Abstract
Malaria infectie begint wanneer de sporozoieten stadium van Plasmodium wordt geïnoculeerd in de huid van een zoogdiergastheer door een muggenbeet. De zeer beweeglijk parasiet niet alleen bereikt de lever hepatocyten binnen te vallen en te transformeren in erytrocyten-infectieuze vorm. Migreert ook in de huid en de proximale lymfeklieren afvoer de injectieplaats, waar het kan worden herkend en afgebroken door bewoner en / of gerekruteerde myeloïde cellen. Intravitale beeldvorming meldde de vroege werving van helder fluorescente Lys-GFP positieve leukocyten in de huid en de interacties tussen sporozoieten en CD11c + cellen in de drainerende lymfeklier. We presenteren hier een efficiënte procedure om te herstellen, te identificeren en op te sommen de myeloïde cel subsets die worden gerekruteerd om de muis huid en drainerende lymfeklier na intradermale injectie van immuniseren doses van sporozoieten in een muismodel. Fenotypische karakterisering met behulp van multi-parametrische stroom levert cytometrieeen betrouwbare test om vroege dynamische cellulaire veranderingen tijdens ontstekingsreactie Plasmodium infectie te beoordelen.
Introduction
Malaria is een van de dodelijkste besmettelijke ziekten in de wereld, het doden van meer dan een half miljoen mensen per jaar. Infectie door Plasmodium, de veroorzaker van de ziekte, begint met een pre-erytrocytaire (PE) fase. Tijdens deze fase sporozoieten geïnjecteerd in de gastheer huid door een vrouwelijke Anophelinen mug bereikt de lever via de bloedstroom en differentiëren in hepatocyten in de parasiet vormen die rode bloedcellen infecteren, waardoor de symptomen van de ziekte.
De PE van Plasmodium vormen een bevoorrechte doelwit voor anti-malaria vaccinatie. Sterker nog, levende verzwakte vaccins tegen deze fasen, zoals straling verzwakt sporozoieten (RAS), hebben genetisch gearresteerd parasieten (GAP) of chemoprofylaxe en sporozoieten (CPS) hun vermogen om zowel knaagdieren en menselijke gastheren 1-9 beschermen aangetoond. In het knaagdier model meeste vaccinatiestudies uitgevoerd met gebruikmaking intraveneuze immunisatie, De gouden standaard op het gebied van beschermende werkzaamheid. Echter, de beschrijving van een skin podium en het belang van de huid geassocieerd drainerende lymfeklier (DLN) in het uitlokken van de bescherming van onze perceptie van de PE-fase veranderd en benadrukte het belang van de intradermale route van injectie. Intravitale beeldvorming van P. berghei sporozoieten geïnjecteerd in de huid van knaagdieren heeft aangetoond dat slechts ~ 25% van het inoculum de lever via de bloedbaan bereikt. De resterende 75% ~ verdeelt tussen de proximale DLN (~ 15%) en de huid (~ 50%) 10,11, waarbij een klein deel kan transformeren en in leven blijven wekenlang in huidcellen 12,13. Bovendien latere studies beschreven dat de oprichting van effectieve beschermende immuniteit na intradermale immunisatie vindt vooral plaats in de huid-DLN, waar de parasiet specifieke CD8 + T-cellen worden geactiveerd, en slechts marginaal in de milt of lever-DLN 14,15.
Terwijlde meeste studies hebben zich geconcentreerd op de karakterisering van de effectorcellen betrokken bij de totstandkoming van beschermende immune respons, veel minder bekend over het lot van levende verzwakte parasieten geïnjecteerd in de huid, met name hun interactie met het aangeboren immuunsysteem. Vooral karakterisatie van antigeen presenterende cellen die deze parasiet antigen opname, verwerking en presentatie aan CD8 + T-cellen is van groot belang in de wetenschap dat PE antigen overname kan plaatsvinden zowel in de huid en dln compartimenten. Previous intravitale imaging studies beschreven een vroege toestroom van helder fluorescente Lys-GFP positieve cellen in de huid na een besmettelijke mugbeet 16 Terwijl eerder interacties tussen sporozoieten en dendritische cellen in de DLN 10,17 waargenomen. Meer recent is gerapporteerd dat sporozoieten geïnoculeerd in de huid door muggen verhoogt de motiliteit van zowel dendritische en regulatoire T cellen in de huid vanmuizen, terwijl het verlagen aantal antigeen presenterende cellen werd waargenomen in de DLN 18.
Ons doel identificatie en kwantificering nauwkeuriger de leukocyten subsets geworven in de huid en overeenkomstige DLN evenals die interactie met de parasiet na intradermale injectie van immuniserende dosis RAS 19. In deze context, die we myeloïde cellen (CD45 + CD11b +) Beide weefsels kenmerk subpopulaties plaats door multi = parametrische flowcytometrie. Consistent met de immuunrespons in de vroege fase van Leishmania major huidinfectie 20 beschreven, de primaire gastheer respons op injectie sporozoieten bestaat uit een opeenvolgende rekrutering van polymorfonucleaire neutrofielen (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) gevolgd door inflammatoire monocyten (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +), die zijn geïdentificeerd op basis van de verscal expressie van de Ly6G en Ly6C oppervlaktemerkers.
We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen van de muis huid en DLN na intradermale injectie van immuniseren doses van RAS geëxtraheerd uit besmette mug speekselklieren. Reproduceerbare intradermale injecties en de verwerking van het weefsel zijn kritische stappen om fenotypische veranderingen van infiltrerende cel populatie binnen geïnfecteerde weefsels te kwantificeren. De aanpak hieronder verschaft een betrouwbare test om de huid en DLN ontstekingsreactie op Plasmodium parasiet beoordelen en kan worden uitgebreid tot verschillende experimentele systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de commissie van het Instituut Pasteur en door de lokale ethische commissie inzake dierproeven (Ethische commissie IDF-Paris 1, Parijs, Frankrijk; overeenkomst nummer: 2012-0015) en uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften.
1. Materialen en Reagentia
- Gebruik vrouwelijke Anopheles stephensi muggen (Sda500 stam) die zich voeden met besmette muizen 3-5 dagen na de opkomst en achter, zoals eerder 21 beschreven.
- Gebruik parasieten Plasmodium berghei ANKA kloon tot expressie Green Fluorescent Protein (GFP) gen onder controle van de constitutieve hitteshockproteïne 70 (HSP70) promoter. Dit levert heldere fluorescentie gedurende de parasiet levenscyclus 22.
- Gebruik vrouwelijke C57BL / 6JRj muizen (7 weken oud).
LET OP: Alle gebruikt in de beschreven protocol reagentia zijn vermeld in de T staat of Materials / Equipment.
- Tussen 18-25 dagen na de besmettelijke bloedmeel, te verzamelen en koude-verdoven muggen in een 15 ml buis op ijs zoals eerder 21 beschreven. Voorzichtig overbrengen naar een petrischaal van het buisje. Handhaving van de insecten op het ijs en bloot de muggen om een 12 krad dosis van γ- of x-straling.
- Isoleer verzwakte sporozoieten van bestraalde mosquito speekselklieren zoals eerder beschreven 21. Verzamel geïnfecteerde speekselklieren in een klein volume (ongeveer 15 pl) van 1 x Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) op ijs en voorzichtig breken ze sporozoieten vrij.
OPMERKING: De injectie van een sterk geconcentreerde parasiet suspensie in een klein volume kritisch is daarom essentieel om voldoende speekselklieren oogsten uit een groot aantal vooraf goed geïnfecteerde muggen, zoals blijkt uit hun robuuste expressie vangroen-fluorescentie. - Filtreer de sporozoïet suspensie door een 35 um zeef cel dop aangepast om een lage wrijvingscoëfficiënt 1,5 ml microcentrifugebuis om klonten en brokstukken muggen elimineren.
- Tel het aantal sporozoieten geïsoleerd zoals eerder beschreven 21 en dient de concentratie van parasiet suspensie met koud DPBS 1x tot 83.000 sporozoieten / ul te verkrijgen. Bewaar de parasieten op het ijs, terwijl de voortzetting van de volgende stappen.
- Verzamel de equivalente aantal speekselklieren van geïnfecteerde muggen die worden gebruikt als negatieve controle en verwerkt het monster, zoals beschreven in stappen 2,2 en 2,3. Verdun het monster zoals hierboven beschreven met gelijkwaardige concentratie speekselklier extracten in de suspensie te verkrijgen.
OPMERKING: sporozoieten worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 2 uur. Echter, zij idealiter worden geïnjecteerd binnen een uur na het breken van de speekselklieren.
3. Injectie van sporozoieten in de Huid Layer van het Oor
- Verdoven dieren door intraperitoneale injectie van ketamine (50 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) mengsel. 5-8 min wachten voor de muis in een toestand van bewusteloosheid en oftalmische zalf op de ogen om het hoornvlies uitdroogt. Evalueer de diepte van de anesthesie door het uitvoeren van een zachte teen knijpen aan beide achterpoten.
OPMERKING: De dosis anesthesie duurt minder dan 20 minuten, zodat de volgende stappen moet snel gebeuren. - Het stabiliseren van het oor oorschelp van de muis door de vaststelling van de ventrale kant met doorzichtige tape die eerder onder een stereomicroscoop (figuur 1A) geplaatst. Druk de oor om beschadiging van de bloedvaten te voorkomen.
- Laad een 10 ul injectiespuit / 35 gauge schuine naald met 0,6 pi geresuspendeerd parasieten 10.
- Lever de sporozoiet suspensie in 4 injectieplaatsen (0,15 pi per plaats), door voorzichtig de naald aan de rugzijde van het oor (figuur 1A), onder de epidermis, metde schuine kant op, zorg ervoor dat elke bloedvaten te voorkomen. Laat de naald in de lederhuid blijven gedurende een paar seconden om terugstromen van de geïnjecteerde voorkomen voordat verwijderen. Observeren eigenschap papule per injectie plaats aan het einde van de procedure (figuur 1B en 1C).
- Na injectie, verwijder voorzichtig het oor van de tape.
- Spuit de contralaterale oor met dezelfde dosis van parasieten door de stappen 3,2-3,4.
- Injecteer 2 additionele muizen met hetzij 0,6 pl 1x DPBS of 0,6 pl 1x DPBS + speekselklier extract van geïnfecteerde muggen om de ontstekingsreactie gemedieerd door de injectie staan de afzetting van mug materiaal in de dermis te evalueren.
- Monitor muis herstel van de anesthesie voordat u het terug in de kooi.
OPMERKING: De juiste sporozoiet afzetting in de huid kan worden gecontroleerd door fluorescentie microscopie (figuur 2A en 2B), De muis worden bereid zoals previsously 23 beschreven.
4. Huid en aftappen lymfklierdissectie
- Bereid standaard medium (SM) als volgt: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), aangevuld met 400 U / ml collagenase en 50 ug / ml desoxyribonuclease (DNase) .
- Bereid twee 6 putjes met vlakke bodem weefselkweek platen op ijs met 4,5 ml SM + 70 micrometer cel zeef per goed voor DLN monsters (Plate A) en 4,5 ml SM per goed voor de huid monsters (Plate B).
- Op het gewenste tijdstip na inoculatie sporozoieten diep verdoven de muis door intraperitoneale injectie van ketamine (125 mg / kg) / xylazine (12,5 mg / kg) mengsel voorafgaande cervicale dislocatie. Zorg ervoor dat de muis toont tekenen van klinische dood en beginnen met de dissectie onmiddellijk.
OPMERKING: De kinetiek van myeloïde celrecrutering kunnen op verschillende tijdstippen na inj onderzochtectie (bijvoorbeeld 2 uur, 4 uur en 24 uur zoals eerder beschreven 14). - Desinfecteren geïnoculeerde oor en de bijbehorende nek met 70% ethanol om de mogelijkheid van verontreiniging te verminderen.
- Met behulp van een steriele schaar en pincet, aseptisch ontleden de proximale auriculaire DLN zonder het verzamelen van de omliggende vet. Voer een eerste incisie in de jugulo-carotidian sulcus en verwijder de haren uit het operationele veld. Rek de incisie met 2 tang om de DLN dat grijsachtig lijkt in vergelijking met het omringende weefsel bloot.
- Knijp het bindweefsel voorzichtig op de bovenkant van de DLN met tang om de verwijdering te vergemakkelijken. Extraheer de DLN door een tang onder het lymfoïde weefsel (Figuur 3A en 3B). Plaats de DLN in een putje met 4,5 ml SM + 70 micrometer cel zeef (Plate A).
- Oogst de gehele geënt oor met steriele scherpe schaar en pincet (Figuur 4A). Separaten de dorsale en ventrale aspecten van het oor door te knijpen en de afstand van elkaar de cut eindigt met twee tang (Figuur 4B - 4E). Leg ze in een putje met 4,5 ml SM (Plate B) ervoor te zorgen dat beide weefsels worden volledig ondergedompeld in het medium.
Opmerking: Om de betrouwbaarheid van het experiment te verbeteren en het aantal cellen van belang, pool 2 geïnjecteerd aren of 2 DLN's van dezelfde muis per monster. - Oogst en het proces in parallel de oren en DLNS muizen geënt met ofwel 1x DPBS of speekselklier extracten. Inclusief 2 extra oor en lymfeklieren monsters geoogst uit een naïeve muis voor de negatieve en enkele vlekken compensatie controles.
5. Cell Isolatie van lymfeklieren
- Incubeer de lymfeklieren (Plaat A) bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Voeg 10 mM uiteindelijke Ethyleendeniaminetetraacetaat (EDTA) per goed op collagenase en DNase acti neutraliserenteiten. Voer de volgende stappen op het ijs.
- Distantiëren lymfeklieren met het boveneinde van een 5 ml spuit zuiger. Druk in cirkelvormige bewegingen tegen de zeef totdat alles wat overblijft is wit bindweefsel.
- Spoel de cel zeef tweemaal met 500 pl 1x DPBS + 2% foetaal runderserum (FBS) + 2 mM EDTA. Transfer gehele volume van het putje in een 15 ml buis.
- Spoel de goed tweemaal met 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA en breng het volume in de buis van 15 ml. Houd buizen op ijs.
6. Cel Isolatie van de huid van het Oor
- Incubeer het oor folders (Plaat B) bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 1 uur onder zacht schudden.
LET OP: Na 20 min incubatie, snijd het oor folders met een schaar in kleine stukjes weefsel spijsvertering te vergemakkelijken en zet de sample terug in de incubator voor de resterende 40 min. Enkele cellen kunnen worden waargenomen in het medium aan het einde van de incubatietijd. - Voeg 10 mM finale EDTA per goed op collagenase en DNase activiteiten te neutraliseren. Voer de volgende stappen op het ijs.
- Breng het oorweefsel fragmenten en het gehele volume van medium in een nieuw putje dat een 70 urn cel zeef met een 1 ml pipet. Snijd 2-3 mm van het uiteinde van de punt aan het oor weefselfragmenten gemakkelijker te verzamelen.
- Distantiëren oorweefsel fragmenten met het boveneinde van een 5 ml spuit zuiger. Druk in cirkelvormige bewegingen tegen de zeef totdat alles wat overblijft is wit bindweefsel.
- Spoel de cel zeven tweemaal met 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Breng de gehele volume van de put in een 50 ml-buis door een 70 um cel zeef.
- Spoel het goed met 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA en breng het volume in de 50 ml buis. Houd de buis op ijs.
OPMERKING: De verschillende stappen aan totale cellen te isoleren van de huid en DLN weefsels zijn samengevat in Figuur 5.
- Centrifugeer de huid en DLN monsters 5 min bij 450 xg bij 4 ° C en werp de supernatant. Voorzichtig resuspendeer de pellet met 300 pl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Verzamel een klein volume van elk monster aan het totale aantal cellen geïsoleerd uit de huid en DLN behulp van een hemocytometer geteld. Voeg 0,04% trypan blauw aan de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen.
8. Het blokkeren van niet-specifieke antigeen bindende
- Voeg 10 ug / ml ongelabeld CD16 / CD32 Fc-block antilichaam. Incubeer 20 min bij 4 ° C (kan langer gaan).
- Voeg 2 ml koude 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugeer het monster gedurende 5 min bij 450 xg bij 4 ° C en werp de supernatant. Voorzichtig resuspendeer de pellet met 300 pl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA en de monsters op ijs te houden.
9. kleuring van de huid en lymfkliertest myeloïde cellen
- Incubate eerder geblokkeerd skin en DLN geïsoleerde cellen met Live / Dead tracker (bijvoorbeeld 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool of DAPI), anti-CD45 en anti-CD11b antilichamen.
OPMERKINGEN: Om de myeloïde cel subpopulaties plaats, vooral zeldzamen verrijken, CD45 + cellen en lymfocyten worden gezuiverd uit respectievelijk de huid of verarmd van de DLN door magnetische bead faciliterend celsortering. Aangezien de meeste van de cellen geïsoleerd uit de DLN zijn CD45 +, het gebruik van anti-CD45 is niet verplicht. Andere markers kunnen worden opgenomen om myeloïde cel subpopulaties van belang vast te stellen door positieve of negatieve-gating strategie. In dit protocol werden de myeloïde cellen gerekruteerd in de DLN verrijkt met uitzondering CD8a + -cellen (het geheel T-cel compartiment worden gericht door anti-CD3 antilichaam). - Incubeer 30 min bij 4 ° C in het donker. Voeg 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, gecentrifugeerd monster 5 min bij 450 xg bij 4 ° C en werp de supernatant. Herhaal de wasstap tweemaal.
- Resuspendeer de monsters met 300 pl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Breng de gehele volume in een FACS buis door een 35 um cel zeef. Spoel het filter met 100 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Voer het gekleurde cellen in een flowcytometer. Gate wonen enkele cellen (DAPI -, FSC-W) om dode cellen en wambuizen uit te sluiten. Plot CD45 + CD11b + evenementen voor de huid (figuur 6A) en (CD45 +) CD8a - CD11b + evenementen voor de DLN (figuur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben onlangs aangetoond dat naaldloze injectiespuit injectie van immuniserende dosis P. berghei sporozoieten in de muis huid induceert een opeenvolgende rekrutering van polymorfonucleaire neutrofielen gevolgd door inflammatoire monocyten in de huid en dln 19. De afdeling protocol hierboven beschreven welke procedure voor levende myeloïde cellen uit beide weefsels na meervoudige injecties groot aantal sporozoieten in het oor dermis succes isoleren (figuren 1 en 2). Binnen de eerste 24 uur, de DLN (figuur 3) en de huid injectieplaats (Figuur 4) werden geïsoleerd en verwerkt zoals samengevat in figuur 5 om de cellulaire infiltratie door multi-parametrische flowcytometrie geanalyseerd. Over het algemeen is deze techniek liet ons toe om te isoleren gemiddeld 10 4 CD45 + CD11b + en 2.10 4 CD11b + levend enkele cellenvoor respectievelijk de huid en DLN. De aanvaardbare levensvatbaarheid van niet-vuil enkele cellen varieerde 40-70% voor de huid en 70-90% van de DLN. Zoals getoond in figuur 6, de frequentie van myeloïde cellen in de huid (CD45 + CD11b +) en de DLN - sterk (CD8a CD11b +) verhoogt na intradermale injectie van RAS vergelijking met niet-geïnfecteerde muizen.
Figuur 1: Ik ntradermal Injectie van sporozoieten in het oor van de muis. (A) Beeld dat intradermale injectie van sporozoieten in het oor oorschelp van een verdoofde muis. De ventrale zijde van het oor wordt gestabiliseerd met doorzichtige tape die eerder onder een dissectie microscoop geplaatst. De naald wordt zorgvuldig toegevoegd aan de rugzijde van het oor, onder de epidermis, met de schuine omhoog. (B - C) Foto's die de dorsale zijde van het oor oorschelp stand (B) en na (C) intradermale injectie van 0,1-0,2 pl parasiet suspensie. Een kenmerk papule (zwarte pijl) is waarneembaar op de injectieplaats aan het einde van de operatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2: beeldvorming van sporozoieten afgezet in het oor Dermis van muis (A) Fluorescentie microscopie toont RAS migreren van de injectieplaats (aangegeven door de onderbroken lijnen) in de muizenhuid 15 min na injectie (Schaal bar = 60 pm; 10X vergroting). Het pad van sporozoieten wordt voorgesteld door de maximale intensiteit projectie van het fluorescentiesignaal. Groene en rode fluorescentie repectievelijk tonen parasiet positie in de huid aan het begin en na 10 sec van de overname. (B) Hogere vergroting van RAS (groen) geïnjecteerd in de huid (Schaal bar = 20 urn; 25X vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Aftappen lymfkliertest Processing (A) Foto toont de dissectie van de proximale auriculaire DLN na intradermale injectie van Evans blauw voor demonstratiedoeleinden.. Na cervicale dislocatie van de muis, wordt de hals gedesinfecteerd met 70% ethanol. Een eerste incisie gemaakt in de halsader-halsslagader met scherpe schaar en de huid wordt verwijderd uit de operationele veld verwijderd. De incisie wordt gestrekt met 2 tang om de DLN dat gr weergegeven blootAyish vergelijking met het omringende weefsel. De bindweefsel vervolgens voorzichtig met een pincet geknepen bovenop de DLN geleidelijk ervan gescheiden. Tenslotte de DLN wordt geëxtraheerd door een tang onder het lymfeweefsel. (B) Foto toont de uitgepakte DLN in een daling van PBS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Oorhuid verwerkingsbeelden toont de opeenvolgende stappen voor het geënte oor verwerken. (A) Na het breken van de nek van de muis, het oor wordt gedesinfecteerd met 70% ethanol en verwijderd met steriele scherpe schaar en pincet. (B - D) De dorsale en ventrale aspecten van het oor zijn licht van elkaar gescheiden door knijpen en spacing apart de cut eindigt met twee tang. (E) Afbeelding van de dorsale en ventrale aspecten van het oor voorafgaande enzymatische behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:.. Protocol Samenvatting Schematische weergave van de belangrijkste stappen om de totale cellen van de huid en DLN weefsels te isoleren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: myeloïde cellen bevolking geïsoleerd van het Oor van de huid en het proximale DLN vertegenwoordiger FACS plots met de.gating strategie om de myeloïde compartiment in de huid (A) en de DLN (B) analyse. CD45 + CD11b + en CD8a - CD11b + cellen werden gated op de totale live-singlet evenementen voor respectievelijk de huid en DLN. Voor elke conditie, werden 5 x 10 5 totale gebeurtenissen verworven (2 oren en 2 DLN samengevoegd per monster). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het perspectief van grootschalige vaccinatie van mensen met een hele sporozoite malariavaccin, een van de belangrijkste uitdagingen te overwinnen is om routes en werkwijzen van toediening parasiet ontwikkelen om succesvolle immunisatie en bescherming 24,25 waarborgen. Bij mensen is de evaluatie van de beschermende werkzaamheid gemedieerd door levende verzwakte parasieten (LAP) uitgevoerd volgende natuurlijke muggenbeten 2, en intradermale, subcutane 25,26 en IV immunisaties 27. Zoals gemeld in 28 knaagdieren en primaten 25, IV toediening van LAP induceert sterkere beschermende immuunresponsen in vergelijking met de bovengenoemde trajecten. Toch non-IV toedieningswijzen gebruik van naald en spuit nog steeds meer geschikt voor de massale vaccinatie van de mens en de inspanningen worden momenteel gemaakt om hun beschermende werking te optimaliseren.
Recente studies uitgevoerd bij muizen tonend, vooral in het geval van de ID route, dat de afzetting van een kleine hoeveelheid sporozoiet suspensie (bereik van 1 pi) in meerdere injectieplaatsen (4 punten) aanzienlijk toegenomen parasiet infectiviteit tegenover één inoculatie van parasieten verdund in grotere volumes (50 pl) 24. In ons experimenteel systeem (C57BL / 6 muizen - P. berghei), werd volledige bescherming bereikt na meerdere injecties in het oor dermis van sterk geconcentreerde parasieten (50.000 RAS in 0,6 pl, 4 injectieplaatsen) 19. In deze context hebben we de bovenbeschreven nauwkeuriger analyseren de lokale gastheer immuunrespons op immuniserende dosis RAS die ons de 2 belangrijkste myeloïde cel subsets gerekruteerd in de huid en DLN identificeren in reactie op de parasiet 19 protocol.
Multi-parametrische stroming cytometrie maakt nauwkeurige identificatie en kwantificering van immuuncellen veranderingen in de context van gastheerreactievoor infectie 19,20. Isolatie grote aantal levensvatbare cellen is daarom cruciaal reproduceerbare fenotypische analyse. Daartoe moet de enzymconcentratie en de duur van weefsel digestie worden geoptimaliseerd. Inderdaad, kan een lage concentratie van enzymen of onvoldoende incubatietijd leiden tot onvolledige vertering met lage opbrengst van cellen, terwijl langdurige weefsel spijsvertering kan leiden tot afname van levensvatbaarheid van de cellen en de wijziging van het celoppervlak antigen expressie 29. Niettemin bleken goed gevestigde protocols gebruikt collagenase behandeling marginale invloed op de detecteerbaarheid van relevante oppervlaktemoleculen veelvuldig bij fenotypische analyses 30 hebben.
Onder de verschillende parameters die de kwaliteit van celisolatie optimaliseren, de scheiding van de dorsale en ventrale gedeelten van de oorhuid essentieel, aangezien het de collagenase / DNAse om de dermis. Bovendien, hakken de huid in kleinestukken vergroot het oppervlak toegankelijk voor de enzymen, daardoor mogelijk kortere spijsvertering. Tenslotte is het gebruik van mechanische dissociatie helpt het rendement in celaantal te verhogen voor zowel de huid als DLN. Echter, overmatige dissociatie extra belasting die een negatieve invloed kunnen hebben op levensvatbaarheid van de cellen veroorzaken.
Wij begunstigden verwerving van levende cellen omdat fixatie leidt tot suboptimale kleuring complicerende onderscheid van zeldzame positieve gebeurtenissen van belang (gegevens niet getoond). Bovendien is de discriminatie van dode cellen was problematischer. In gevallen waarin de cel fixatie nodig is, zouden we het gebruik van LIVE / DEAD opgelapt dode cel vlekken suggereren.
Met het gedefinieerde protocol, we met succes geïsoleerde myeloïde cellen infiltreren in de huid en DLN in reactie op injectie (Figuur 6A en B) parasiet. We meestal hogere levensvatbare enkele cellen te verkrijgen van de DLN (70-90%) in vergelijking met dehuid (40-70%). Dit verschil kan worden verklaard door de langere incubatietijd nodig voor efficiënte enzymatische digestie met aanvullende stappen van mechanische dissociatie tot huidcellen isoleren (huidlaag scheiding, fijnmaken en sterker stampen).
Ten slotte is een belangrijke parameter om rekening te houden bij het analyseren van de gastheer respons op ID injectie van sporozoieten is de graad van inflammatie geïnduceerd door zowel naald inbrengen en muggen speekselklier extract afzetting in de huid 19,20. Wij stellen daarom aanvullende muizen geïnjecteerd met ofwel 1x PBS alleen of speekselklier uittreksels uit hetzelfde aantal niet-geïnfecteerde muggen om de immuunrespons specifiek geïnduceerd door de parasiet te evalueren. Geheel raden wij geïnfecteerde muggen hoge parasitaire belasting ontleden in de speekselklieren en de parasiet suspensie de hoeveelheid muggen materiaal dat in de huid kan worden aangebracht beperken filteren.
ikn samenvatting, de isolatie van myeloïde cellen uit de huid en DLN door de beschreven protocol verschaft een betrouwbare test om dynamische cellulaire veranderingen gedurende ontstekingsreactie Plasmodium infectie beoordelen en kan worden uitgebreid tot andere pathogenen overgebracht op de huid van de gastheer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken Patricia Baldacci, Vanessa Lagal en Sabine Thiberge voor kritisch lezen, Irina Dobrescu en Sabine Thiberge voor hulp bij het maken van foto's en Pauline Formaglio voor het onderwijs in vivo beeldvorming van sporozoiet beweeglijkheid in de muis huid. We willen ook graag Marek Szatanik en het Centrum bedanken voor Productie en Infectie van Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) voor mosquito fokken. Deze studie werd ondersteund door de AXA Research Fund en de middelen van het Laboratoire d'Excellence "Integrative Biology of Emerging Infectious Diseases '(verlenen geen. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
