarbazine in solid tumors: A phase i study with dynamic contrast-enhanced ultrasonography and genomic analysis of sequential tumor biopsy samples. Invest New Drugs. 32 (2), 312-322 (2014).
- Niemeijer, N. D., Alblas, G., Van Hulsteijn, L. T., Dekkers, O. M., Corssmit, E. P. M. Chemotherapy with cyclophosphamide, vincristine and dacarbazine for malignant paraganglioma and pheochromocytoma: Systematic review and meta-analysis. Clin Endocrinol (Oxf). 81 (5), 642-651 (2014).
- Bedikian, A. Y., Garbe, C., Conry, R., Lebbe, C., Grob, J. J. Dacarbazine with or without oblimersen (a Bcl-2 antisense oligonucleotide) in chemotherapy-naive patients with advanced melanoma and low-normal serum lactate dehydrogenase: 'The AGENDA trial'. Melanoma Res. 24 (3), 237-243 (2014).
- Daponte, A., et al. Phase III randomized study of fotemustine and dacarbazine versus dacarbazine with or without interferon-a in advanced malignant melanoma. J Trans Med. 11 (1), (2013).
- Jiao, J., Rhodes, D. G., Burgess, D. J. Multiple Emulsion Stability: Pressure Balance and Interfacial Film Strength. J Colloid Interface Sci. 250 (2), 444-450 (2002).
- Kakumanu, S., Tagne, J. B., Wilson, T. A., Nicolosi, R. J. A nanoemulsion formulation of dacarbazine reduces tumor size in a xenograft mouse epidermoid carcinoma model compared to dacarbazine suspension. Nanomedicine. 7 (3), 277-283 (2011).
- Xie, T., Nguyen, T., Hupe, M., Wei, M. L. Multidrug resistance decreases with mutations of melanosomal regulatory genes. Cancer Res. 69 (3), 992-999 (2009).
- Estanqueiro, M., Amaral, M. H., Conceição, J., Lobo, J. M. S. Nanotechnological carriers for cancer chemotherapy: the state of the art. Colloids Surf., B. 126, 631-648 (2015).
- Koziara, J. M., Whisman, T. R., Tseng, M. T., Mumper, R. J. In-vivo efficacy of novel paclitaxel nanoparticles in paclitaxel-resistant human colorectal tumors. J Controlled Release. 112 (3), 312-319 (2006).
- Ding, B., et al. Biodegradable methoxy poly (ethylene glycol)-poly (lactide) nanoparticles for controlled delivery of dacarbazine: Preparation, characterization and anticancer activity evaluation. Afr J Pharm Pharacol. 5 (11), 1369-1377 (2011).
- Ding, B., et al. Anti-DR5 monoclonal antibody-mediated DTIC-loaded nanoparticles combining chemotherapy and immunotherapy for malignant melanoma: target formulation development and in vitro anticancer activity. Int J Nanomedicine. 6, 1991-2005 (2011).
- Jenning, V., Thünemann, A. F., Gohla, S. H. Characterisation of a novel solid lipid nanoparticle carrier system based on binary mixtures of liquid and solid lipids. Int J Pharm. 199 (2), 167-177 (2000).
- Müller, R. H., Radtke, M., Wissing, S. A. Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs. Int J Pharm. 242 (1-2), 121-128 (2002).
- Pouton, C. W. Lipid formulations for oral administration of drugs: Non-emulsifying, self-emulsifying and 'self-microemulsifying' drug delivery systems. Eur. J. Pharm. Sci. 11 (Suppl. 2), S93-S98 (2000).
- Jores, K., Mehnert, W., Drechsler, M., Bunjes, H., Johann, C., Mäder, K. Investigations on the structure of solid lipid nanoparticles (SLN) and oil-loaded solid lipid nanoparticles by photon correlation spectroscopy, field-flow fractionation and transmission electron microscopy. J Controlled Release. 95 (2), 217-227 (2004).
- Almousallam, M., Zhu, H. Encapsulation of cancer therapeutic agent dacarbazine using nanostructured lipid carrier. Int nano lett. , (2015).
- Ng, W. K., et al. Thymoquinone-loaded nanostructured lipid carrier exhibited cytotoxicity towards breast cancer cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7) and cervical cancer cell lines (HeLa and SiHa). BioMed Research International. , (2015).
- Sun, M., et al. Quercetin-nanostructured lipid carriers: Characteristics and anti-breast cancer activities in vitro. Colloids Surf., B. 113, 15-24 (2014).
- Savla, R., Garbuzenko, O. B., Chen, S., Rodriguez-Rodriguez, L., Minko, T. Tumor-Targeted Responsive Nanoparticle-Based Systems for Magnetic Resonance Imaging and Therapy. Pharm Res. 31 (12), 3487-3502 (2014).
- Chen, Y., et al. Formulation, characterization, and evaluation of in vitro skin permeation and in vivo pharmacodynamics of surface-charged tripterine-loaded nanostructured lipid carriers. Int J Nanomedicine. 7, 3023 (2012).
- Sanna, V., Caria, G., Mariani, A. Effect of lipid nanoparticles containing fatty alcohols having different chain length on the ex vivo skin permeability of Econazole nitrate. Powder Technol. 201 (1), 32-36 (2010).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Adv Drug Deliv Rev. 54 (5), 631-651 (2002).
- Visaria, R. K., et al. Enhancement of tumor thermal therapy using gold nanoparticle-assisted tumor necrosis factor-a delivery. Mol Cancer Ther. 5 (4), 1014-1020 (2006).
- Tripathi, A., Gupta, R., Saraf, S. A. PLGA nanoparticles of anti tubercular drug: Drug loading and release studies of a water in-soluble drug. Int J PharmTech Res. 2 (3), 2116-2123 (2010).
- Joshi, M., Patravale, V. Nanostructured lipid carrier (NLC) based gel of celecoxib. Int J Pharm. 346 (1-2), 124-132 (2008).
- Lim, W. M., Rajinikanth, P. S., Mallikarjun, C., Kang, Y. B. Formulation and delivery of itraconazole to the brain using a nanolipid carrier system. Int J Nanomedicine. 9 (1), 2117-2126 (2014).
- Bei, D., Zhang, T., Murowchick, J. B., Youan, B. C. Formulation of dacarbazine-loaded cubosomes. Part III. physicochemical characterization. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1243-1249 (2010).
- Lei, M., et al. Dual drug encapsulation in a novel nano-vesicular carrier for the treatment of cutaneous melanoma: Characterization and in vitro/in vivo evaluation. RSC Advances. 5 (26), (2015).
