Summary
La méthode la plus couramment utilisée pour nanostructuré support lipidique (NLC) synthèse implique huile dans-eau, l'homogénéisation et la solidification. Cela a été modifié ici en appliquant la dispersion à cisaillement élevé après solidification pour obtenir un NLC avec la taille souhaitable, une meilleure encapsulation des drogues et de l'efficacité de chargement de médicament en tant que vecteur potentiel pour la livraison de dacarbazine.
Abstract
La seule formule de la dacarbazine (DAC) dans l'utilisation clinique est une perfusion intraveineuse, présentant un profil thérapeutique médiocre en raison de la faible dispersité de la drogue en solution aqueuse. Pour surmonter cela, un support nanostructuré lipidique (CNL) constitué par le palmitostéarate de glycéryle et le myristate d'isopropyle a été développé pour encapsuler Dac. CLN avec taille contrôlée ont été obtenus en utilisant la dispersion de cisaillement élevé (HSD) après solidification de l'émulsion huile-dans-eau. Les paramètres de synthèse, y compris la concentration en agent tensio-actif, la vitesse et le temps de HSD ont été optimisées pour obtenir la plus petite NLC avec la taille, l'indice de polydispersité et le potentiel zêta de 155 ± 10 nm, de 0,2 ± 0,01 et -43,4 ± 2 mV, respectivement. Les paramètres optimaux ont également été utilisés pour la préparation NLC Dac-chargé. Le NLC résultante chargé de Dac possédait taille, indice de polydispersion et le potentiel zeta de 190 ± 10 nm, 0,2 ± 0,01, et -43,5 ± 1,2 mV, respectivement. Le médicament ef encapsulationficacité et la charge de médicament a atteint 98% et 14%, respectivement. Ceci est le premier rapport sur l'encapsulation de Dac utilisant NLC, ce qui implique que NLC pourrait être un nouveau candidat potentiel en tant que support de médicament pour améliorer le profil thérapeutique de Dac.
Introduction
Dacarbazine (Dac) est un agent alkylant qui exerce une activité anti-tumorale par des acides nucléiques méthylation ou dommage direct de l' ADN, conduisant à un arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire 1.
En tant que premier agent chimiothérapeutique de ligne, Dac a été utilisé seul ou en combinaison avec d' autres médicaments de chimiothérapie pour le traitement de divers cancers 2-6. Il est l'agent le plus actif jusqu'à présent utilisé dans le traitement du mélanome cutané et métastatique, qui est la forme la plus agressive de 3,7,8 de cancer de la peau. Le taux de réponse, cependant, est seulement 20% au mieux, et les effets thérapeutiques sont souvent accompagnés d'effets secondaires systémiques graves.
Dans sa forme naturelle, Dac est hydrophile et est instable en raison de sa photosensibilité 9. La seule formule disponible pour une utilisation clinique est actuellement une poudre stérile à utiliser en suspension pour perfusion intraveineuse 7,8. Le faible taux de réponse et la toxicité systémique élevée rmangé de la drogue est en grande partie attribuable à sa faible solubilité dans l'eau, donc une faible disponibilité au site cible, et une grande distribution à des sites non-cibles, ce qui limite la dose maximale du médicament 10. La dégradation rapide et le métabolisme après l' admission par voie intraveineuse en même temps que le développement de la résistance aux médicaments limitent l'application clinique et l' effet thérapeutique du médicament 11. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer des formulations alternatives Dac pour le traitement du mélanome malin.
Les systèmes colloïdaux contenant des liposomes, des micelles ou particules nanostructurés ont été intensivement étudiés pour leur utilisation dans l' administration de médicaments examinés par Marilene et al. 12 particules nanostructurées comme porteurs potentiels de la drogue ont attiré une attention croissante dans la dernière décennie en raison de leur capacité à augmenter la charge de médicament l'efficacité, le contrôle de libération de médicament, d'améliorer la pharmacocinétique et la biodistribution drogue, et donc reduce toxicité systémique de la drogue 13. Seuls quelques nanoformulations, cependant, ont été étudiés jusqu'à présent pour la livraison Dac, montrant la protection de la drogue de la photo la dégénérescence, l' augmentation de la solubilité du médicament, et l' amélioration de l' effet thérapeutique 10,14,15. Cependant, ces formulations ont souffert de la faible efficacité d'encapsulation alors que certains en utilisant également des nanoparticules de polymères synthétiques qui ne sont pas rentables.
Des supports nanostructurés lipidiques (CNL), constitués d'un mélange de lipides solides et liquides, ont été développés pour la délivrance de médicaments 16,17. Les médicaments à encapsuler sont souvent solubles dans les deux lipides liquides et des lipides solides phases 18, entraînant une charge élevée et la libération 19 contrôlée. Cette étude vise à développer une nouvelle formulation basée sur Dac NLC-encapsulation en utilisant le palmitostéarate de glycéryle et le myristate isopropylique comme lipides. L'huile-dans-eau, l'évaporation, la solidification, et homogenizatio préparation en causen. Les préparations ont été caractérisées pour la taille NLC, la forme, ultrastructure et dispersity, l' efficacité de la drogue encapsulation et la charge de médicament 20.
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Protocol
1. Préparation de l'émulsion huile-dans-eau,
- Peser le palmitostéarate de glycéryle (120 mg), du myristate d'isopropyle (60 mg), de d-α-tocophéryl polyéthylène glycol succinate (30 mg) et de lécithine de soja (30 mg), et ajouter 12,5 ml de solvants organiques (6,25 ml d'acétone et 6,25 ml d'éthanol). dissoudre rapidement le mélange à la température de 70 ° C (5 ° C au-dessus du point de lipide solide de fusion) dans un bain d'eau.
- Ajouter soit 125, 250 ou 375 mg de Poloxamer188 dans 12,5 ml de ddH 2 O pour atteindre 1-3% (respectivement) de Poloxamer 188 solution, qui est soumise à un chauffage à la même température que ci - dessus.
- Ajouter la solution en phase aqueuse issue de l'étape 1.2 de la solution en phase huileuse de l'étape 1.1, goutte à goutte pour former des émulsions, sous agitation magnétique à 400 tours par minute. Agiter l'émulsion à 400 tpm pendant 4 heures pour permettre l'évaporation des solvants organiques.
2. La solidification et Homogénéisation
- Laisse til émulsion dans une chambre froide (4 ° C) pendant 2 heures pour solidifier / cristallisent.
- Pour obtenir NLC, soumettre l'émulsion à haute dispersion pure (HSD) avec un homogénéisateur à 10.000-15.000 rpm pendant 10-40 min.
3. Optimisation de la préparation NLC
- Prélever des échantillons provenant de l'étape 2.2 avec une concentration en tensioactif de 1, 2 et 3% subissant HSD à une vitesse de 10 000, 15 000 et 20 000 tours par minute, respectivement, et les intervalles de temps de 10, 20, 30 et 40 min, respectivement,
- Examiner les échantillons pour la taille des particules (PS), le poly indice de dispersion (PDI), la morphologie et l' ultrastructure 20.
Remarque: Les paramètres qui produisent des particules avec la plus petite taille (155 nm) et PDI (0,2) valeur sont déterminées comme optimal.
4. Préparation de Dac chargé NLC (NLC-Dac)
- Préparer une solution de phase huileuse telle que décrite à l'étape 1.1 avec l'ajout de Dac (70 mg) avant la dissolution du mélange à 70 ° C dans un bain d'eau.
- PRepare une solution en phase aqueuse comme décrit dans l'étape 1.2 à 1% de tensioactif, et d'ajouter cette solution à celle préparée à l'étape 4.1, goutte à goutte pour former une émulsion sous agitation magnétique à 400 tours par minute. Incorporer l'émulsion pour plus de 4 heures pour évaporer les solvants organiques.
- Laisser l'émulsion dans une chambre froide (4 ° C) pendant 2 heures pour solidifier / cristalliser comme décrit à l'étape 2, et enfin, soumettre l'émulsion à haute dispersion pure (HSD) en utilisant les paramètres optimaux déterminés à l'étape 3.
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Representative Results
Les préparatifs du NLC et NLC-Dac utilisant le palmitostéarate de glycéryle et le myristate isopropylique avec des paramètres différents ont été caractérisés pour PS, PDI, de la morphologie et de l' ultrastructure 20. Le PS et de préparation des CLN étaient concentration surfactant, la vitesse HSD et dépendante durée. Comme jugé par PS et de préparation des CLN, les meilleurs résultats ont été obtenus avec 1% de tensioactif et une vitesse de dispersion pure de 15.000 rpm pendant 30 min (figure 1A, B et C), qui , par conséquent wwew sélectionné comme les paramètres optimaux pour NLC préparation dans cette étude.
Figure 1. Optimisation des paramètres utilisés dans la préparation NLC. La concentration optimale de tensioactif et la vitesse et le temps de HSD ont été déterminées en fonction de leur effet sur le PS et le PDI. (
Les paramètres optimaux ont été utilisés pour la préparation NLC-Dac. La plus petite taille atteint était de 150 ± 10 nm pour NLC (figure 2A) et 190 ± 10 nm pour NLC-Dac (figure 2B), les deux avec PDI de 0,2 ± 0,001, ce qui indique une bonne uniformité.
Figure 2. DLS mesure du NLC (A) La distribution de la taille optimale de la plaine NLC. (B) la distribution de la taille optimale de la NLC-Dac.
(Figure 3).
Figure 3. TEM imagerie du NLC et NLC-Dac. Les deux NLC et NLC-Dac a montré une forme sphérique. (A) de base NLC structure comprend une couche de tensioactif (solide flèche noire), matrice lipidique liquide (blanc flèche pleine), et des cristaux de lipides solides (flèches blanches en pointillés); (B) NLC-Dac a également exposé la structure de base comme on le voit dans le NLC , mais la couche de tensioactif, matrice lipidique liquide et lipidiques solides cristaux semblaient élargis; une sous-structure supplémentaire pourrait être vu à l'intérieur des cristaux solides lipidiques (indiquées par des flèches noires en pointillés), indiquant la charge de médicament. échelle de Bar: 50 nm, Grossissement: 55,000X. Cette figure a été modifié depuis 20.
"1"> Le téléchargement et l' encapsulation de Dac dans NLC est indiquée par la taille et la structure des changements comme on le voit dans les figures 2 et 3 où NLC-Dac montre une plus grande taille et modifié les structures internes par rapport à la BNC. La structure de base NLC comprend une couche d'agent tensio - actif, une matrice lipidique liquide et de cristaux de lipides solides (figure 3A). CNL-Dac présentait également la structure de base en tant que NLC , mais avec une couche d'agent tensio - actif expansé, la matrice lipidique liquide et de cristaux de lipides solides, ainsi qu'une structure supplémentaire à l' intérieur des cristaux solides de lipides (figure 3B), indiquant la charge de médicament et de l' encapsulation. Les cristaux de lipides solides observés dans NLC sont apparus plus dense que dans NLC-Dac, ce qui indique que le lipide solide est moins cristallisé dans NLC-Dac.
L'efficacité d'encapsulation médicament (EF) et la charge de médicament (DL) pourcentage ont été calculées à partir des équations suivantes:
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> EE% = W 1 - W 2 / W 1 x 100 = 98,5%DL% = W 1 - W 2 / W 3 x 100 = 14%
où W 1 quantité de Dac ajouté dans le NLC, W 2 quantité de non-piégé Dac, W 3 quantité de lipides ajouté 20.
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Discussion
particules nanostructurés à base de lipides ont été utilisées pour fournir un support hautement lipophile pour la livraison de médicaments hydrophobes. Un NLC est la deuxième génération de solide support lipidique nanostructuré, qui sont solides à température ambiante et du corps. L'incorporation d'un lipide solide dans un liquide dans un lipide résultats CNL dans une cristallisation moins parfaite, augmentant ainsi l'efficacité de chargement de médicament et de réduire aussi l'expulsion des médicaments encapsulés pendant le stockage.
Pour la synthèse NLC, la méthode la plus couramment utilisée consiste à huile dans-eau, l' homogénéisation et la solidification / cristallisation 21,22. L'homogénéisation permet CLN de se disperser à fond dans une phase aqueuse, tandis que la solidification à basse température permet la phase huileuse interne à cristalliser. Différentes méthodes d'homogénéisation ont été signalés , y compris sous agitation magnétique, les ultrasons, et HSD qui sont utilisés avant et / ou pendant la solidification 23,24
Dans cette étude, la méthode utilisée a été initialement suivie pour la préparation NLC. Comme le résultat était satisfaisant, la méthode a été modifiée de telle sorte que HSD a été appliqué après la solidification. Cette modification avérée très efficace dans la génération de particules, PS et PDI contrôle, tout en faisant la synthèse NLC plus simple, par rapport aux précédents rapports sur la préparation NLC en utilisant les mêmes lipides 23,25. Il était intéressant de noter que la longueur de l'évaporation (protocole 1.3) et solidification (protocole 2.1) est très critique comme trop long ou trop court aurait des effets négatifs sur la production de NLC.
Cette étude suggère que les particules NLC et leur agrégation ont été formés lors de la solidification. Le HSD pourrait perturber l'agrégation, ce qui était peut-être due à une interaction hydrophobe entre CLN, et également stabiliser les particules en les remixant à fond avec surfactant. Le mode opératoire de synthèse a été optimisée par exemple tchapeau du NLC et NLC-Dac ont été produites avec une taille de 155 ± 10 nm et 190 ± 10 nm, respectivement, et un PDI de 0,2 ± 0,01. Le niveau élevé d'uniformité des tailles des particules et les petites valeurs PDI indique qu'une énergie suffisante de la dispersion a été obtenue et est bien répartie au sein de la solution pour la rupture des agrégats de particules. Il a été suggéré que les particules de 100 à 200 nm ne sont pas sujettes à l' absorption par les cellules non ciblées, y compris le système phagocytaire mononucléaire, ayant ainsi un temps de circulation sanguine longue in vivo 26,27, tandis qu'un IPD de plus de 0,5 est une indication de l' agrégation des particules 28; plus la valeur IPD, plus l'homogénéité de taille entre les particules 29. Nouvelle augmentation de la vitesse et le temps HSD au-dessus du point optimal pourrait entraîner une réduction supplémentaire PS, et par conséquent une augmentation des interactions entre les petites particules, ainsi que re-agrégation. La différence de taille et de structure entre NLC et NLC-Dac suggère que le Dac chargement et l'encapsulation a réussi. Le médicament se liant à la couche externe de la NLC et l'encapsulation à l'intérieur de matrices lipidiques offrent le potentiel de libération de médicament prolongée, qui pourrait impliquer la libération du médicament tout d'abord de la couche externe, suivie par la libération de la matrice lipidique liquide, puis des cristaux de lipides solides du NLC 30.
Actuellement, quatre nanoformulations ont été tentées pour la livraison de Dac en tant qu'agent unique. La dernière formulation rapporté a été conçu pour duel encapsulation de Dac et de vitamine A 32. Toutefois, ces formulations ont souffert d'un faible rendement d'encapsulation et / ou des procédés de synthèse relativement complexes. Ce rapport est le premier pour l'encapsulation de Dac avec un NLC, prouvant avantageux par rapport à d'autres encapsulations rapportés précédemment. NLC-Dac est facile à faire et présente plus l' encapsulation de drogue et le chargement d' efficacité 20. Le NLC-Dac a montré près de 50%médicament libéré dans les 2 premières heures tandis que le restant libéré lentement jusqu'à 30 h 20. La libération anticipée pourrait être due à la liaison du médicament avec la couche de tensioactif sur la surface de la NLC, ce qui indique que cette formulation peut ne pas être idéal pour remplacer la formulation actuellement en usage clinique. Cependant , le médicament dans NLC-Dac est apparu plus stable par rapport à la nanoémulsion indiqué précédemment 10. En outre, les véhicules à base de lipides ont été proposées pour le traitement du mélanome cutané et le carcinome épidermoïde par l' administration de médicaments topiques 32,10, ce qui indique que le NLC-Dac développé dans cette étude pourrait également être potentiellement bénéfique pour une application topique où la libération anticipée de la drogue ne serait pas potentiellement conduire à la toxicité systémique sévère.
En raison des limites collectives avec les transporteurs de distribution de médicaments disponibles développés à ce jour, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer des nanomatériaux plus avancés pour la livraison ciblée pour Dactraitement du cancer.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent la bourse Arabie Saoudite-financé (I821) pour rendre la recherche possible. Les auteurs remercient le Dr Liu Xianwei pour le soutien expert en analyse TEM à l'Université de Cranfield.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dacarbazine (DAC) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | D2390-100MG | drug used for uploading |
| glyceryl palmitostearate | Gattefossé (Saint_Priest_cédex, France) | 85251-77-0 | solid lipid |
| d-α- Tocopherol polyethylene glycol succinate (TPGS) | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 57668 | lipid phase surfactant |
| Poloxamer 188 | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 15759-1KG | liqiud phase surfactant |
| Acetone | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 650501-1L | organic solvent |
| Ethanol | Sigma Aldrich (Gillingham Dorset, UK) | 459836-1L | organic solvent |
| Soybean lecithin (SL) | Cuisine Innovation (Dijon, France) | SLL1402 | lipid phase surfactant |
| Double-distilled water was collected in our laboratory from | Millipore-Q Gradient A10 ultra-pure water system (Millipore, France) | SAS - 67120 | aqueous phase |
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | IKA | 3725000 | as high shear disperser |
| Hotplate Magnetic Stirrer | Scientific Support, Inc | 1454 | emulsion homogenization |
References
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