Abstract
Malaria - Infektion beginnt , wenn die Sporozoiten - Stadium von Plasmodium in die Haut eines Säugerwirt durch einen Mückenstich beimpft. Der hoch motile Parasit nicht erreicht nur die Leber Hepatozyten einzudringen und in Erythrozyten-infektiöse Form verwandeln. Es wandert auch in die Haut und zum proximalen Lymphknoten die Injektionsstelle Entwässern, wo sie von resident und / oder rekrutiert myeloischen Zellen erkannt und abgebaut werden können. Intravital Imaging berichtet die frühe Rekrutierung von hell fluoreszierende Lys-GFP positiven Leukozyten in der Haut und den Wechselwirkungen zwischen Sporozoiten und CD11c + Zellen im Lymphknoten. Wir präsentieren hier ein effizientes Verfahren zu erholen, zu identifizieren und die myeloischen Zelluntergruppen aufzuzählen, die auf die Haut von Mäusen angeworben werden und ableitenden Lymphknoten folgende intradermale Injektion von Dosen von Sporozoiten in einem Mausmodell immunisieren. Phänotypischen Charakterisierung mittels Multi-parametrischer Durchflusszytometrie bietetein zuverlässiger Assay frühen dynamischen zellulären Veränderungen bei entzündlichen Reaktion auf Plasmodium - Infektion zu bewerten.
Introduction
Malaria ist eine der tödlichsten Infektionskrankheiten der Welt, mehr als eine halbe Million Menschen pro Jahr töten. Infektionen durch Plasmodium, dem Erreger der Krankheit beginnt mit einem vorge erythrozytären (PE) -Phase. Während dieser Phase in die Wirts Haut von einer Mücke weiblichen Anopheles injiziert Sporozoiten erreichen die Leber über die Blutbahn und im Inneren Hepatozyten in die Parasitenformen unterscheiden , die roten Blutkörperchen infizieren und bewirken , dass die Symptome der Krankheit.
Die PE - Stadien von Plasmodium stellen eine privilegierte Ziel für Anti-Malaria - Impfung. Tatsächlich abgeschwächten Lebendimpfstoffe gegen diesen Phasen, wie Strahlung abgeschwächt Sporozoiten (RAS), genetisch verhaftet Parasiten (GAP) oder Chemoprophylaxe und Sporozoiten (CPS) haben ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt 1-9 sowohl Nagetier und menschlichen Wirten zu schützen. Im Nagetiermodell sind die meisten Impfung Studien intravenöse Immunisierung unter Verwendung von, Das ist der Goldstandard in Bezug auf die Schutzwirkung. Allerdings hat die Beschreibung einer Haut Stufe und die Bedeutung der Haut-assoziierten Lymphknoten (dLN) bei der Auslösung Schutz unserer Wahrnehmung der PE-Phase geändert und betonte die Bedeutung der intradermale Route der Injektion. Intravital Bildgebung von P. berghei - Sporozoiten in die Haut von Nagetieren injiziert hat gezeigt , dass nur ~ 25% des Inokulums über die Blutbahn in die Leber gelangt. Die verbleibende ~ 75% verteilt sich zwischen dem proximalen dLN (~ 15%) und der Haut (~ 50%) 10,11, wo ein kleiner Anteil verwandeln und am Leben bleiben über Wochen Innenhautzellen 12,13. Außerdem beschrieben nachfolgende Studien , dass die Schaffung von wirksamen Schutzimmunität nach intradermale Immunisierung vor allem in der Haut-dLN nimmt, wo Parasiten spezifischen CD8 + T - Zellen aktiviert werden, und nur geringfügig in der Milz oder Leber-DLNs 14,15.
Währenddie meisten Studien haben sich auf die Charakterisierung der Effektor-Zellen in der Einrichtung protektive Immunantwort beteiligt konzentriert, noch viel weniger wird über das Schicksal von lebenden attenuierten Parasiten in die Haut injiziert bekannt, insbesondere ihre Wechselwirkungen mit dem angeborenen Immunsystem. Insbesondere Charakterisierung von Antigen-präsentierenden in Parasit - Antigen - Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation für CD8 + T - Zellen beteiligten Zellen ist von entscheidender Bedeutung, zu wissen , dass Akquisitions PE Antigen sowohl in der Haut und dLN Kompartimente auftreten können. Zurück intravital Bildgebungsstudien beschrieben einen frühen Zustrom von hell fluoreszierende Lys-GFP - positiven Zellen in der Haut nach einem infektiösen Mückenstich 16 , während frühe Interaktionen zwischen Sporozoiten und dendritischen Zellen wurden in der dLN 10,17 beobachtet. In jüngerer Zeit hat es sich durch Mücken in der Haut inokuliert Sporozoiten erhöht die Beweglichkeit der beiden dendritischen und regulatorische T-Zellen in der Haut berichtet, dassMäuse, während eine Abnahme Anzahl von Antigen - präsentierenden Zellen in der dLN 18 beobachtet.
Wir sollen , zu identifizieren und genauer die Leukozytenuntergruppen rekrutiert in der Haut und entsprechenden dLN sowie diejenigen mit dem Parasiten zu quantifizieren 19 folgende intradermale Injektion von immunisierenden Dosen von RAS zu interagieren. In diesem Zusammenhang isolierten wir myeloiden Zellen (CD45 + CD11b +) von beiden Geweben und gekennzeichnet Subpopulationen von Interesse durch Mehr = parametrischer Durchflusszytometrie. In Übereinstimmung mit der Immunantwort in der frühen Phase der Haupt Leishmania beschrieben Infektion der Haut 20, die primäre Wirtsantwort Injektion Sporozoiten besteht aus einer aufeinanderfolgenden Einstellung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) , gefolgt von inflammatorischen Monozyten (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) , die auf der Basis von differenti identifiziertal Expression der Ly6G und Ly6C Oberflächenmarker.
Wir beschreiben hier ein Protokoll für die myeloischen Zellen aus der Haut von Mäusen zu isolieren und dLN folgende intradermale Injektion von infizierten Mücke Speicheldrüsen extrahiert Dosen von RAS immunisieren. Reproduzierbare intradermale Injektionen und Gewebeverarbeitung sind wichtige Schritte phänotypischen Veränderungen infiltrieren Zellpopulation innerhalb infizierten Geweben zu quantifizieren. Der Ansatz detailliert unten stellt einen zuverlässigen Assay die Haut und dLN entzündliche Reaktion auf Plasmodium Parasiten zu bewerten und kann auf verschiedene experimentelle Systeme erweitert werden.
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Protocol
und durchgeführt in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften:; Alle Verfahren wurden vom Ausschuss des Pasteur-Institut und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (2012-0015 Vertragsnummer Ethikkommission IDF-Paris 1, Paris, Frankreich) genehmigt.
1. Materialien und Reagenzien
- Verwenden weiblichen Anopheles - Mücken stephensi (Sda500 Stamm) , die auf infizierten Mäusen ernähren 3-5 Tage nach dem Auflaufen und hinten wie zuvor 21 beschrieben.
- Verwenden Parasiten Plasmodium berghei ANKA Klon mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Heat Shock Protein 70 (HSP70) Promotors. Dies ergibt helle Fluoreszenz während des gesamten Lebenszyklus Parasit 22.
- Verwenden weibliche C57BL / 6JRj Mäuse (7 Wochen alt).
HINWEIS: Alle Reagenzien in dem beschriebenen Protokoll verwendet werden , in der T aufgeführt Lage von Materialien / Ausrüstung.
- Zwischen 18-25 Tage nach dem infektiösen Blutmehl, sammeln und kalt betäuben Stechmücken in einen 15 - ml - Röhrchen auf Eis , wie zuvor 21 beschrieben. übertragen Sie sie vorsichtig auf eine Petrischale durch das Rohr zu invertieren. Pflegen Sie die Insekten auf Eis und entlarven die Mücken zu einer 12 krad Dosis von γ- oder Röntgenbestrahlung.
- Isolieren abgeschwächten Sporozoiten aus bestrahlten Moskitospeicheldrüsen , wie zuvor beschrieben 21. Sammeln infizierten Speicheldrüsen in einem kleinen Volumen (etwa 15 ul) 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis und sanft zerdrücken sie Sporozoiten freizusetzen.
HINWEIS: Die Injektion einer stark konzentrierten Parasitensuspension in einem kleinen Volumen kritisch, es ist daher wesentlich, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von einer hohen Anzahl von vorgewählten gut infizierten Mücken zu ernten, wie durch ihre robuste ExpressionGrün-Fluoreszenz. - Filtern Sie die Sporozoiten-Suspension durch eine 35 & mgr; m Zellsieb Kappe angepasst auf eine niedrige Adhäsion 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu beseitigen, um Klumpen und Moskito Schutt.
- Zählen Sie die Gesamtzahl der isolierten Sporozoiten wie zuvor 21 beschrieben und stellen Sie die Konzentration der Parasiten Suspension mit kaltem 1x DPBS 83.000 Sporozoiten / ul zu erhalten. Lagern Sie die Parasiten auf Eis, während die nächsten Schritte fort.
- Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Speicheldrüsen von nicht infizierten Moskitos, die als Negativkontrolle verwendet werden und verarbeiten, um die Probe wie in den Schritten 2.2 und 2.3. Verdünne die Probe wie oben angegeben ähnliche Konzentration der Speicheldrüsenextrakten in der Suspension zu erhalten.
HINWEIS: Sporozoiten können für maximal 2 Stunden auf Eis gelagert werden. Allerdings, im Idealfall sind sie innerhalb einer Stunde eingespritzt, nachdem die Speicheldrüsen zerdrücken.
3. Die Injektion von Sporozoiten in die Dermal Layer des Ohres
- Anästhesieren Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (50 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) -Mischung. Warten 5-8 min für die Maus in einen Zustand der Bewusstlosigkeit sein und gelten Augensalbe für die Augen kornealen Austrocknen zu verhindern. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch eine sanfte Zehe Prise an beiden hinteren Füße durchführen.
HINWEIS: Die Dosis der Anästhesie dauert weniger als 20 Minuten, so dass die nächsten Schritte müssen schnell ausgeführt werden. - Stabilisieren Sie die Ohrmuschel der Maus durch die Bauchseite mit durchsichtigem Klebeband Befestigung zuvor unter einem Stereomikroskop (1A) angeordnet. Drücken Sie vorsichtig die Ohrschädigung des Gefäßsystems zu vermeiden.
- Legen Sie eine 10 ul Spritze / 35 Gauge abgeschrägte Nadel mit 0,6 ul resuspendiert Parasiten 10.
- Liefern den Sporozoiten - Suspension in 4 Injektionsstellen (0,15 & mgr; l pro Stelle) durch vorsichtiges die Nadel auf der Rückenseite des Ohres (1A) Einsetzen unter der Epidermis, mitdie Schräge nach oben, Pflege keine Blutgefäße zu vermeiden,. Erlauben die Nadel in der Dermis zu verbleiben einige sec Rückfluss des Injektats zu verhindern, bevor es entfernt wird. Beobachten einer Charakteristik papule an jeder Injektionsstelle am Ende des Verfahrens (1B und 1C).
- Nach der Injektion entfernen Sie vorsichtig das Ohr vom Band.
- Spritzen Sie das kontralaterale Ohr mit der gleichen Dosis von Parasiten durch die Schritte 3,2-3,4 folgen.
- Injizieren Sie 2 zusätzliche Mäuse entweder mit 0,6 ul 1x DPBS oder 0,6 ul 1x DPBS + Speicheldrüsenextrakt von nicht infizierten Mücken, um die Entzündungsreaktion zu bewerten allein durch die Injektion vermittelt und die Ablagerung von Moskitomaterial in der Dermis.
- Überwachen Sie die Maus aus der Narkose, bevor es wieder in den Käfig legen.
HINWEIS: Die richtige Sporozoiten - Ablagerung in der Haut kann durch Fluoreszenzmikroskopie (2A und 2B überwacht werden), Wobei die Maus previsously 23 beschrieben , hergestellt.
4. Haut und ableitenden Lymphknoten Dissektion
- Bereiten Standardmedium (SM), wie folgt: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), ergänzt mit 400 U / ml Kollagenase und 50 ug / ml Deoxyribonuclease (DNase) .
- Bereiten Sie zwei 6-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten auf Eis mit 4,5 ml SM + 70 & mgr; m Zellsieb pro Vertiefung für dLN Proben (Tafel A) und 4,5 ml SM pro Vertiefung für Hautproben (Tafel B).
- Zum gewünschten Zeitpunkt folgende Sporozoiten Inokulation betäuben tief mit der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (125 mg / kg) / Xylazin (12,5 mg / kg) Mischung vor Zervikaldislokation. Stellen Sie sicher, dass die Maus Zeichen der klinischen Tod demonstriert und die Präparation sofort beginnen.
HINWEIS: Die Kinetik der myeloiden Zellrekrutierung können zu verschiedenen Zeiten nach inj sucht werdenection (dh 2 Stunden, 4 Stunden und 24 Stunden , wie zuvor 14 beschrieben). - Desinfizieren des beimpften Ohr und den entsprechenden Halsbereich mit 70% Ethanol, um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren.
- Mit einer sterilen Schere und Pinzette, sezieren aseptisch das proximale Ohrmuschel dLN ohne das umgebende Fett zu sammeln. Führen Sie einen ersten Einschnitt in der jugulo-carotidian Sulcus und entfernen Sie die Haare aus dem Operationsfeld. Dehnen Sie den Schnitt mit 2 Zange die dLN auszusetzen, die im Vergleich zu dem umgebenden Gewebe gräulich erscheint.
- Pinch das Bindegewebe vorsichtig auf der Oberseite des dLN mit einer Pinzette ihre Entfernung zu erleichtern. Extrahieren Sie die dLN durch eine Zange unterhalb des lymphatischen Gewebes platzieren (3A und 3B). Legen Sie die dLN in einer Vertiefung mit 4,5 ml SM + 70 & mgr; m Zellsieb (Tafel A).
- Ernten Sie die gesamte beimpft Ohr mit einer sterilen scharfen Schere und Pinzette (4A). separaßen die dorsalen und ventralen Aspekte des Ohres durch Kneifen und Beabstanden den Schnitt mit zwei Zangenenden (4B - 4E). Legen Sie sie in einen Brunnen, die 4,5 ml SM (Tafel B) dafür, dass beide Gewebe vollständig in das Medium eingetaucht.
HINWEIS: Um die Zuverlässigkeit des Experiments zu verbessern und die Anzahl der Zellen von Interesse zu erhöhen, Pool 2 injiziert Ohren oder 2 DLNs aus der gleichen Maus pro Probe. - Ernte und Prozess parallel die Ohren und DLNs der Mäuse geimpft mit entweder 1x DPBS oder Speicheldrüsenextrakten. Fügen Sie zwei zusätzliche Ohr und Lymphknoten von einer naiven Maus geerntet Proben für negative und Einzelfärbung Kompensationssteuerungen.
5. Zellisolierung aus Lymphknoten
- Inkubieren der Lymphknoten (Tafel A) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 15 min unter leichtem Schütteln. Zugabe von 10 mM final Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Vertiefung zu neutralisieren Kollagenase und DNase activitäten. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis.
- Dissoziieren Lymphknoten das obere Ende eines 5 ml Spritzenkolben verwendet. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt.
- Spülen Sie das Zellsieb zweimal mit 500 & mgr; l 1x DPBS + 2% fötales Rinderserum (FBS) + 2 mM EDTA. Übertragen gesamte Volumen der gut in einem 15-ml-Tube.
- Spülen Sie die gut zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 15-ml-Tube. Halten Sie Röhrchen auf Eis.
6. Zellisolierung aus Haut des Ohres
- Inkubieren der Ohr Blättchen (Tafel B) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
HINWEIS: Nach 20 Minuten Inkubation, schneiden Sie die Ohr Faltblätter mit einer Schere in kleine Stücke Gewebe Verdauung und legte die Probe zurück in den Inkubator für die restlichen 40 min zu erleichtern. Einzelne Zellen können in dem Medium am Ende der Inkubationszeit beobachtet werden. - In 10 mM final EDTA pro Vertiefung Kollagenase und DNase Aktivitäten zu neutralisieren. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis.
- Übertragen Sie die Ohrgewebefragmente und das gesamte Volumen des Mediums in ein neues und ein 70 & mgr; m Zelle Sieb mit einer 1 ml Pipette enthält. Schneiden Sie 2 bis 3 mm vom Ende der Spitze der Ohrgewebefragmente leichter zu sammeln.
- Ohrgewebefragmente mit dem oberen Ende eines 5 ml Spritzenkolben dissoziieren. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt.
- Spülen Sie die Zelle strainers zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Übertragen, das gesamte Volumen der Vertiefung in eine 50 ml-Röhre durch einen 70 & mgr; m Zellsieb.
- Spülen Sie die gut mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 50-ml-Tube. Halten Sie das Röhrchen auf Eis.
HINWEIS: Die verschiedenen Schritte gesamten Zellen aus der Haut und dLN Geweben in Figur 5 zusammengefaßt sind , zu isolieren.
- Zentrifugieren Sie die Haut und dLN Proben für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Sammeln ein kleines Volumen jeder Probe die Gesamtanzahl von Zellen aus der Haut und dLN unter Verwendung eines Hämozytometers getrennt zu zählen. In 0,04% Trypanblau die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen.
8. Die Blockierung der Non Antigen-spezifische Bindung
- Werden 10 & mgr; g / ml unmarkiertes CD16 / CD32 Fc-block-Antikörper. Inkubiere 20 Minuten bei 4 ° C (kann länger gehen).
- 2 ml kaltem DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und halten Sie die Proben auf Eis.
9. Die Färbung der Haut und des Lymph Node myeloischen Zellen
- Inkubieren zuvor blockierten Skin und dLN isolierten Zellen mit Live / Dead tracker (dh 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI), anti-CD45 und anti-CD11b spezifischen Antikörper.
Hinweise: Damit können die myeloischer Zell - Subpopulationen von Interesse, vor allem seltene, CD45 + Zellen und Lymphozyten bzw. von der Haut oder von der dLN von magnetischen Kügelchen erleichternde Zellsortierung verarmt gereinigt werden , um zu bereichern. Da die meisten der von der dLN isolierten Zellen sind CD45 +, die Verwendung von anti-CD45 ist nicht zwingend. Andere Marker können myeloischer Zell-Subpopulationen von Interesse zu identifizieren durch positive oder negative Anschnitts Strategie einbezogen werden. In diesem Protokoll werden die myeloische in der dLN rekrutierten Zellen durch den Ausschluss CD8a + Zellen angereichert wurden (die gesamte T - Zell - Fach unter Verwendung von Anti-CD3 - spezifischen Antikörper gezielt werden kann). - Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. In 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, Zentrifuge die Probe 5 min bei 450 × g bei 4 ° C und entsorgen Sie die Supernatant. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
- Resuspendieren der Proben mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Übertragen Sie das gesamte Volumen in einem FACS-Röhrchen durch ein 35 & mgr; m Zelle Sieb. Spülen Sie den Filter mit 100 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer. Tor leben Einzelzellen (DAPI -, FSC-W) abgestorbenen Zellen und Dubletten auszuschließen. Plot CD45 + CD11b + Ereignisse für die Haut (6A) und (CD45 +) CD8a - CD11b + Veranstaltungen für die dLN (6B).
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Representative Results
Wir haben kürzlich gezeigt , dass die Nadel-Spritze Injektion von immunisierenden Dosen von P. berghei Sporozoiten in die Haut von Mäusen eine sukzessive Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten , gefolgt von inflammatorischen Monozyten in der Haut und dLN 19 induziert. Das Protokoll Abschnitt oben beschriebenen Verfahrensdetails verwendet , um erfolgreich Live - myeloischen Zellen aus beiden Geweben nach mehrfachen Injektionen von großen Anzahl von Sporozoiten in den Ohr Dermis (Abbildungen 1 und 2) zu isolieren. Innerhalb der ersten 24 h der dLN (Abbildung 3) und die Hauteinstichstelle (4) , wurden isoliert und wie in Figur 5 zusammengefaßt Zytometrie die zelluläre Infiltration durch multi-parametrischer Fluss zu analysieren. Insgesamt erlaubt diese Technik uns einen Durchschnitt 10 4 CD45 + CD11b + und 2.10 4 CD11b + Live - Einzelzellen zu isolierenfür die Haut und dLN sind. Die annehmbare Lebensfähigkeit von nicht-Debris einzelnen Zellen lagen im Bereich von 40-70% für die Haut und 70-90% für die dLN. Wie in 6 gezeigt, die Frequenz von myeloischen Zellen in der Haut (CD45 + CD11b +) und die dLN - erhöht die folgende (CD8a CD11b +) stark intradermale Injektion von RAS im Vergleich zu nicht-infizierten Mäusen.
Abbildung 1: I Injektion von Sporozoiten in das Ohr von Maus ntradermal. (A) Bild intradermale Injektion von Sporozoiten in die Ohrmuschel eines betäubten Maus zeigt. Die Bauchseite des Ohres stabilisiert mit durchsichtigem Klebeband zuvor unter einem Binokular platziert. Die Nadel wird auf der dorsalen Seite des Ohres sorgfältig eingeführt, unter der Epidermis, mit der Abschrägung nach oben. (B - CBilder) , um die dorsale Seite der Ohrmuschel vor (B) und nach (C) intradermale Injektion von 0,1-0,2 & mgr; l der Parasitensuspension zeigt. Ein charakteristisches Papel (schwarzer Pfeil) ist erkennbar an der Injektionsstelle am Ende der Operation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 2: Imaging von Sporozoiten abgeschiedener im Ohr Dermis von Maus (A) Fluoreszenzmikroskopie RAS zeigt , die von der Injektionsstelle Migration in der Mäusehaut 15 min nach der Injektion (Maßstabsbalken (durch gestrichelte Linien angedeutet) = 60 & mgr; m; 10X Vergrößerung). Der Weg der Sporozoiten durch die maximale Intensitätsprojektion des Fluoreszenzsignals repräsentiert. Grüne und rote Fluoreszenz rewirkend zeigen Parasit Position in der Haut zu Beginn und nach 10 Sekunden des Erwerbs. (B) Eine stärkere Vergrößerung von RAS (grün) injiziert in die Haut (Maßstabsbalken = 20 & mgr; m; 25X Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: ableitenden Lymphknoten Processing (A) Bild der Präparation des proximalen Ohrmuschel dLN folgende intradermale Injektion von Evans - Blau zu Demonstrationszwecken zeigt.. Nach zervikale Dislokation der Maus, der Hals mit 70% Ethanol desinfiziert. Ein erster Einschnitt in die Vena-Karotis-Bereich mit einer scharfen Schere gemacht und die Haut wird vom Operationsfeld entfernt. Der Schnitt wird mit zwei Zangen gestreckt, um die dLN zu machen, die gr erscheintAyish im Vergleich zu dem umgebenden Gewebe. Das Bindegewebe werden dann mit einer Pinzette an der Oberseite des dLN und progressiv von ihr getrennt sorgfältig eingeklemmt. Schließlich wird die dLN extrahiert, indem eine Zange unterhalb des lymphatischen Gewebes platzieren. (B) Bild des extrahierten dLN in einem Tropfen PBS zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Ear - Haut Verarbeitungs Bilder die aufeinanderfolgenden Schritte zeigt , die beimpft Ohr zu verarbeiten. (A) Nach dem Genickbruch der Maus wird das Ohr mit 70% Ethanol desinfiziert und entfernt mit einer sterilen scharfen Schere und Pinzette. (B - D) Die dorsalen und ventralen Aspekte des Ohres werden durch leicht getrennt Kneifen und sabgesehen Schnitt Pacing endet mit zwei Zangen. (E) Bild , um die dorsalen und ventralen Aspekte des Ohres vor enzymatische Behandlung zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:.. Protokoll Zusammenfassung Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte gesamten Zellen aus der Haut und dLN Gewebe zu isolieren Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: myeloischen Zellpopulation isoliert von der Ohrhaut und dem proximalen dLN Repräsentative FACS Plots zeigt das.Gating - Strategie , um die myeloische Fach in der Haut (A) und der dLN (B) zu analysieren. CD45 + CD11b + und CD8a - CD11b + Zellen wurden für die Haut und dLN jeweils auf das gesamte Lebend- Singulett Ereignisse gated. Für jede Bedingung 5 x 10 5 Ereignisse wurden insgesamt erworben (2 Ohren und 2 dLN gepoolt pro Probe). Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In der Perspektive von großen Impfung von Menschen eine ganze Sporozoiten - Impfstoff gegen Malaria verwendet, einer der wichtigsten Herausforderungen zu überwinden , ist es , optimierte Routen und Methoden der Parasit Verabreichung entwickeln erfolgreiche Immunisierung und Schutz 24,25 zu gewährleisten. Beim Menschen hat die Bewertung der Schutzwirkung vermittelt durch lebende , abgeschwächte Parasiten (LAP) nach Natur Mücke durchgeführt worden beißt 2 sowie intradermale, subkutane 25,26 und IV Immunisierungen 27. Wie in 28 in Nagetieren berichtet und nicht-menschlichen Primaten 25, IV Verabreichung von LAP induziert stärker schützende Immunantworten im Vergleich zu den oben genannten Routen. Dennoch bleibt nicht IV Verabreichungswege mit Nadel und Spritze noch besser geeignet für den menschlichen Massen-Impfung und die Anstrengungen derzeit unternommen werden, um ihre Schutzwirkung zu optimieren.
Jüngste Studien in Mäusen zeigen,d, insbesondere im Fall des ID-Route, dass die Abscheidung einer kleinen Volumen Sporozoiten Suspension (Bereich von 1 & mgr; l) in mehreren Injektionsstellen (4 Punkte) signifikant erhöht Parasiten Infektiosität im Vergleich zu einer einzigen Beimpfung von Parasiten in größeren Volumina verdünnt (50 ul) 24. In unserem Experimentalsystem (C57BL / 6 - Maus - P. berghei), einen vollständigen Schutz wurde nach mehrfacher Injektionen im Ohr Dermis von hochkonzentrierten Suspension von Parasiten (50.000 RAS in 0,6 ul, 4 Injektionsstellen) erreicht 19. In diesem Zusammenhang haben wir die oben beschriebenen Protokoll genauer die lokale Immunantwort des Wirts zu immunisierenden Dosen von RAS zu analysieren , die uns zwei wichtige myeloischen Zelluntergruppen in der Haut und dLN als Reaktion auf den Parasiten 19 rekrutiert zu identifizieren erlaubt.
Multi-Parameterfluss ermöglicht cytometry genaue Identifizierung und Quantifizierung von Immunzellveränderungen im Zusammenhang mit der Wirtsantwortauf eine Infektion 19,20. Isolierung von großen Anzahl von lebensfähigen Zellen ist daher kritisch reproduzierbaren phänotypische Analyse durchzuführen. Zu diesem Zweck muß die Enzymkonzentration und die Dauer der Gewebeverdauungs optimiert werden. Tatsächlich kann niedrige Konzentration von Enzymen oder unzureichende Inkubationszeit mit geringer Ausbeute von Zellen zu einer unvollständigen Verdauung führen , während längere Gewebe Verdauung 29 zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen und Änderung von Zelloberflächen - Antigen - Expression führen kann. Dennoch etablierte Protokolle Kollagenase Behandlung verwendet haben auf der Nachweisbarkeit von relevanten Oberflächenmoleküle häufig für phänotypische Analysen 30 verwendet marginale Auswirkungen haben gezeigt.
Unter den verschiedenen Parametern, die die Qualität der Zellisolierung zu optimieren, die Trennung des dorsalen und ventralen Abschnitte der Ohrhaut ist wichtig, da es die Kollagenase / DNAse ermöglicht die Dermis gelangen. Darüber hinaus zerkleinern die Haut in kleineStücke vergrößert die Fläche Oberfläche der Enzyme zugänglich, daher kürzere Dauer der Verdauung zu ermöglichen. Schließlich hilft die Verwendung von mechanischen Dissoziation für die Ausbeute in Zellzahl zu erhöhen, sowohl die Haut und dLN. Jedoch kann eine übermäßige Dissoziation zusätzlichen Stress verursachen, die sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken könnte.
Wir bevorzugten Erwerb von lebenden Zellen, da Fixierung suboptimal Färbung führt, Unterscheidung von seltenen positive Ereignisse von Interesse zu verkomplizieren (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus war die Unterscheidung von toten Zellen problematischer. In Fällen, in denen Zellfixierung erforderlich ist, würden wir die Verwendung von LIVE / DEAD fixierbar tote Zelle Flecken vor.
Unter Verwendung des definierten Protokoll, wir erfolgreich isoliert infiltrierenden myeloischen Zellen in die Haut und dLN in Reaktion auf Parasiten Injektion (6A und B). Wir erhalten in der Regel eine höhere tragfähige Einzelzellen aus dem dLN (70-90%) im Vergleich zu denHaut (40-70%). Dieser Unterschied kann durch die längere Inkubationszeit für eine effiziente enzymatische Verdauung zusammen mit weiteren Schritten der mechanischen Dissoziation zu isolieren Hautzellen (Hautschichtentrennung, zerkleinern und stärker Maischen) erforderlich erklärt werden.
Schließlich ist ein wichtiger Parameter zu berücksichtigen , wenn die Host - Reaktion auf ID Injektion von Sporozoiten Analyse ist der Grad der Entzündung , die durch beide Insertionsnadelhalter induziert und Moskitospeicheldrüsenextrakt Ablagerung in der Haut 19,20. Wir schlagen daher zusätzliche Mäuse injiziert entweder mit 1x PBS allein oder Speicheldrüsen-Extrakte aus der gleichen Anzahl von nicht-infizierten Mücken, die Immunantwort spezifisch durch den Parasiten induziert zu bewerten. Insgesamt empfehlen wir infizierten Moskitos mit hoher Parasitenbelastung in den Speicheldrüsen zu sezieren und den Parasiten Suspension zu filtern, um die Menge von Moskitomaterial zu begrenzen, die in der Haut abgeschieden werden.
ichn Zusammenfassung, die Isolierung von myeloischen Zellen von der Haut und dLN durch das beschriebene Protokoll stellt einen zuverlässigen Assay dynamische zelluläre Veränderungen während der Entzündungsreaktion auf Plasmodium - Infektion zu bewerten und kann auf andere Krankheitserreger in die Haut des Wirts übertragen verlängert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Patricia Baldacci, Vanessa lagal und Sabine Thiberge für das kritische Lesen, Irina Dobrescu und Sabine Thiberge um Hilfe in Bildern und Pauline Formaglio für den Unterricht in - vivo - Bildgebung von Sporozoiten - Motilität in der Mäusehaut nehmen. Wir möchten auch Marek Szatanik und das Zentrum für Produktion und Infektion von Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) für Mückenzucht zu danken. Diese Studie wurde von der AXA Research Fund und Mittel aus dem Laboratoire d'Excellence "Integrative Biologie der Emerging Infectious Diseases" unterstützt (Förder-Nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
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