Abstract
Malaria infektion begynder, når sporozoit fase af Plasmodium inokuleres i huden af en pattedyrvært gennem en myg bide. Den meget bevægelige parasit ikke kun når leveren at invadere hepatocytter og omdanne til erythrocyt-infektiøse formular. Den vandrer også ind i huden og til den proksimale lymfeknude dræne injektionsstedet, hvor det kan blive anerkendt og nedbrydes af hjemmehørende og / eller rekrutteret myeloide celler. Intravital billeddannelse rapporterede tidlig rekruttering af lyst fluorescerende Lys-GFP-positive leukocytter i huden og samspillet mellem sporozoiter og CD11c + celler i drænende lymfeknude. Vi præsenterer her en effektiv procedure for at komme sig, identificere og opregne de myeloide celle delmængder, der er rekrutteret til musen hud og drænende lymfeknude efter intradermal injektion af immunisering doser af sporozoiter i en musemodel. Fænotypisk karakterisering ved hjælp af multi-parametrisk flowcytometri giveren pålidelig analyse for at vurdere tidlige dynamiske cellulære ændringer under inflammatoriske respons på Plasmodium infektion.
Introduction
Malaria er en af de dødeligste infektionssygdomme i verden, dræbte mere end en halv million mennesker om året. Infektion med Plasmodium, den kausale agens af sygdommen, begynder med en pre-erythrocytkoncentrationen (PE) fase. Under denne fase, sporozoiter injiceret i værtens hud ved en kvindelig Anopheline myg når leveren via blodbanen og differentiere inde hepatocytter i parasitten former, der inficerer røde blodceller og forårsage symptomerne på sygdommen.
De PE stadier af Plasmodium udgør et privilegeret mål for anti-malaria vaccination. Faktisk levende svækkede vacciner mod disse faser, såsom stråling svækkede sporozoiter (RAS), har genetisk arresterede parasitter (GAP) eller kemoprofylakse og sporozoiter (CPS) demonstreret deres evne til at beskytte både gnavere og menneskelige værter 1-9. I gnavermodel er de fleste undersøgelser vaccination udføres med anvendelse af intravenøs immunisering, Som er den gyldne standard i form af beskyttende effekt. Imidlertid har beskrivelsen af en hud etape og betydningen af huden-associerede drænende lymfeknude (DLN) fremkalde beskyttelse ændret vores opfattelse af PE-fase og understregede betydningen af intradermal rute for injektion. Intravital billeddannelse af P. berghei sporozoiter injiceres i huden af gnavere har vist, at kun ca. 25% af podestoffet når leveren via blodbanen. De resterende ~ 75% fordeling mellem de proksimale DLN (~ 15%) og huden (~ 50%) 10,11, hvor en lille del kan transformere og forblive i live i uger inde hudceller 12,13. Desuden efterfølgende undersøgelser beskrevet, at etableringen af en effektiv beskyttende immunitet efter intradermal immunisering hovedsageligt foregår i huden-DLN, hvor parasit specifikke CD8 + T-celler aktiveres, og kun marginalt i milten eller leveren-DLN'er 14,15.
Mensde fleste undersøgelser har koncentreret sig om karakterisering af effektorcellerne impliceret i etableringen af beskyttende immunrespons, er langt mindre kendt om skæbne levende svækkede parasitter sprøjtes ind i huden, især deres interaktioner med det medfødte immunsystem. Især karakterisering af antigenpræsenterende celler involveret i parasitantigen optagelse, bearbejdning og præsentation for CD8 + -T-celler er af afgørende betydning, vel vidende at PE-antigen erhvervelse kan forekomme både i huden og DLN rum. Tidligere intravital billeddiagnostiske undersøgelser beskrevet en tidlig tilstrømning af lyst fluorescerende Lys-GFP-positive celler i huden efter en smitsom myggestik 16 mens tidlige interaktioner mellem sporozoiter og dendritiske celler blev observeret i DLN 10,17. For nylig er det blevet rapporteret, at sporozoiter inokuleret i huden af myg øger motiliteten af både dendritiske og regulatoriske T-celler i huden afmus, mens der blev observeret en nedgang antal antigenpræsenterende celler i DLN-18.
Vi havde til formål at identificere og kvantificere mere præcist leukocytundergrupper rekrutteret i huden og tilsvarende DLN såvel som dem interagere med parasitten efter intradermal injektion af immunisering doser af RAS 19. I denne sammenhæng har vi isoleret myeloide celler (CD45 + CD11 +) fra både væv og karakteriseret subpopulationer af interesse ved multi = parametrisk flowcytometri. I overensstemmelse med den immunreaktion, der er beskrevet i den tidlige fase af Leishmania major hudinfektion 20, den primære vært reaktion på sporozoit injektion består af en successiv rekruttering af polymorfonukleære neutrofiler (CD45 + CD11 + Ly6G + Ly6C int) efterfulgt af inflammatoriske monocytter (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +), som er identificeret på baggrund af differential udtryk for de Ly6G og Ly6C overflademarkører.
Vi beskriver her en protokol til isolering myeloide celler fra mus hud og DLN efter intradermal injektion af immunisering doser af RAS udvundet fra inficerede myg spytkirtler. Reproducerbare intradermale injektioner og vævsbehandling er kritiske skridt til at kvantificere fænotypiske ændringer i infiltrerende cellepopulation inden inficerede væv. Den fremgangsmåde er nærmere beskrevet nedenfor tilvejebringer en pålidelig analyse for at vurdere huden og DLN inflammatoriske respons på Plasmodium-parasitten og kan udvides til forskellige eksperimentelle systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af udvalget af Pasteur Instituttet og af den lokale etiske komité om dyreforsøg (Etisk komité IDF-Paris 1, Paris, Frankrig, aftale nummer: 2012-0015) og udført i overensstemmelse med de gældende retningslinjer og regler.
1. Materialer og reagenser
- Brug kvindelige Anopheles stephensi myg (Sda500 stamme), der lever af inficerede mus 3-5 dage efter fremkomsten og bag som tidligere 21 beskrevet.
- Brug parasitter Plasmodium berghei ANKA klon udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) -gen under kontrol af den konstitutive Heat Shock Protein 70 (HSP70) promotor. Dette giver lyse fluorescens hele parasit livscyklus 22.
- Brug kvindelige C57BL / 6JRj mus (7 uger gamle).
BEMÆRK: Alle reagenser, der anvendes i den beskrevne protokol er opført i T stand Materialer / udstyr.
- Mellem 18-25 dage efter det infektiøse blodmel, indsamle og kold-bedøver myg i et 15 ml rør på is som tidligere 21 beskrevet. overføre dem omhyggeligt på en petriskål ved at vende røret. Oprethold insekterne på is og udsætte myg til en 12 krad dosis af γ- eller røntgenstråling.
- Isoler svækkede sporozoiter fra bestrålede mosquito spytkirtler som tidligere beskrevet 21. Saml inficerede spytkirtler i et lille volumen (ca. 15 pi) af 1x Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) på is og forsigtigt knuse dem til at frigive sporozoitter.
BEMÆRK: Injektionen af et stærkt koncentreret parasit suspension i et lille volumen er kritisk, er det derfor vigtigt at høste et tilstrækkeligt antal spytkirtlerne fra et stort antal forud valgte well-inficerede myg, som det fremgår af deres robuste ekspression afgrøn-fluorescens. - Filtrer sporozoit suspensionen gennem en 35 um cellefilter hætte indrettet til en lav adhæsion 1,5 ml mikrocentrifugerør for at fjerne klumper og myg debris.
- Tæl antallet af isolerede sporozoiter som tidligere beskrevet 21 og indstille koncentrationen af parasitten suspension med kold 1x DPBS til opnåelse 83.000 sporozoiter / pl. Opbevar parasitter på is samtidig med de næste skridt.
- Opsaml tilsvarende antal spytkirtler fra inficerede myg, der vil blive anvendt som negativ kontrol og processerer den prøve som beskrevet i trin 2.2 og 2.3. Fortynde prøven som angivet ovenfor for at opnå lignende koncentration af spytkirtelekstrakter i suspensionen.
BEMÆRK: sporozoiter kan opbevares på is i højst 2 timer. Men ideelt de sprøjtes inden for en time efter knusning spytkirtlerne.
3. Injektion af sporozoiter ind i Dermal Layer af Ear
- Bedøver dyr ved intraperitoneal injektion af ketamin (50 mg / kg) / xylazin (5 mg / kg) blanding. Vent 5-8 min for musen til at være i en tilstand af bevidstløshed og anvende oftalmologiske salve til øjnene for at forhindre hornhindens tørring. Evaluere anæstesidybden ved at udføre en blid tå pinch på begge bageste fødder.
BEMÆRK: dosis af anæstesi varer mindre end 20 minutter, så de næste skridt skal ske hurtigt. - Stabiliser øre pinna af musen ved at fastsætte den ventrale side med klar tape tidligere var henført under et stereomikroskop (figur 1A). Tryk forsigtigt øret for at undgå skader på karrene.
- Læg en 10 pi sprøjte / 35 gauge skrå nål med 0,6 ul resuspenderede parasitter 10.
- Levere sporozoit suspension i 4 injektionssteder (0,15 pi per site) ved forsigtigt at indsætte nålen på den dorsale side af øret (figur 1A), under epidermis, medfacet op, tage sig for at undgå blodkar. For at kanylen forblive i dermis for få sekunder for at forhindre tilbagestrømning af injektionsstoffet før den fjernes. Observere en karakteristisk papel på hvert injektionssted ved afslutningen af proceduren (figur 1B og 1C).
- Efter injektion, forsigtigt fjerne øre fra båndet.
- Sprøjt den kontralaterale øre med den samme dosis af parasitter ved at følge trinene 3,2-3,4.
- Injicer 2 yderligere mus med enten 0,6 pi 1x DPBS eller 0,6 pi 1x DPBS + spytkirtel ekstrakt fra ikke-inficerede myg for at vurdere den inflammatoriske reaktion medieret af alene injektionen og aflejringen af myg materiale i dermis.
- Overvåg musen nyttiggørelse fra anæstesi før placere den tilbage i buret.
BEMÆRK: Den korrekte sporozoit aflejring i huden kan overvåges ved fluorescensmikroskopi (Figur 2A og 2B), Idet mus fremstillet som beskrevet previsously 23.
4. Hud og Aftapning lymfeknudedissektion
- Forbered standard medium (SM) som følger: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) suppleret med 400 U / ml collagenase og 50 ug / ml deoxyribonuclease (DNase) .
- Forbered to 6 brønd fladbundede vævsdyrkningsplader på is med 4,5 ml SM + 70 um cellefilter per brønd for DLN prøver (Plate A) og 4,5 ml SM per brønd for hudprøver (ill B).
- Ved det ønskede tidspunkt efter sporozoit inokulation, dybt bedøver musen ved intraperitoneal injektion af ketamin (125 mg / kg) / xylazin (12,5 mg / kg) blandingen inden cervikal dislokation. Sørg for, at musen viser tegn på klinisk død og start dissektion samme.
BEMÆRK: kinetik myeloid celle rekruttering kan undersøges på forskellige tidspunkter efter injfdeling (dvs. 2 timer, 4 timer og 24 timer som tidligere beskrevet 14). - Desinficere inokuleret øre og det tilsvarende halsregionen med 70% ethanol for at reducere muligheden for forurening.
- Med sterile sakse og tænger, aseptisk dissekere den proximale auricular DLN uden at indsamle det omgivende fedt. Udfør en første snit i jugulo-carotidian sulcus og fjern hår fra operationsfeltet. Stræk snittet med 2 pincet til at eksponere DLN der vises grålig forhold til det omgivende væv.
- Klem bindevævet forsigtigt på toppen af DLN med pincet for at lette dens fjernelse. Ekstraher DLN ved at placere en pincet under lymfoide væv (figur 3A og 3B). Placer DLN i en brønd indeholdende 4,5 ml SM + 70 um celle si (Plate A).
- Udnytte hele den inokuleret øre med sterile skarp saks og pincet (figur 4A). separspiste de dorsale og ventrale aspekter af øret ved at knibe og afstand fra hinanden snittet slutter med to pincet (figur 4B - 4E). Læg dem i en brønd indeholdende 4,5 ml SM (Plate B) og sørg begge væv er helt nedsænket i mediet.
BEMÆRK: For at forbedre pålideligheden af eksperimentet og øge antallet af celler af interesse, pool 2 injicerede ører eller 2 DLN'er fra den samme mus per prøve. - Høst og proces parallelt ørerne og DLN'er af mus podet med enten 1x DPBS eller spytkirtelekstrakter. Medtag 2 ekstra øre og lymfeknude prøver høstet fra en naiv mus for negative og enkelt farvning kompensation kontrol.
5. Cell Isolation fra lymfeknuder
- Inkubér lymfeknuder (Plate A) ved 37 ° C + 5% CO2 i 15 minutter under forsigtig omrøring. Der tilsættes 10 mM endelig ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) pr at neutralisere collagenase og DNase Actiteter. Udfør de næste skridt på is.
- Dissociér lymfeknuder bruge den øverste ende af en 5 ml sprøjte stemplet. Tryk i cirkulære bevægelser mod sien indtil alt der er tilbage er hvide bindevæv.
- Skyl cellesigte to gange med 500 pi 1x DPBS + 2% føtalt bovint serum (FBS) + 2 mM EDTA. Overfør hele mængden af brønden i en 15 ml rør.
- Skyl godt to gange med 500 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA og overføre volumenet i 15 ml rør. Hold rør på is.
6. Cell Isolation fra Skin af Ear
- Inkubér øre foldere (ill B) ved 37 ° C + 5% CO2 i 1 time under forsigtig omrøring.
BEMÆRK: Efter 20 minutters inkubation, skære øre foldere med en saks i små stykker for at lette væv fordøjelse og sætte prøven tilbage i inkubatoren for de resterende 40 min. Enkelte celler kan observeres i mediet ved slutningen af inkubationstiden. - Tilsæt 10 mM endelig EDTA per brønd for at neutralisere collagenase og DNase aktiviteter. Udfør de næste skridt på is.
- Overfør øre vævsfragmenter og hele volumen af medium i en ny brønd indeholdende en 70 um cellefilter anvendelse af en 1 ml pipette. Skær 2 til 3 mm fra enden af spidsen til at indsamle øre vævsfragmenter lettere.
- Dissociér øre vævsfragmenter bruge den øverste ende af en 5 ml sprøjte stemplet. Tryk i cirkulære bevægelser mod sien indtil alt der er tilbage er hvide bindevæv.
- Skyl celle sier to gange med 500 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Overfør hele mængden af brønden i en 50 ml-rør gennem en 70 um celle si.
- Skyl grundigt med 500 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA og overføre volumenet i 50 ml rør. Hold røret på is.
BEMÆRK: De forskellige trin til isolering totale celler fra huden og DLN væv er opsummeret i figur 5.
- Centrifugeres huden og DLN prøver i 5 minutter ved 450 xg ved 4 ° C og supernatanten. Forsigtigt pellet resuspenderes med 300 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Indsamle et lille volumen af hver prøve for at tælle det totale antal af celler isoleret fra huden og DLN anvendelse af et hæmocytometer. Tilføj 0,04% trypanblåt for at bestemme cellernes levedygtighed.
8. Blokering af ikke-antigen-specifik binding
- Tilsæt 10 ug / ml umærket CD16 / CD32 Fc-blok-antistof. Inkuber 20 min ved 4 ° C (kan gå længere).
- Tilsæt 2 ml kold 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Centrifugeres prøven i 5 minutter ved 450 xg ved 4 ° C og supernatanten. Forsigtigt pellet resuspenderes med 300 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA og fastholde prøverne på is.
9. Farvning hud og lymfeknuder myeloide celler
- Inkuber tidligere blokeret skin og DLN isolerede celler med Live / Dead tracker (dvs. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol eller DAPI), anti-CD45 og anti-CD11b-specifikke antistoffer.
NOTER: For at berige myeloide celle subpopulationer af interesse, især sjældne dem, CD45 + celler og lymfocytter kan henholdsvis oprenset fra huden eller udtømt fra DLN ved magnetisk perle lette celle sortering. Da de fleste af de celler isoleret fra DLN er CD45 +, brug af anti-CD45 er ikke obligatorisk. Andre markører kan inkluderes for at identificere myeloide celle subpopulationer af interesse ved positiv eller negativ-gating-strategi. I denne protokol, blev myeloide celler rekrutteret i DLN beriget ved at udelukke CD8a + celler (hele T-celle rum kan målrettes ved hjælp af anti-CD3 specifikt antistof). - Inkuber 30 min ved 4 ° C i mørke. Der tilsættes 500 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, centrifugeres prøven i 5 minutter ved 450 xg ved 4 ° C og kasseres supernatant. Gentag vasketrinet to gange.
- Resuspender prøverne med 300 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Overfør hele mængden i en FACS rør gennem en 35 um celle si. Filteret skylles med 100 pi 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA.
- Kør de farvede celler i et flowcytometer. Gate lever enkelte celler (DAPI -, FSC-W) for at udelukke døde celler og dubletter. Plot CD45 + CD11b + begivenheder for huden (figur 6A) og (CD45 +) CD8a - CD11b + begivenheder for DLN (figur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har for nylig vist, at nålen-sprøjte injektion af immuniserende doser af P. berghei sporozoiter i musehud inducerer en successiv rekruttering af polymorfonukleære neutrofiler efterfulgt af inflammatoriske monocytter i huden og DLN 19. Protokollen Afsnit beskrevet ovenfor i detalje, der anvendes med succes isolere levende myeloide celler fra begge væv efter multiple injektioner af store antal sporozoiter i øret dermis (Figur 1 og 2). Inden for den første 24 timer, det DLN (figur 3), og huden på injektionsstedet (figur 4) blev isoleret og forarbejdet som opsummeret i figur 5 for at analysere cellulær infiltration af multi-parametrisk flowcytometri. Samlet set denne teknik tillod os at isolere en gennemsnitlig 10 4 CD45 + CD11 + og 2,10 4 CD11b + levende enkeltcellerfor huden og DLN hhv. Den acceptable levedygtighed ikke-debris enkeltceller varierede fra 40-70% for huden og 70-90% for DLN. Som vist i figur 6, frekvensen af myeloide celler i huden (CD45 + CD11b +) og DLN (CD8a - CD11b +) kraftigt øger efter intradermal injektion af RAS sammenlignet med ikke-inficerede mus.
Figur 1: Jeg ntradermal Injektion af sporozoiter ind i øret af Mouse. (A) Billed viser intradermal injektion af sporozoiter i øret pinna af en bedøvet mus. Den ventrale side af øret er stabiliseret med klar tape tidligere var henført under en dissektionsmikroskop. Nålen er omhyggeligt indsat på den dorsale side af øret, under epidermis, med den skrå kant op. (B - C) Billeder der viser den dorsale side af øret pinna forudgående (B) og efter (C) intradermal injektion af 0,1-0,2 pi parasit suspension. Et karakteristisk papel (sort pil) kan observeres på injektionsstedet i slutningen af operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2: Scanning af sporozoiter deponeret i øret Dermis af Mouse (A) Fluorescens mikroskopi viser RAS migrere fra injektionsstedet (angivet med de stiplede linier) i musen huden 15 min efter injektion (Scale bar = 60 pm; 10X forstørrelse). Stien sporozoiter er repræsenteret ved den maksimale intensitet projektion af det fluorescerende signal. Grøn og rød fluorescens rehenholdsvis viser parasit position i huden i starten og efter 10 sek overtagelsestidspunktet. (B) Højere forstørrelse af RAS (grøn) injiceres i huden (Scale bar = 20 um, 25X forstørrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Aftapning lymfeknuder Processing (A) Billede, der viser dissektion af den proksimale auricular DLN efter intradermal injektion af Evans blå for demonstration.. Efter cervikal dislokation af musen, er halsen desinficeres med 70% ethanol. En første incision i jugularis-carotis område med skarp saks og huden fjernes fra operationsområdet. Snittet er strakt med 2 pincet til at eksponere DLN der vises grayish forhold til det omgivende væv. Bindevævet derpå omhyggeligt klemt med pincet på toppen af DLN og progressivt adskilles fra den. Endelig er DLN ekstraheres ved at placere en pincet under lymfoide væv. (B) Billede, der viser den udtrukne DLN i en dråbe PBS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Ear Skin Processing billeder, der viser successive trin til at behandle den podede øre. (A) Efter cervikal dislokation af musen, er øret desinficeres med 70% ethanol og fjernes ved anvendelse af sterile skarp saks og pincet. (B - D) Den dorsale og ventrale aspekter af øret er let adskilt ved at klemme og spacing fra hinanden afskårne ender med to pincet. (E) Billede, der viser de dorsale og ventrale aspekter af øret før enzymatisk behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:.. Protokol Oversigt Skematisk fremstilling af de vigtigste skridt til at isolere totale celler fra huden og DLN væv Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: myeloid cellepopulation isoleret fra øret Hud og den proksimale DLN Repræsentative FACS plots viser.gating strategi til at analysere den myeloide rum i huden (A) og DLN (B). CD45 + CD11 + og CD8a - CD11b + celler blev gated på samlede levende singlet begivenheder for huden og DLN hhv. For hver tilstand, blev 5 x 10 5 total begivenheder erhvervet (2 ører og 2 DLN samlet per prøve). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I perspektivet af storstilet vaccination af mennesker ved hjælp af en hel sporozoit malariavaccine, en af de vigtigste udfordringer at overvinde, er at udvikle optimerede ruter og metoder parasit administration at sikre en vellykket immunisering og beskyttelse 24,25. Hos mennesker er blevet udført evaluering af beskyttende effekt medieret af levende svækkede parasitter (LAP) efter naturlig myggestik 2, samt intradermal, subkutan 25,26 og IV immuniseringer 27. Som rapporteret hos gnavere 28 og ikke-menneskelige primater 25, IV administration af LAP inducerer stærkere beskyttende immunreaktioner i forhold til de ovennævnte ruter. Ikke desto mindre, ikke-IV administrationsveje hjælp kanyle og sprøjte stadig mere egnet til menneskelig massevaccination og er ved at blive gjort en indsats for at optimere deres beskyttende effekt.
Nylige undersøgelser i mus demonstrererd, især i tilfælde af ID-vejen, at aflejringen af et lille volumen sporozoit suspension (intervallet 1 pi) på flere injektionssteder (4 point) signifikant forøget parasit infektivitet forhold til et enkelt inokulering af parasitter fortyndet i større mængder (50 pi) 24. I vores eksperimentelle system (C57BL / 6 mus - P. berghei), blev fuldstændig beskyttelse opnås efter flere injektioner i øret dermis af stærkt koncentreret suspension af parasitter (50.000 RAS i 0,6 pi, 4 injektionssteder) 19. I denne sammenhæng har vi etableret protokollen beskrevet ovenfor til at analysere mere præcist den lokale vært immunrespons på immunisering doser af RAS, tilladt os at identificere 2 store myeloide celle delmængder rekrutteret i huden og DLN som svar på parasitten 19.
Multi-parametrisk flowcytometri muliggør nøjagtig identifikation og kvantificering af immun celleforandringer i forbindelse med værtens responstil infektion 19,20. Isolering af store antal levedygtige celler er derfor afgørende at udføre reproducerbar fænotypisk analyse. Til dette formål skal enzymkoncentrationen og varigheden af vævsfordøjelse optimeres. Faktisk kan lav koncentration af enzymer eller utilstrækkelig inkubationstid føre til ufuldstændig fordøjelse med lavt udbytte af celler, mens langvarig vævsfordøjelse kan medføre nedsat cellelevedygtighed og ændring af celleoverfladeantigen ekspression 29. Ikke desto mindre har veletablerede protokoller bruger kollagenase behandling vist sig at have marginal betydning for sporbarhed af relevante overflademolekyler hyppigt anvendes til fænotypisk analyser 30.
Blandt de mange parametre, der kan forbedre kvaliteten af celleisolering, adskillelse af den dorsale og ventrale dele af øret huden er afgørende, eftersom den muliggør collagenase / DNAse for at få adgang dermis. Desuden hakning huden i småstykker forøger overfladearealet tilgængeligt for enzymerne, derfor giver kortere fordøjelse. Endelig hjælper anvendelsen af mekanisk dissociering at øge udbyttet af celleantallet for både hud og DLN. Dog kan overdreven dissociation forårsage yderligere stress, der kan have en negativ indflydelse på cellernes levedygtighed.
Vi begunstiget køb af levende celler, da fiksering fører til suboptimal farvning, komplicerende skelnen af sjældne positive begivenheder af interesse (data ikke vist). Desuden diskrimination af døde celler var mere problematisk. I de tilfælde, hvor der kræves celle fiksering, vil vi foreslå brugen af LIVE / DEAD kan rettes døde celle pletter.
Brug af den definerede protokol, at vi med succes isolerede myeloide celler infiltrerer ind i huden og DLN som svar parasit injektion (figur 6A og B). Vi normalt opnå højere niveauer af levedygtige enkeltceller fra DLN (70-90%) sammenlignet medhuden (40-70%). Denne forskel kan forklares ved den længere inkubationstid er nødvendig til effektiv enzymatisk fordøjelse sammen med yderligere trin med mekanisk dissociation at isolere hudceller (hudlag separation, hakning og stærkere mashing).
Endelig er en vigtig parameter for at tage hensyn til, når man analyserer værtens respons på ID injektion af sporozoitter er niveauet af inflammation induceret af både nålen indsættelse og myg spytkirtel ekstrakt aflejring i huden 19,20. Vi foreslår derfor at tilføre yderligere mus med enten 1x PBS alene eller spytkirtelekstrakter fra samme antal ikke-inficerede myg til at evaluere immunresponset specifikt induceret af parasitten. Alt i alt, vi anbefaler at dissekere inficerede myg med høj parasit belastning i spytkirtlerne og at filtrere parasitten suspension at begrænse mængden af myg materiale, der kunne deponeres i huden.
jegn resumé, isolering af myeloide celler fra huden og DLN gennem den beskrevne protokol giver en pålidelig analyse for at vurdere dynamiske cellulære forandringer under inflammatoriske respons på Plasmodium infektion og kan udvides til andre patogener transmitteres ind i værtens hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Patricia Baldacci, Vanessa Lagal og Sabine Thiberge for kritisk læsning, Irina Dobrescu og Sabine Thiberge om hjælp til at tage billeder og Pauline Formaglio til undervisning in vivo billeddannelse af sporozoit motilitet i musen huden. Vi vil også gerne takke Marek Szatanik og Center for Produktion og infektion af Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) for myg opdræt. Denne undersøgelse blev støttet af Research Fund AXA og midler fra Laboratoire d'Excellence "Integrativ Biology of Emerging Infectious Diseases" (give nr. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
