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Immunology and Infection

माउस त्वचा और draining लिम्फ नोड से माइलॉयड सेल अलगाव लाइव तनु के साथ intradermal टीकाकरण के बाद Published: May 18, 2016 doi: 10.3791/53796
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Unité de Biologie et Génétique du Paludisme, Institut Pasteur, 2Unité dImmunobiologie des Cellules Dendritiques, Institut Pasteur

Abstract

मलेरिया संक्रमण शुरू होती है जब प्लाज्मोडियम की बीजाणुज चरण एक मच्छर के काटने के माध्यम से एक स्तनधारी मेजबान की त्वचा में टीका है। अत्यधिक गतिशील परजीवी न केवल जिगर hepatocytes आक्रमण और एरिथ्रोसाइट संक्रामक रूप में परिणत करने के लिए पहुंचता है। यह भी त्वचा में और समीपस्थ लिम्फ नोड इंजेक्शन साइट है, जहां यह मान्यता प्राप्त है और निवासी और / या भर्ती माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा अपमानित किया जा सकता draining के लिए migrates। Intravital इमेजिंग त्वचा में चमकते फ्लोरोसेंट लिस-GFP सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स और स्पोरोजोएट्स और CD11c + draining लिम्फ नोड में कोशिकाओं के बीच बातचीत के प्रारंभिक भर्ती की सूचना दी। हम यहाँ, ठीक पहचान करने और माइलॉयड सेल सबसेट है कि माउस त्वचा के लिए भर्ती किया और एक murine मॉडल में स्पोरोजोएट्स की खुराक immunizing की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद लिम्फ नोड draining हैं गणना करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। प्ररूपी लक्षण वर्णन का उपयोग कर बहु-पैरामीट्रिक से फ्लो प्रदान करता हैएक विश्वसनीय परख प्लाज्मोडियम संक्रमण को भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान जल्दी गतिशील सेलुलर परिवर्तन का आकलन करने के लिए।

Introduction

मलेरिया दुनिया में घातक संक्रामक रोगों, प्रति वर्ष आधे से ज्यादा एक लाख लोग मारे गए में से एक है। प्लाज्मोडियम, रोग के कारण एजेंट द्वारा संक्रमण एक पूर्व एरिथ्रोसाइटिक (पीई) चरण से शुरू होता है। इस चरण के दौरान, एक महिला Anopheline मच्छर द्वारा मेजबान त्वचा में इंजेक्शन स्पोरोजोएट्स खून के माध्यम से जिगर तक पहुँचने और परजीवी रूपों है कि लाल रक्त कोशिकाओं को संक्रमित और रोग के लक्षण पैदा में अंदर hepatocytes अलग।

प्लाज्मोडियम की पीई चरणों विरोधी मलेरिया टीकाकरण के लिए एक विशेषाधिकार प्राप्त लक्ष्य प्रतिनिधित्व करते हैं। दरअसल, इस तरह के विकिरण तनु स्पोरोजोएट्स (आरएएस) के रूप में इन चरणों के खिलाफ तनु टीके, रहते हैं, आनुवंशिक रूप से गिरफ्तार कर लिया परजीवी (जीएपी) या रसायनरोगनिरोध और स्पोरोजोएट्स (सीपीएस) दोनों कृंतक और मानव मेजबान टीम 1-9 की रक्षा के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया है। कृंतक मॉडल में, सबसे टीकाकरण के अध्ययन नसों में टीकाकरण का उपयोग आयोजित की जाती हैंहै, जो सुरक्षात्मक प्रभावकारिता के संदर्भ में स्वर्ण मानक है। हालांकि, एक त्वचा चरण का विवरण और त्वचा से जुड़े draining लिम्फ नोड (DLN) संरक्षण जानने में के महत्व पीई चरण के बारे में हमारी धारणा बदल और इंजेक्शन की अंतर्त्वचीय मार्ग के महत्व पर जोर दिया है। पी के intravital इमेजिंग berghei स्पोरोजोएट्स मूषक की त्वचा में इंजेक्शन से पता चला है कि inoculum के केवल ~ 25% खून के माध्यम से जिगर तक पहुँचता है। शेष ~ 75% समीपस्थ DLN (~ 15%) और त्वचा (~ 50%) 10,11, जहां एक छोटे से अनुपात त्वचा कोशिकाओं 12,13 के अंदर सप्ताह के लिए बदल सकते हैं और जीवित रहने के बीच वितरित करता है। इसके अलावा, बाद में पढ़ाई वर्णित है कि अंतर्त्वचीय टीकाकरण के बाद प्रभावी सुरक्षा प्रतिरोधक क्षमता की स्थापना मुख्य रूप से त्वचा-DLN, जहां परजीवी विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं में जगह लेता है, और केवल तिल्ली या जिगर-dLNs 14,15 में मामूली।

जबकिज्यादातर अध्ययनों सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की स्थापना में फंसा प्रेरक कोशिकाओं के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है, बहुत कम, जीना तनु त्वचा में इंजेक्शन परजीवी के भाग्य के बारे में जाना जाता है, विशेष रूप से सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ उनकी बातचीत। विशेष रूप से, सीडी 8 + टी कोशिकाओं को परजीवी प्रतिजन तेज, प्रसंस्करण और प्रस्तुति में शामिल प्रतिजन कोशिकाओं पेश के लक्षण वर्णन, महत्वपूर्ण महत्व का है यह जानकर कि पीई प्रतिजन अधिग्रहण दोनों त्वचा और DLN डिब्बों में हो सकता है। पिछला intravital इमेजिंग अध्ययन एक संक्रामक मच्छर के काटने से 16 जबकि स्पोरोजोएट्स और वृक्ष के समान कोशिकाओं के बीच जल्दी बातचीत DLN 10,17 में मनाया गया के बाद त्वचा में चमकते फ्लोरोसेंट लिस-GFP सकारात्मक कोशिकाओं का एक प्रारंभिक बाढ़ का वर्णन किया। अभी हाल ही में यह बताया गया है कि मच्छरों द्वारा त्वचा में टीका स्पोरोजोएट्स की त्वचा में दोनों वृक्ष के समान और विनियामक टी कोशिकाओं की गतिशीलता बढ़ जाती हैचूहों, जबकि प्रतिजन कोशिकाओं की कमी नंबर DLN 18 में मनाया गया।

हम पहचान करने और अधिक ठीक ल्युकोसैट सबसेट त्वचा में भर्ती है और इसी DLN आरएएस 19 की खुराक immunizing की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद परजीवी के साथ बातचीत के उन लोगों के रूप में अच्छी तरह से यों के उद्देश्य से। इस संदर्भ में, हम दोनों के ऊतकों से माइलॉयड कोशिकाओं (CD45 + CD11b +) पृथक और cytometry बहु = पैरामीट्रिक प्रवाह द्वारा ब्याज की उप-जनसंख्या होती है। प्रतिरक्षा लीशमैनिया प्रमुख त्वचा संक्रमण 20 के प्रारंभिक चरण में वर्णित प्रतिक्रिया के अनुरूप, इंजेक्शन बीजाणुज करने के लिए प्राथमिक मेजबान प्रतिक्रिया Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C पूर्णांक) भड़काऊ monocytes (CD45 + CD11b के बाद की एक लगातार भर्ती होते हैं + Ly6G - Ly6C +) जो differenti के आधार पर पहचाने जाते हैंLy6G और Ly6C सतह मार्कर के अल अभिव्यक्ति।

हम यहाँ माउस त्वचा से माइलॉयड कोशिकाओं को अलग करने और DLN आरएएस की खुराक संक्रमित मच्छर लार ग्रंथियों से निकाला immunizing की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अंतर्त्वचीय इंजेक्शन और ऊतक प्रसंस्करण संक्रमित ऊतकों के भीतर सेल की आबादी में घुसपैठ की प्ररूपी परिवर्तन यों के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। दृष्टिकोण नीचे विस्तृत एक विश्वसनीय परख प्लाज्मोडियम परजीवी के लिए त्वचा और DLN भड़काऊ प्रतिक्रिया का आकलन करने और विभिन्न प्रायोगिक प्रणाली के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं पाश्चर संस्थान की समिति द्वारा और पशु प्रयोग पर स्थानीय आचार समिति (नैतिक समिति आईडीएफ पेरिस 1, पेरिस, फ्रांस, समझौते संख्या: 2012-0015) द्वारा अनुमोदित किया गया और लागू दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन।

1. सामग्री और अभिकर्मकों

  1. मादा एनोफिलिस stephensi मच्छरों (Sda500 तनाव) है कि के रूप में पहले 21 में वर्णित संक्रमित चूहों 3-5 दिनों के उद्भव और पीछे के बाद पर फ़ीड का प्रयोग करें।
  2. परजीवी प्लाज्मोडियम उपयोग berghei ANKA क्लोन विधान गर्मी झटका प्रोटीन 70 (HSP70) प्रमोटर के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जीन व्यक्त। इस परजीवी के जीवन चक्र 22 के दौरान उज्ज्वल प्रतिदीप्ति अर्जित करता है।
  3. महिला उपयोग C57BL / 6JRj चूहों (7 सप्ताह पुराने)।
    नोट: सभी वर्णित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों टी सामग्री / उपकरण के लिए सक्षम में सूचीबद्ध हैं।
_title "> 2। रेडिएशन-तनु मच्छर लार ग्रंथियों से बीजाणुज अलगाव

  1. संक्रामक रक्त भोजन के बाद 18-25 दिनों के बीच, इकट्ठा करने और के रूप में पहले 21 में वर्णित ठंड anesthetize बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मच्छरों। ध्यान से inverting ट्यूब द्वारा एक पेट्री डिश पर उन्हें स्थानांतरण। बर्फ पर कीड़ों को बनाए रखने और γ- या एक्स-विकिरण के एक 12 Krad खुराक के लिए मच्छरों को बेनकाब।
  2. विकिरणित मच्छर लार ग्रंथियों से तनु स्पोरोजोएट्स पृथक रूप में पहले 21 में वर्णित है। 1x Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) बर्फ पर की एक छोटी मात्रा (15 μl के आसपास) में संक्रमित लार ग्रंथियों लीजिए और धीरे स्पोरोजोएट्स जारी करने के लिए उन्हें कुचलने।
    नोट: एक छोटी मात्रा महत्वपूर्ण होने में एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित परजीवी निलंबन के इंजेक्शन, यह इसलिए चुने हुए अच्छी तरह से संक्रमित मच्छरों के एक उच्च संख्या से लार ग्रंथियों के लिए पर्याप्त संख्या में फसल के लिए आवश्यक है, के रूप में की उनके मजबूत अभिव्यक्ति इसका सबूतहरे-प्रतिदीप्ति।
  3. एक 35 माइक्रोन सेल झरनी टोपी आदेश झुरमुटों और मच्छर मलबे को खत्म करने के लिए एक कम आसंजन 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए अनुकूलित के माध्यम से बीजाणुज निलंबन फ़िल्टर।
  4. पृथक स्पोरोजोएट्स की कुल संख्या की गणना के रूप में पहले 21 में वर्णित है और 83,000 स्पोरोजोएट्स / μl प्राप्त करने के लिए ठंड 1x DPBS के साथ परजीवी निलंबन की एकाग्रता को समायोजित। बर्फ पर परजीवी स्टोर अगले कदम जारी है।
  5. कि कदम 2.2 और 2.3 में वर्णित के रूप में नमूना प्रक्रिया नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा और असंक्रमित मच्छरों से लार ग्रंथियों के बराबर संख्या में एकत्र। नमूने के रूप में ऊपर संकेत निलंबन में लार ग्रंथि के अर्क के समान एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पतला।
    नोट: स्पोरोजोएट्स 2 घंटा की अधिकतम के लिए बर्फ पर संग्रहित किया जा सकता है। हालांकि, आदर्श रूप में वे लार ग्रंथियों पेराई के बाद एक घंटे के भीतर इंजेक्शन हैं।

चमड़े ला में स्पोरोजोएट्स के 3. इंजेक्शनकान की yer

  1. ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन (50 मिग्रा / किग्रा) / xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण से जानवरों anesthetize। 5-8 मिनट रुको के लिए माउस बेहोशी की हालत में हो सकता है और कॉर्निया सुखाने को रोकने के लिए आंखों को नेत्र मरहम लागू करने के लिए। दोनों पीछे के पैरों पर एक सज्जन पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन से संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन।
    नोट: संज्ञाहरण की खुराक कम से कम 20 मिनट के लिए रहता है, तो अगले कदम के तुरंत किया जाना चाहिए।
  2. स्पष्ट टेप पहले एक stereomicroscope (चित्रा 1 ए) के तहत रखा के साथ उदर पक्ष फिक्सिंग से माउस के कान पंख स्थिर। धीरे कान वाहिका की क्षति से बचने के लिए दबाएँ।
  3. Resuspended परजीवी 10 की 0.6 μl के साथ एक 10 μl सिरिंज / 35 गेज bevelled सुई लोड।
  4. , ध्यान से कान (चित्रा 1 ए) के पृष्ठीय पक्ष पर सुई डालने, एपिडर्मिस के नीचे से 4 इंजेक्शन साइटों (साइट प्रति 0.15 μl) में बीजाणुज निलंबन देने के साथबेवल अप, देखभाल करने के लिए किसी भी रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए। सुई त्वचा में रहने के लिए कुछ सेकंड इसे हटाने से पहले injectant की backflow को रोकने के लिए अनुमति दें। प्रक्रिया (चित्रा 1 बी और 1 सी) के अंत में प्रत्येक इंजेक्शन स्थल पर एक विशेषता पौधों पर छोटा दाना का निरीक्षण करें।
  5. इंजेक्शन के बाद, ध्यान टेप से कान को हटा दें।
  6. कदम 3.2-3.4 का पालन करके परजीवी का एक ही खुराक के साथ contralateral कान इंजेक्षन।
  7. आदेश भड़काऊ प्रतिक्रिया अकेले इंजेक्शन और डर्मिस में मच्छर सामग्री के बयान से मध्यस्थता का मूल्यांकन करने में 1x DPBS के या तो 0.6 μl या असंक्रमित मच्छरों से 1x DPBS + लार ग्रंथि निकालने के 0.6 μl के साथ 2 अतिरिक्त चूहों इंजेक्षन।
  8. पिंजरे में इसे वापस रखने से पहले संज्ञाहरण से माउस वसूली की निगरानी।
    नोट: त्वचा में उचित बीजाणुज बयान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2A और 2 बी द्वारा नजर रखी जा सकती है), माउस के रूप में previsously 23 में वर्णित तैयार किया जा रहा।

4. त्वचा और draining लिम्फ नोड विच्छेदन

  1. मानक मध्यम (एसएम) तैयार इस प्रकार है: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 25 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) 400 यू के साथ पूरक / एमएल collagenase और 50 माइक्रोग्राम / एमएल deoxyribonuclease (DNase) ।
  2. DLN नमूने के लिए 4.5 मिलीलीटर एसएम + 70 माइक्रोन सेल झरनी के प्रति अच्छी तरह से (प्लेट ए) और त्वचा के नमूने के लिए अच्छी तरह से प्रति 4.5 मिलीलीटर एसएम (प्लेट बी) के साथ बर्फ पर दो 6 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे टिशू कल्चर प्लेटें तैयार करें।
  3. बीजाणुज संचारण के बाद वांछित समय बिंदु पर, गहरा ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन (125 मिलीग्राम / किग्रा) / xylazine (12.5 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण से पहले ग्रीवा अव्यवस्था से माउस anesthetize। यकीन है कि माउस नैदानिक ​​मौत के लक्षण को दर्शाता है बनाओ और विच्छेदन तुरंत शुरू करते हैं।
    नोट: माइलॉयड सेल भर्ती के कैनेटीक्स inj के बाद अलग अलग समय पर जांच की जा सकतीection (यानी 2 घंटे, 4 घंटे और 24 घंटा पहले वर्णित 14) के रूप में।
  4. टीका कान और 70% इथेनॉल के साथ इसी गर्दन क्षेत्र कीटाणुरहित संदूषण की संभावना को कम करने के लिए।
  5. बाँझ कैंची और संदंश का प्रयोग, aseptically आसपास वसा इकट्ठा करने के बिना समीपस्थ auricular DLN काटना। jugulo-carotidian परिखा में पहली बार एक चीरा प्रदर्शन और ऑपरेटिंग क्षेत्र से बाल हटा दें। 2 संदंश के साथ चीरा खिंचाव DLN कि आसपास के ऊतकों की तुलना में भूरा दिखाई देता है बेनकाब करने के लिए।
  6. संदंश के साथ DLN के शीर्ष पर ध्यान संयोजी ऊतक चुटकी अपनी हटाने की सुविधा के लिए। लसीकावत् ऊतक (चित्रा 3 ए और 3 बी) के नीचे एक संदंश रखकर DLN निकालें। एक अच्छी तरह से युक्त 4.5 मिलीलीटर एसएम + 70 माइक्रोन सेल झरनी (प्लेट ए) में DLN रखें।
  7. बाँझ तेज कैंची और संदंश (चित्रा 4 ए) का उपयोग करते हुए पूरे टीका कान हार्वेस्ट। sEPARबन्द रखो और कटौती के अलावा रिक्ति दो संदंश (- 4E चित्रा 4 बी) के साथ समाप्त होता है से कान के पृष्ठीय और उदर पहलुओं खा लिया। उन्हें एक अच्छी तरह से युक्त 4.5 मिलीलीटर एसएम (प्लेट बी) में यकीन है कि दोनों के ऊतकों पूरी तरह से मध्यम में डूब रहे हैं बनाने रखें।
    नोट: प्रयोग की विश्वसनीयता में सुधार और ब्याज की कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए, पूल 2 नमूना प्रति एक ही माउस से इंजेक्शन कान या 2 dLNs।
  8. हार्वेस्ट और समानांतर कान और या तो 1x DPBS या लार ग्रंथि अर्क के साथ टीका चूहों के dLNs में प्रक्रिया। नकारात्मक और एकल धुंधला मुआवजा नियंत्रण के लिए एक भोली माउस से काटा 2 अतिरिक्त कान और लिम्फ नोड के नमूने शामिल करें।

5. लिम्फ नोड्स से सेल अलगाव

  1. कोमल आंदोलन के तहत 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 में लिम्फ नोड्स (प्लेट ए) सेते हैं। 10 मिमी अंतिम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) अच्छी तरह से प्रति जोड़े कोलैजिनेज़ और DNase acti बेअसर करने के लिएvities। बर्फ पर अगले चरणों का प्रदर्शन।
  2. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के शीर्ष के अंत का उपयोग कर लिम्फ नोड्स अलग कर देना। सब जब तक झरनी कि रहता है के खिलाफ परिपत्र गति में प्रेस सफेद संयोजी ऊतक है।
  3. 500 μl 1x DPBS + 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + 2 मिमी EDTA के साथ दो बार सेल झरनी कुल्ला। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह से की पूरी मात्रा स्थानांतरण।
  4. अच्छी तरह से 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के साथ दो बार कुल्ला और 15 मिलीलीटर ट्यूब में मात्रा हस्तांतरण। बर्फ पर ट्यूबों रखें।

6. कान की त्वचा से सेल अलगाव

  1. कोमल आंदोलन के तहत 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर कान पत्रक (प्लेट बी) सेते हैं।
    नोट: ऊष्मायन के 20 मिनट के बाद, छोटे टुकड़ों में कैंची ऊतक पाचन की सुविधा और शेष 40 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस डाल करने के लिए नमूना के साथ कान पत्रक काटा। एकल कक्षों ऊष्मायन समय के अंत में मध्यम में मनाया जा सकता है।
  2. 10 मिमी अंतिम जोड़े अच्छी तरह से प्रति EDTA कोलैजिनेज़ और DNase गतिविधियों बेअसर। बर्फ पर अगले चरणों का प्रदर्शन।
  3. एक नए तरह एक 1ml पिपेट का उपयोग कर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी युक्त कान ऊतक टुकड़े और मध्यम की पूरी मात्रा स्थानांतरण। टिप के अंत से 2 से 3 मिमी कट और अधिक आसानी से कान ऊतक टुकड़े इकट्ठा करने के लिए।
  4. कान ऊतक एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार के शीर्ष के अंत का उपयोग कर टुकड़े अलग कर देना। सब जब तक झरनी कि रहता है के खिलाफ परिपत्र गति में प्रेस सफेद संयोजी ऊतक है।
  5. 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के साथ दो बार सेल strainers कुल्ला।
  6. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर-ट्यूब में अच्छी तरह से की पूरी मात्रा स्थानांतरण।
  7. अच्छी तरह से 500 μl 1x DPBS + 2% FBS के साथ + 2 मिमी EDTA कुल्ला और 50 मिलीलीटर ट्यूब में मात्रा हस्तांतरण। बर्फ पर ट्यूब रखें।
    नोट: विभिन्न चरणों त्वचा से कुल कोशिकाओं को अलग करने और DLN ऊतकों चित्रा 5 में संक्षेप हैं।
शीर्षक "> 7। गणना और एकत्र की कोशिकाओं की व्यवहार्यता

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 5 मिनट के लिए त्वचा और DLN नमूने अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। धीरे 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के साथ गोली resuspend।
  2. त्वचा और DLN एक hemocytometer का उपयोग करने से अलग कक्षों की कुल संख्या गिनती करने के लिए प्रत्येक नमूने की एक छोटी मात्रा ले लीजिए। 0.04% trypan नीले सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए जोड़ें।

8. गैर अवरुद्ध विशिष्ट प्रतिजन बाध्यकारी

  1. unlabelled CD16 / CD32 एफसी-ब्लॉक एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर जोड़ें। (अब जा सकते हैं) 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट सेते हैं।
  2. ठंड 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। धीरे 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के साथ गोली resuspend और बर्फ पर नमूने बनाए रखें।

9. धुंधला त्वचा और लिम्फ नोड माइलॉयड प्रकोष्ठों

  1. पहले से अवरुद्ध स्की सेतेn और DLN पृथक लाइव / मृत ट्रैकर (यानी 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole या DAPI), विरोधी CD45 और विरोधी CD11b विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं।
    नोट: आदेश में ब्याज की माइलॉयड सेल उप-जनसंख्या, विशेष रूप से दुर्लभ लोगों को समृद्ध करने के लिए, CD45 + कोशिकाओं और लिम्फोसाइटों क्रमश त्वचा से शुद्ध या चुंबकीय मनका सुविधा सेल छँटाई द्वारा DLN से समाप्त किया जा सकता है। DLN से अलग कक्षों के सबसे चूंकि हैं CD45 +, विरोधी CD45 का उपयोग अनिवार्य नहीं है। अन्य मार्करों सकारात्मक या नकारात्मक gating रणनीति द्वारा ब्याज की माइलॉयड सेल उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए शामिल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, DLN में भर्ती माइलॉयड कोशिकाओं CD8α + कोशिकाओं को छोड़कर द्वारा समृद्ध थे (पूरे टी सेल डिब्बे विरोधी CD3 विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है)।
  2. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA, सेंट्रीफ्यूज नमूना 5 मिनट जोड़ें और supe त्यागनेrnatant। धोने कदम दो बार दोहराएँ।
  3. 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के साथ नमूने Resuspend। एक 35 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से एक FACS ट्यूब में पूरी मात्रा स्थानांतरण। 100 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 मिमी EDTA के साथ फिल्टर कुल्ला।
  4. एक प्रवाह कोशिकामापी में दाग कोशिकाओं चलाएँ। गेट रहते एकल कक्षों (DAPI -, FSC डब्ल्यू) मृत कोशिकाओं और दोहरी बाहर करने के लिए। CD11b + DLN (चित्रा 6B) के लिए घटनाओं - त्वचा (चित्रा 6A) और (CD45 +) CD8α के लिए प्लॉट CD45 + CD11b + घटनाओं।

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Representative Results

हमने हाल ही में पी की immunizing खुराक की कि सुई सिरिंज इंजेक्शन का प्रदर्शन berghei स्पोरोजोएट्स में माउस त्वचा त्वचा और DLN 19 में भड़काऊ monocytes के द्वारा पीछा Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल की एक लगातार भर्ती लाती है। नयाचार अनुभाग में वर्णित ऊपर सफलतापूर्वक कान डर्मिस में स्पोरोजोएट्स की बड़ी संख्या के कई इंजेक्शन के बाद दोनों के ऊतकों से लाइव माइलॉयड कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया का विवरण (आंकड़े 1 और 2)। पहले 24 घंटा के भीतर, DLN (चित्रा 3) और त्वचा इंजेक्शन साइट (चित्रा 4) पृथक और प्रसंस्कृत चित्रा 5 में संक्षेप के रूप में बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह cytometry द्वारा सेलुलर घुसपैठ का विश्लेषण करने के लिए थे। कुल मिलाकर, इस तकनीक को अलग-थलग करने के लिए औसतन 10 4 CD45 + CD11b + और ​​2.10 4 CD11b + रहते एकल कक्षों की अनुमति दीत्वचा और DLN क्रमशः के लिए। गैर मलबे एकल कक्षों के स्वीकार्य व्यवहार्यता त्वचा के लिए 40-70% और DLN के लिए 70-90% से लेकर। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 6, त्वचा में माइलॉयड कोशिकाओं की आवृत्ति (CD45 + CD11b +) और DLN (CD8α - CD11b +) दृढ़ता से रास की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद बढ़ जाती है गैर संक्रमित चूहों के साथ तुलना में।

आकृति 1
चित्रा 1: मैं माउस के कान में स्पोरोजोएट्स इंजेक्शन ntradermal। (ए) छवि एक anesthetized माउस के कान पंख में स्पोरोजोएट्स के अंतर्त्वचीय इंजेक्शन दिखा। कान के उदर पक्ष स्पष्ट टेप पहले एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत रखा के साथ स्थिर है। सुई ध्यान से कान के पृष्ठीय पक्ष पर डाला जाता है, एपिडर्मिस के नीचे, बेवल के साथ। (बी - सी)) कान पंख के पृष्ठीय पक्ष प्रायर (बी और दिखा (परजीवी निलंबन की 0.1-0.2 μl के सी) अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद चित्र। एक विशेषता पौधों पर छोटा दाना (काला तीर) आपरेशन के अंत में इंजेक्शन स्थल पर नमूदार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
। चित्रा 2: माउस के कान डर्मिस में स्पोरोजोएट्स जमा इमेजिंग (ए) प्रतिदीप्ति रास माउस त्वचा 15 मिनट के बाद इंजेक्शन (स्केल बार = 60 माइक्रोन में इंजेक्शन साइट (धराशायी लाइनों द्वारा संकेत) से पलायन दिखा माइक्रोस्कोपी; 10X बढ़ाई)। स्पोरोजोएट्स की राह फ्लोरोसेंट संकेत की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का प्रतिनिधित्व करती है। हरे और लाल प्रतिदीप्ति फिर सेspectively शुरुआत में और अधिग्रहण के 10 सेकंड के बाद त्वचा में परजीवी स्थिति को दिखाने के। (बी) आरएएस (हरा) के उच्च बढ़ाई त्वचा में इंजेक्शन (स्केल बार = 20 माइक्रोन; 25X बढ़ाई)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: draining लिम्फ नोड प्रोसेसिंग (ए) के प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए इवांस नीले रंग की त्वचा के अंदर इंजेक्शन के बाद समीपस्थ auricular DLN के विच्छेदन दिखा तस्वीर।। माउस के गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, गर्दन में 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित है। एक पहली चीरा तेज कैंची के साथ गले-मन्या क्षेत्र में किया जाता है और त्वचा के परिचालन क्षेत्र से हटा दिया जाता है। चीरा DLN कि जीआर प्रतीत होता है बेनकाब करने के लिए 2 संदंश के साथ फैला हैAyish आसपास के ऊतकों की तुलना में। संयोजी ऊतक तो ध्यान DLN के शीर्ष पर संदंश के साथ pinched रहे हैं और उत्तरोत्तर इसे से अलग कर दिया। अंत में, DLN लसीकावत् ऊतक के नीचे एक संदंश रखकर निकाला जाता है। (बी) पीबीएस की एक बूंद में निकाले DLN दिखा तस्वीर। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। कान त्वचा प्रसंस्करण लगातार कदम दिखा चित्र टीका कान की प्रक्रिया। (ए) माउस के गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, कान 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित है और बाँझ तेज कैंची और संदंश का उपयोग कर हटाया। (बी - डी) पृष्ठीय और कान के उदर पहलुओं हल्के से बन्द रखो और एस से अलग होती हैकटौती के अलावा पेसिंग दो संदंश के साथ समाप्त होता है। (ई) कान से पहले enzymatic उपचार के पृष्ठीय और उदर पहलुओं को दिखाने के चित्र। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:।। प्रोटोकॉल सारांश त्वचा और DLN ऊतकों से कुल कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: माइलॉयड सेल की आबादी कान त्वचा और समीपस्थ DLN से अलग प्रतिनिधि FACS दिखा भूखंडों।gating रणनीति त्वचा (ए) और DLN (बी) में माइलॉयड डिब्बे का विश्लेषण करने के लिए। CD45 + CD11b + और ​​CD8α - CD11b + कोशिकाओं त्वचा और DLN क्रमशः के लिए कुल लाइव स्वेटर घटनाओं पर gated थे। हर हालत के लिए, 5 x 10 5 कुल घटनाओं (2 कान और 2 DLN नमूना प्रति जमा) का अधिग्रहण किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक पूरी बीजाणुज मलेरिया वैक्सीन का उपयोग मनुष्य के लिए बड़े पैमाने पर टीकाकरण के परिप्रेक्ष्य में, मुख्य चुनौतियों पर काबू पाने का एक सफल टीकाकरण और सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए 24,25 अनुकूलित मार्गों और परजीवी प्रशासन के तरीकों को विकसित करने के लिए है। मनुष्यों में, लाइव तनु परजीवी (एलएपी) द्वारा मध्यस्थता सुरक्षात्मक प्रभावकारिता का मूल्यांकन प्राकृतिक मच्छर निम्न प्रदर्शन किया गया है काटता 2, साथ ही त्वचा के अंदर, चमड़े के नीचे 25,26 और चतुर्थ टीकाकरण 27। के रूप में मूषक 28 और गैर मानव प्राइमेट 25 में सूचना दी, गोद के चतुर्थ प्रशासन उपर्युक्त मार्गों की तुलना में मजबूत सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया लाती है। फिर भी, सुई और सिरिंज का उपयोग कर प्रशासन के गैर-चतुर्थ मार्गों अभी भी मानव बड़े पैमाने पर टीकाकरण के लिए अधिक उपयुक्त रहता है और प्रयासों वर्तमान में उनकी सुरक्षा प्रभावकारिता अनुकूलन करने के लिए प्रयास किए जा रहे हैं।

चूहों में आयोजित हाल के अध्ययनों से प्रदर्शितडी, विशेष रूप से आईडी मार्ग के मामले में, कि बीजाणुज निलंबन (1 μl की सीमा) कई इंजेक्शन साइटों (4 अंक) काफी बढ़ परजीवी संक्रामकता में बड़ी मात्रा में पतला परजीवी का एक भी टीका की तुलना की एक छोटी मात्रा के बयान (50 μl) 24। हमारे प्रायोगिक प्रणाली (C57BL 6 / माउस - पी berghei) में, पूरी सुरक्षा 19 (0.6 μl, 4 इंजेक्शन साइटों में 50,000 आरएएस) के परजीवी के अत्यधिक ध्यान केंद्रित निलंबन के कान डर्मिस में कई इंजेक्शन के बाद हासिल की थी। इस संदर्भ में, हम प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित अधिक ठीक आरएएस की खुराक है कि हमें परजीवी 19 के जवाब में 2 प्रमुख माइलॉयड सेल सबसेट त्वचा और DLN में भर्ती की पहचान करने की अनुमति दी immunizing करने के लिए स्थानीय मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए स्थापित किया।

मल्टी पैरामीट्रिक से फ्लो मेजबान प्रतिक्रिया के संदर्भ में सटीक पहचान और प्रतिरक्षा सेल परिवर्तन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता हैसंक्रमण 19,20 करने के लिए। व्यवहार्य कोशिकाओं की बड़ी संख्या के अलगाव इसलिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्ररूपी विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रयोजन के लिए, एंजाइम एकाग्रता और ऊतक पाचन की अवधि अनुकूलित किया जाना चाहिए। दरअसल, एंजाइमों या अपर्याप्त ऊष्मायन समय की कम एकाग्रता कोशिकाओं की कम उपज के साथ अधूरा पाचन को जन्म दे सकती है, जबकि लंबे समय तक ऊतक पाचन कमी सेल व्यवहार्यता और कोशिका की सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति 29 के परिवर्तन में परिणाम हो सकता है। फिर भी, अच्छी तरह से स्थापित कोलैजिनेज़ उपचार का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रासंगिक सतह अणुओं अक्सर 30 का विश्लेषण करती है प्ररूपी के लिए इस्तेमाल की detectability पर सीमांत प्रभाव पड़ता है दिखाया गया है।

कई मापदंडों है कि सेल अलगाव की गुणवत्ता का अनुकूलन कर सकते हैं के अलावा, पृष्ठीय और कान त्वचा के उदर वर्गों की जुदाई, आवश्यक है, क्योंकि यह कोलैजिनेज़ / DNase डर्मिस का उपयोग करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, छोटे में त्वचा नख़रेबाज़टुकड़े सतह क्षेत्र एंजाइमों के लिए सुलभ बढ़ जाती है, इसलिए पाचन की छोटी अवधि की इजाजत दी। अंत में, यांत्रिक हदबंदी के उपयोग के दोनों त्वचा और DLN के लिए सेल नंबर में पैदावार बढ़ाने के लिए मदद करता है। हालांकि, अत्यधिक हदबंदी अतिरिक्त तनाव है कि नकारात्मक सेल व्यवहार्यता पर असर पड़ सकता हो सकता है।

हम जीवित कोशिकाओं के अधिग्रहण के बाद से इष्ट निर्धारण सबऑप्टिमल धुंधला की ओर जाता है, ब्याज की दुर्लभ सकारात्मक घटनाओं का गौरव उलझी (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अलावा, मृत कोशिकाओं के भेदभाव अधिक समस्याग्रस्त था। मामलों में जहां सेल निर्धारण की आवश्यकता है, हम साथ रहते / मृत फिक्स मृत सेल दाग के उपयोग का सुझाव है।

परिभाषित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक अलग माइलॉयड जवाब में त्वचा और DLN में घुसपैठ की कोशिकाओं को इंजेक्शन (चित्रा 6A और बी) परजीवी। हम आम तौर पर DLN (70-90%) की तुलना में से व्यवहार्य एकल कक्षों का उच्च स्तर प्राप्तत्वचा (40-70%)। यह अंतर अब ऊष्मायन समय त्वचा कोशिकाओं को अलग करने के लिए यांत्रिक हदबंदी के लिए अतिरिक्त कदम (त्वचा की परत जुदाई, नख़रेबाज़ और मजबूत mashing) के साथ मिलकर कुशल enzymatic पाचन के लिए आवश्यक द्वारा समझाया जा सकता है।

अंत में, जब स्पोरोजोएट्स की आईडी इंजेक्शन के लिए मेजबान प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए खाते में लेने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर त्वचा 19,20 में दोनों सुई प्रविष्टि और मच्छर लार ग्रंथि निकालने बयान से प्रेरित सूजन के स्तर पर है। इसलिए हम अकेले या तो 1x पीबीएस या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विशेष रूप से परजीवी से प्रेरित मूल्यांकन करने के लिए गैर संक्रमित मच्छरों की एक ही नंबर से लार ग्रंथि अर्क के साथ अतिरिक्त चूहों इंजेक्षन करने के लिए सुझाव देते हैं। कुल मिलाकर, हम लार ग्रंथियों में उच्च परजीवी लोड के साथ संक्रमित मच्छरों टुकड़े करना और मच्छर सामग्री की राशि है कि त्वचा में जमा किया जा सकता सीमित करने परजीवी निलंबन फिल्टर करने के लिए सलाह।

मैंn सारांश, वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से त्वचा और DLN से माइलॉयड कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय परख प्लाज्मोडियम संक्रमण को भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान गतिशील सेलुलर परिवर्तन का आकलन करने के लिए और मेजबान की त्वचा में प्रेषित अन्य रोगाणुओं को बढ़ाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

लेखकों माउस त्वचा में बीजाणुज गतिशीलता के vivo इमेजिंग में शिक्षण के लिए चित्रों और पॉलीन Formaglio लेने में मदद के लिए पेट्रीसिया Baldacci, वैनेसा Lagal और सबीन Thiberge महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए, इरीना Dobrescu और सबीन Thiberge धन्यवाद। हम यह भी मच्छर के पालन के लिए उत्पादन और एनोफ़ेलीज़ (Cepia-Institut पाश्चर) के संक्रमण के लिए मारेक Szatanik और केंद्र को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस अध्ययन एक्सा रिसर्च फंड और Laboratoire d'उत्कृष्टता "संक्रामक रोगों उभरते की एकीकृत जीवविज्ञान" से धन द्वारा समर्थित किया गया (अनुदान नहीं। ANR-10-LabX-62-IBEID)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine: Imalgene® 1,000 Merial - 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice
Xylazine: Rompun® 2% Bayer - 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice
NanoFil syringe + 35 gauge needle World Precision Instruments  - -
Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. B. Braun Medical  9151125 -
MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom BD Falcon  353046 -
70 µm cell strainer  BD Falcon  352350 -
2 ml syringe Terumo SS-02S -
BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube BD Falcon  352097 -
BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube BD Falcon  352098 -
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap BD Falcon  352235 -
DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free Life Technologies 14190-094 -
DMEM 1x + GlutaMAXTM Life Technologies 31966-021 -
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid  Sigma-Aldrich  C5138 400 U/ml 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV  Sigma-Aldrich  D5025 50 µg/ml
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich  E-5134 10 mM or 2.5 mM
FBS Biowest S1810-500 -
HEPES buffer solution (1M) Gibco 15630-056 25 mM
Trypan blue Stain (0,4%) Life Technologies 15250-061 Dilution 1:10 
Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) BD Biosciences 553142 10 µg/ml final (1:50)
DAPI FluoroPureTM grade Life Technologies D21490 1 µg/ml final
Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) BD Biosciences 559864  Dilution 1:200
Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) BD Biosciences 557657  Dilution 1:400
Anti-mouse CD8α (5H10 clone) Life Technologies MCD0830  Dilution 1:100
Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)  Janvier Laboratories - -

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References

  1. Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
  2. Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
  3. Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
  4. Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
  5. Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
  6. van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
  7. Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
  8. Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
  9. Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
  10. Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
  11. Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
  12. Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
  13. Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
  14. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
  15. Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
  16. Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
  17. Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
  18. da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
  19. Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
  20. Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
  21. Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
  22. Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
  23. Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
  24. Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
  25. Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
  26. Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
  27. Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
  28. Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
  29. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
  30. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).

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इम्यूनोलॉजी अंक 111 प्लाज्मोडियम कृंतक सहज प्रतिरक्षा त्वचा लिम्फ नोड माइलॉयड कोशिकाओं enzymatic पाचन
माउस त्वचा और draining लिम्फ नोड से माइलॉयड सेल अलगाव लाइव तनु के साथ intradermal टीकाकरण के बाद<em&gt; प्लाज्मोडियम</em&gt; स्पोरोजोएट्स
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Mac-Daniel, L., Buckwalter, M. R., Gueirard, P., Ménard, R. Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites. J. Vis. Exp. (111), e53796, doi:10.3791/53796 (2016).

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