Abstract
Infección de la malaria comienza cuando la fase de esporozoito de Plasmodium se inocula en la piel de un huésped mamífero a través de una picadura de mosquito. El parásito muy móviles no sólo llega al hígado a invadir hepatocitos y transformar en forma globular-infeccioso. También migra en la piel y a los ganglios linfáticos de drenaje proximal del sitio de inyección, en los que puede ser reconocido y degradado por residentes y / o células mieloides reclutados. Intravital de imágenes informó el reclutamiento temprano de brillantemente fluorescente Lys-GFP leucocitos positivos en la piel y las interacciones entre los esporozoitos y CD11c + células en el ganglio linfático de drenaje. Presentamos aquí un procedimiento eficaz para recuperar, identificar y enumerar los subconjuntos de células mieloides que son reclutados a la piel del ratón y drenan los ganglios linfáticos después de la inyección intradérmica de inmunización de dosis de esporozoitos en un modelo murino. Caracterización fenotípica utilizando el flujo multi-paramétrico proporciona citometríaun ensayo fiable para evaluar los cambios celulares tempranos dinámicos durante la respuesta inflamatoria a la infección por Plasmodium.
Introduction
La malaria es una de las enfermedades infecciosas más mortales en el mundo, matando a más de medio millón de personas por año. La infección por Plasmodium, el agente causal de la enfermedad, comienza por una fase pre-eritrocítica (PE). Durante esta fase, los esporozoitos inyectados en la piel de acogida por un mosquito anófeles hembra llegan al hígado a través del torrente sanguíneo y se diferencian los hepatocitos dentro en las formas de parásitos que infectan a las células rojas de la sangre y causan los síntomas de la enfermedad.
Las etapas de educación física de Plasmodium representan un objetivo privilegiado para la vacunación contra la malaria. De hecho, las vacunas vivas atenuadas contra estas etapas, tales como esporozoitos atenuados por radiación (RAS), parásitos detenidos genéticamente (BPA) o quimioprofilaxis y esporozoitos (CPS) han demostrado su capacidad para proteger tanto a los roedores y humanos anfitriones 1-9. En el modelo de roedores, se llevan a cabo la mayoría de los estudios de vacunación utilizando la inmunización por vía intravenosa, Que es el estándar de oro en términos de eficacia protectora. Sin embargo, la descripción de una etapa de la piel y la importancia de los ganglios linfáticos de la piel asociada de drenaje (DLN) en la obtención de la protección ha cambiado nuestra percepción de la fase de PE y enfatizó la importancia de la vía intradérmica de la inyección. Intravital de imágenes de P. esporozoitos berghei inyecta en la piel de los roedores se ha demostrado que sólo ~ 25% del inóculo llega al hígado a través del torrente sanguíneo. El restante 75% ~ distribuye entre el DLN proximal (~ 15%) y la piel (~ 50%) 10,11, donde una pequeña proporción puede transformar y permanecer con vida durante semanas dentro de las células de la piel 12,13. Por otra parte, los estudios posteriores describen que el establecimiento de la inmunidad protectora eficaz después de la inmunización intradérmica se realiza principalmente en la piel-DLN, donde se activan las células T CD8 + específicas del parásito, y sólo de forma marginal en el bazo o del hígado-dLNs 14,15.
Mientrasla mayoría de los estudios se han centrado en la caracterización de las células efectoras implicadas en el establecimiento de la respuesta inmune protectora, se sabe mucho menos sobre el destino de parásitos vivos atenuados inyectados en la piel, especialmente sus interacciones con el sistema inmune innato. En particular, la caracterización de las células presentadoras de antígenos que participan en la absorción de antígeno del parásito, el procesamiento y la presentación a las células T CD8 + es de importancia crítica, sabiendo que la adquisición antígeno PE puede ocurrir tanto en la piel y compartimentos DLN. Anteriores estudios de imagen intravital describen una afluencia temprana de las células fluorescentes brillantes Lys-GFP positivas en la piel después de una picadura de un mosquito infectado 16, mientras que se observaron las primeras interacciones entre los esporozoitos y las células dendríticas en el DLN 10,17. Más recientemente, se ha informado de que los esporozoitos inoculados en la piel por los mosquitos aumenta la motilidad de tanto las células T reguladoras dendríticas y en la piel delos ratones, mientras que se observó una disminución del número de células presentadoras de antígenos en el DLN 18.
El objetivo fue identificar y cuantificar con más precisión los subconjuntos de leucocitos reclutados en la piel y los correspondientes DLN, así como aquellos que interactúan con el parásito después de la inyección intradérmica de la inmunización de dosis de RAS 19. En este contexto, aislamos células mieloides (CD45 + CD11b +) de ambos tejidos y caracterizado subpoblaciones de interés por el multi = flujo paramétrico citometría. De acuerdo con la respuesta inmune se describe en la etapa temprana de Leishmania major infección de la piel 20, la respuesta del huésped primario a esporozoitos de inyección consta de un reclutamiento sucesiva de los neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguidos de monocitos inflamatorios (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) que se identifican sobre la base de Differential expresión de los marcadores de superficie Ly6G y Ly6c.
Se describe aquí un protocolo para el aislamiento de células mieloides de la piel del ratón y DLN después de la inyección intradérmica de la inmunización de dosis de RAS extraídos de las glándulas salivales de mosquitos infectados. inyecciones intradérmicas reproducibles y procesamiento de tejidos son pasos críticos para cuantificar los cambios fenotípicos de infiltrarse en la población de células dentro de los tejidos infectados. El enfoque se detalla a continuación proporciona un ensayo fiable para evaluar la piel y la respuesta inflamatoria DLN a Plasmodium parásito y se puede extender a varios sistemas experimentales.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité del Instituto Pasteur y por el Comité de Ética local de Experimentación Animal (Comité Ético IDF-París 1, París, Francia; número de contrato: 2.012-0.015) y realizan de acuerdo con las directrices y regulaciones aplicables.
1. Materiales y Reactivos
- Utilice la hembra Anopheles stephensi (cepa mosquitos Sda500) que se alimentan de ratones infectados 3-5 días después de la emergencia y posterior, tal como se ha descrito previamente 21.
- Use parásitos Plasmodium berghei ANKA clon que expresa el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la proteína de choque térmico constitutiva 70 (HSP70) promotor. Esto produce fluorescencia brillante durante todo el ciclo de vida del parásito 22.
- los ratones C57BL / 6JRj uso femenino (de 7 semanas de edad).
NOTA: Todos los reactivos utilizados en el protocolo descrito se enumeran en la T abla de Materiales / Equipos.
- Entre 18-25 días después de la harina de sangre infecciosa, recoger y fría-anestesiar a los mosquitos en un tubo de 15 ml en hielo como se ha descrito previamente 21. transferir cuidadosamente en una placa de Petri invirtiendo el tubo. Mantener los insectos en el hielo y exponer los mosquitos a una dosis de 12 krad de γ- o X-irradiación.
- Aislar esporozoitos atenuados de las glándulas salivales de mosquitos irradiados como se ha descrito previamente 21. Recoger las glándulas salivales infectadas en un volumen pequeño (alrededor de 15 l) de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) en hielo y suavemente aplastarlos para liberar los esporozoitos.
NOTA: La inyección de una suspensión de parásitos altamente concentrada en un pequeño volumen de ser crítico, es por lo tanto esencial para cosechar un número suficiente de glándulas salivales de un alto número de mosquitos infectados preseleccionados bien, como lo demuestra su sólida expresión deverde-fluorescencia. - Filtrar la suspensión esporozoito a través de un tapón de filtro de células 35 micras adaptado a una adherencia 1,5 tubo bajo ml de microcentrífuga a fin de eliminar grumos y residuos mosquito.
- Contar el número total de esporozoitos aislados como se describió anteriormente 21 y ajustar la concentración de la suspensión de parásitos de frío 1x DPBS para obtener 83.000 esporozoitos / l. Almacenar los parásitos en hielo mientras continúan los pasos a seguir.
- Recoger el número equivalente de las glándulas salivales de mosquitos no infectados que se utilizarán como control negativo y procesar la muestra como se describe en los pasos 2.2 y 2.3. Diluir la muestra como se indica anteriormente para obtener concentración similar de extractos de glándulas salivales en la suspensión.
NOTA: Los esporozoítos se pueden almacenar en hielo durante un máximo de 2 horas. Sin embargo, lo ideal sería que se inyectan dentro de una hora después de aplastar las glándulas salivales.
3. La inyección de esporozoitos en el dérmica Layer de la Oreja
- Anestesiar los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina (50 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) mezcla. Espere 5-8 minutos para el ratón para estar en un estado de inconsciencia y aplicar pomada oftálmica para los ojos para evitar el secado de la córnea. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie suave en ambos pies traseros.
NOTA: La dosis de anestesia dura menos de 20 minutos, por lo que los próximos pasos debe hacerse rápidamente. - Estabilizar el pabellón de la oreja del ratón mediante la fijación de la parte ventral con cinta transparente colocado previamente bajo un microscopio estereoscópico (Figura 1A). Presione suavemente el oído para evitar el daño de la vasculatura.
- Cargar un / aguja biselada de calibre 35 10 l jeringa con 0,6 l de parásitos se volvieron a suspender 10.
- Entregar la suspensión de esporozoitos en 4 puntos de inyección (0,15 l por sitio) mediante la inserción de la aguja con cuidado en el lado dorsal de la oreja (Figura 1A), debajo de la epidermis, conel bisel hacia arriba, teniendo cuidado de evitar cualquier vaso sanguíneo. Permita que la aguja permanezca en la dermis para unos pocos segundos para evitar el reflujo de la inyectante antes de retirarlo. Observar una pápula característica en cada punto de inyección al final del procedimiento (Figura 1B y 1C).
- Después de la inyección, retire con cuidado la oreja de la cinta.
- Inyectar el oído contralateral con la misma dosis de parásitos siguiendo el 3/2 a 3/4 pasos.
- Inyectar 2 ratones adicional, ya sea con 0,6 l de 1x DPBS o 0,6 l de 1x DPBS + extracto de glándula salival de los mosquitos infectados con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria mediada por la inyección solo y la deposición de material de mosquito en la dermis.
- Seguimiento de la recuperación de ratón de la anestesia antes de colocarlo de nuevo en la jaula.
NOTA: La deposición de esporozoitos adecuada en la piel se puede monitorizar mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2A y 2B), El ratón se preparó como se describe previsously 23.
4. La piel y disección del ganglio linfático drenante
- Preparar medio estándar (SM) como sigue: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) suplementado con 400 U / ml de colagenasa y 50 mg / ml de desoxirribonucleasa (DNasa) .
- Se preparan dos placas de cultivo tisular de 6 pocillos de fondo plano sobre hielo con 4,5 ml de SM + 70 micras colador de células por pocillo para muestras DLN (Placa A) y 4,5 ml de SM por pocillo de muestras de piel (Placa B).
- En el punto de tiempo deseado después de la inoculación de esporozoitos, profundamente anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (125 mg / kg) / xilazina (12,5 mg / kg) mezcla antes de la dislocación cervical. Asegúrese de que el ratón demuestra signos de muerte clínica y comenzar la disección inmediatamente.
NOTA: La cinética de reclutamiento de células mieloides pueden ser examinados en diferentes momentos después de injección (es decir, 2 horas, 4 horas y 24 horas como se ha descrito previamente 14). - Desinfectar el oído inoculado y la región del cuello correspondiente con 70% de etanol para reducir la posibilidad de contaminación.
- El uso de tijeras y pinzas estériles, asépticamente diseccionar los extremos proximal DLN auricular sin recoger la grasa circundante. Realizar una primera incisión en el surco yúgulo-carotidian y quitar los pelos del campo operativo. Estirar la incisión con 2 pinzas para exponer el DLN que aparece grisáceo en comparación con el tejido circundante.
- Pellizcar los tejidos conectivos cuidadosamente sobre la parte superior de la DLN con una pinza para facilitar su eliminación. Extraer el DLN mediante la colocación de una pinza debajo del tejido linfoide (Figura 3A y 3B). Coloque el DLN en un pozo que contiene filtro de células de 4,5 ml de SM + 70 micras (placa A).
- Efectuar toda la oreja inoculado con unas tijeras afiladas estériles y pinzas (Figura 4A). Separcomieron los aspectos dorsal y ventral de la oreja por pellizcos y espaciado aparte del corte termina con dos pinzas (Figura 4B - 4E). Colocarlos en un pozo que contiene 4,5 ml de SM (Placa B) asegurándose de que ambos tejidos se sumergen completamente en el medio.
NOTA: Con el fin de mejorar la fiabilidad del experimento y aumentar el número de células de interés, piscina 2 inyecta oídos o 2 dLNs desde el mismo ratón por muestra. - La cosecha y el proceso en paralelo de las orejas y dLNs de ratones inoculados con cualquiera 1x DPBS o extractos de glándulas salivales. Incluya 2 muestras para los oídos y los ganglios linfáticos adicionales cosechadas a partir de un ratón ingenuo para los controles de compensación tinción negativa e individuales.
5. aislamiento de células de los ganglios linfáticos
- Incubar los ganglios linfáticos (figura A) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 15 minutos con agitación suave. Añadir ácido etilendiaminotetraacético 10 mM final (EDTA) por pocillo para neutralizar la colagenasa y ADNasa actividades. Realice los siguientes pasos en el hielo.
- Disociar ganglios linfáticos utilizando el extremo superior de un émbolo de la jeringa 5 ml. Presione con movimientos circulares contra el colador hasta que todo lo que queda es el tejido conectivo blanco.
- Enjuague el filtro de células dos veces con DPBS 500 l 1x + 2% de suero bovino fetal (FBS) + EDTA 2 mM. Transferir la totalidad del volumen del pozo en un tubo de 15 ml.
- Enjuague el bien dos veces con 500 l DPBS 1x + 2% de FBS + 2 mM de EDTA y transferir el volumen en el tubo de 15 ml. Mantenga los tubos en hielo.
6. Aislamiento de la célula de piel de la oreja
- Incubar los folletos del oído (Placa B) a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 hora con agitación suave.
NOTA: Después de 20 minutos de incubación, cortar los folletos para los oídos con las tijeras en trozos pequeños para facilitar la digestión del tejido y se coloca la muestra de nuevo en la incubadora durante los 40 minutos restantes. Las células individuales pueden ser observadas en el medio al final del tiempo de incubación. - Añadir final de 10 mM EDTA por pocillo para neutralizar las actividades de la colagenasa y ADNasa. Realice los siguientes pasos en el hielo.
- La transferencia de los fragmentos de tejido del oído y todo el volumen de medio en un nuevo pocillo que contenía un filtro de células de 70 micras utilizando una pipeta de 1 ml. Cortar 2 a 3 mm desde el extremo de la punta para recoger los fragmentos de tejido del oído con más facilidad.
- Disociar fragmentos de tejido del oído utilizando el extremo superior de un émbolo de la jeringa 5 ml. Presione con movimientos circulares contra el colador hasta que todo lo que queda es el tejido conectivo blanco.
- Enjuagar los filtros de células dos veces con DPBS 500 l 1x + 2% de FBS + EDTA 2 mM.
- Transferir todo el volumen del pozo en un 50 ml de tubo a través de un filtro de células de 70 micras.
- Enjuague el pozo con 500 l 1x DPBS + 2% de FBS + EDTA 2 mM y transferir el volumen en el tubo de 50 ml. Mantenga el tubo en hielo.
NOTA: Las diferentes medidas para aislar células totales de la piel y los tejidos DLN se resumen en la Figura 5.
- Centrifugar la piel y las muestras DLN durante 5 min a 450 xga 4 ° C y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 300 l DPBS 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM.
- Recoger un pequeño volumen de cada muestra para contar el número total de células aisladas de la piel y DLN utilizando un hemocitómetro. Añadir 0,04% de azul de tripano para determinar la viabilidad celular.
8. El bloqueo de la no-unión específica de antígeno
- Añadir 10 g / ml de anticuerpo no marcado CD16 / CD32-Fc bloque. Incubar 20 min a 4 ° C (se puede ir más tiempo).
- Añadir 2 ml de DPBS frío 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM. Centrifugar la muestra durante 5 min a 450 xg a 4 ° C y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 300 l DPBS 1x + FBS al 2% + 2 mM EDTA y mantener las muestras en hielo.
9. manchas en la piel y las células de ganglios linfáticos mieloides
- Incubar de esquí que estuvo bloqueadon y DLN aislado células con rastreador Live / Dead (es decir, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol o DAPI), anti-CD45 y anti-CD11b anticuerpos específicos.
NOTAS: Con el fin de enriquecer las subpoblaciones de células mieloides de interés, especialmente los raros, las células CD45 + y los linfocitos se pueden purificar, respectivamente, de la piel o agotados de la DLN por perla magnética clasificación de células facilitador. Dado que la mayoría de las células aisladas de la DLN son CD45 +, el uso de anti-CD45 no es obligatorio. Otros marcadores pueden ser incluidos para identificar subpoblaciones de células mieloides de interés por la estrategia positivo o negativo gating. En este protocolo, las células mieloides reclutados en el DLN se enriquecieron mediante la exclusión de las células CD8a + (todo el compartimento de células T puede ser dirigido mediante el uso de anti-CD3 anticuerpo específico). - Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad. Añadir 500 DPBS l 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM, centrifugar la muestra de 5 min a 450 xga 4 ° C y descartar el supernatant. Repita el paso de lavado dos veces.
- Resuspender las muestras con 300 l DPBS 1x + 2% de FBS + EDTA 2 mM. Transferir la totalidad del volumen en un tubo de FACS a través de un filtro de células de 35 micras. Enjuague el filtro con 100 l de DPBS 1x + FBS al 2% + EDTA 2 mM.
- Ejecutar las células teñidas en un citómetro de flujo. Puerta viven las células individuales (DAPI -, FSC-W) para excluir las células muertas y dobletes. Parcela CD45 + CD11b + eventos para la piel (Figura 6A) y (CD45 +) CD8a - CD11b + eventos para el DLN (Figura 6B).
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Representative Results
Recientemente hemos demostrado que la inyección de agujas y jeringas de dosis inmunizantes de P. berghei esporozoitos en la piel del ratón induce una contratación sucesiva de neutrófilos polimorfonucleares seguidos por monocitos inflamatorios en la piel y DLN 19. La Sección protocolo descrito anteriormente detalla el procedimiento usado para aislar con éxito las células mieloides en vivo de ambos tejidos siguientes inyecciones múltiples de gran número de esporozoitos en la dermis del oído (Figuras 1 y 2). Dentro de la primera 24 h, la DLN (Figura 3) y el sitio de inyección de la piel (Figura 4) fueron aislados y procesados como se resume en la Figura 5 para analizar la infiltración celular por el flujo multi-paramétrico citometría. En general, esta técnica, hemos conseguido aislar un promedio de 10 + 4 CD45 + CD11b y las células individuales 2.10 4 CD11b + en vivopara la piel y DLN respectivamente. La viabilidad aceptable de células individuales no escombros varió de 40-70% para la piel y 70-90% para el DLN. Como se muestra en la Figura 6, la frecuencia de células mieloides en la piel (CD45 + CD11b +) y el DLN (CD8a - CD11b +) fuertemente aumenta después de la inyección intradérmica de RAS en comparación con ratones no infectados.
Figura 1: I ntradermal La inyección de esporozoitos en el oído de ratón. (A) Imagen que muestra la inyección intradérmica de esporozoitos en el pabellón de la oreja de un ratón anestesiado. La cara ventral de la oreja se estabiliza con cinta adhesiva transparente previamente colocado bajo un microscopio de disección. La aguja se inserta cuidadosamente en el lado dorsal de la oreja, debajo de la epidermis, con el bisel hacia arriba. (B - C) Imágenes que muestran el lado dorsal de la pabellón de la oreja antes de (B) y después (inyección C) intradérmica de 0,1-0,2 l de suspensión de parásito. Una característica pápula (flecha negro) es observable en el lugar de la inyección al final de la operación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 2: Obtención de imágenes de esporozoitos depositados en la dermis del oído de ratón (A) Microscopía de fluorescencia que muestra RAS migración desde el lugar de inyección (indicado por las líneas de trazos) en la piel del ratón 15 min después de la inyección (barra de escala = 60 m; 10 veces aumento). El camino de los esporozoitos se representa por la proyección de intensidad máxima de la señal fluorescente. Verde y rojo de fluorescencia rerespectivamente mostrar la posición de parásitos en la piel en el comienzo y después de 10 seg de adquisición. (B) Mayor aumento de RAS (verde) se inyecta en la piel (barra de escala = 20 micras; magnificación 25X). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen de drenaje de ganglios linfáticos transformación (a) que muestra la disección proximal de la DLN auricular después de la inyección intradérmica de azul de Evans para fines de demostración.. Después de la dislocación cervical del ratón, el cuello se desinfecta con etanol al 70%. Una primera incisión se hace en la zona yugular-carótida con unas tijeras afiladas y la piel se retira del campo operatorio. La incisión se estira con 2 pinzas para exponer el DLN que aparece grAyish en comparación con el tejido circundante. Los tejidos conectivos son luego cuidadosamente pellizcados con unas pinzas en la parte superior de la DLN y se separan progresivamente de ella. Por último, el DLN se extrae mediante la colocación de una pinza debajo del tejido linfoide. (B) Imagen que muestra el DLN extraída en una gota de PBS. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Oído Procesamiento de Imágenes de la piel que muestran los pasos sucesivos para procesar el oído inoculado. (A) Después de la dislocación cervical del ratón, el oído se desinfecta con etanol al 70% y se retira con unas tijeras afiladas estériles y fórceps. (B - D) El dorsal y ventral de la oreja están ligeramente separados por pellizcos y sestimulación separados los extremos cortados con dos pinzas. (E) Imagen que muestra los aspectos dorsal y ventral de la oreja tratamiento enzimático previo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:.. Resumen Protocolo Representación esquemática de los pasos clave para aislar células totales de la piel y los tejidos DLN Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Población de las células mieloides aislado de la piel del oído y la proximal DLN FACS parcelas representativas que muestran la.gating estrategia para analizar el compartimento mieloide en la piel (A) y el DLN (B). CD45 + CD11b + y CD8a - células CD11b + fueron cerrada en eventos en vivo singlete total de la piel y DLN, respectivamente. Para cada estado, a 5 x 10 5 eventos totales fueron adquiridas (2 orejas y 2 DLN agruparon por muestra). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En la perspectiva de la vacunación a gran escala de los seres humanos con una vacuna entera malaria esporozoitos, uno de los principales retos a superar es el desarrollo de rutas y métodos de administración parásito optimizadas para asegurar la inmunización y protección 24,25 exitosa. En los seres humanos, la evaluación de la eficacia protectora mediada por parásitos vivos atenuados (LAP) ha llevado a cabo siguiendo natural de mosquitos muerde 2, así como intradérmica, subcutánea 25,26 y IV inmunizaciones 27. Como se informó en roedores 28 y primates no humanos 25, la administración IV de LAP induce respuestas inmunes protectoras más fuertes en comparación con las rutas mencionadas anteriormente. Sin embargo, las rutas no-IV de la administración mediante aguja y jeringa todavía sigue siendo más adecuado para la vacunación en masa humana y en la actualidad se están haciendo esfuerzos para optimizar su eficacia protectora.
Estudios recientes realizados en ratones demuestrand, en especial en el caso de la ruta ID, que la deposición de un pequeño volumen de suspensión de esporozoitos (rango de 1 l) en múltiples sitios de inyección (4 puntos) aumentó significativamente la infectividad del parásito en comparación con una sola inoculación de parásitos diluido en volúmenes más grandes (50 l) 24. En nuestro sistema experimental (C57BL / 6 mouse - P. berghei), se logró una protección completa después de múltiples inyecciones en la dermis del oído de la suspensión altamente concentrada de parásitos (50.000 SRA en 0,6 l, 4 puntos de inyección) 19. En este contexto, se estableció el protocolo descrito anteriormente para analizar con mayor precisión la respuesta inmune del huésped local para la inmunización de dosis de RAS que nos permitió identificar 2 principales subconjuntos de células mieloides reclutados en la piel y DLN en respuesta al parásito 19.
flujo Multi-paramétrico permite citometría de identificación precisa y cuantificación de cambios en las células inmunes en el contexto de la respuesta del huéspeda la infección 19,20. El aislamiento de un gran número de células viables tanto, es crítico para llevar a cabo el análisis fenotípico reproducible. Para este propósito, la concentración de enzima y de la duración de la digestión de tejido deben ser optimizados. De hecho, la baja concentración de enzimas o tiempo de incubación insuficiente puede conducir a la digestión incompleta con bajo rendimiento de las células del tejido mientras que la digestión prolongada puede resultar en disminución de la viabilidad celular y la alteración de la expresión de antígenos de superficie celular 29. Sin embargo, los protocolos bien establecidos mediante tratamiento con colagenasa se han demostrado tener un impacto marginal sobre la capacidad de detección de moléculas de superficie correspondientes utilizados con frecuencia para análisis fenotípico 30.
Entre los varios parámetros que pueden optimizar la calidad de aislamiento de células, la separación de la dorsal y ventral secciones de la piel de la oreja es esencial, ya que permite la colagenasa / DNAsa para acceder a la dermis. Además, picado de la piel en pequeñapiezas aumenta el área de superficie accesible a las enzimas, por lo tanto permitiendo una duración más corta de la digestión. Finalmente, el uso de disociación mecánica ayuda a aumentar el rendimiento en el número de células de la piel y DLN. Sin embargo, la disociación excesiva puede provocar una carga adicional que podría afectar negativamente a la viabilidad celular.
Nos favorecidos adquisición de células vivas desde la fijación conduce a tinción subóptima, complicando distinción de eventos positivos raras de interés (datos no mostrados). Por otra parte, la discriminación de las células muertas era más problemático. En los casos en que se requiere la fijación de células, sugerimos el uso de manchas LIVE / DEAD fixable muertos celulares.
Usando el protocolo definido, nosotros, células mieloides aisladas con éxito se infiltran en la piel y DLN en respuesta a parasitarias inyección (Figura 6A y B). Por lo general, se obtiene un mayor nivel de células individuales viables desde el DLN (70-90%) en comparación con elpiel (40-70%). Esta diferencia puede explicarse por el tiempo de incubación más largo necesario para la digestión enzimática eficaz junto con etapas adicionales de disociación mecánica para aislar células de la piel (piel separación de capas, el picado y la maceración más fuerte).
Por último, un parámetro importante a tener en cuenta al analizar la respuesta del huésped a la inyección de esporozoitos ID es el nivel de inflamación inducida tanto por la inserción de la aguja y el mosquito salival deposición extracto de glándulas en la piel 19,20. Por lo tanto sugerimos para inyectar ratones adicional, ya sea con 1x PBS solo o extractos de glándulas salivales de la misma cantidad de mosquitos no infectados para evaluar la respuesta inmune inducida específicamente por el parásito. En total, se aconseja para diseccionar los mosquitos infectados con alta carga parasitaria en las glándulas salivales y filtrar la suspensión de parásitos para limitar la cantidad de material de mosquitos que podrían ser depositado en la piel.
yon resumen, el aislamiento de células mieloides a partir de la piel y DLN a través del protocolo descrito proporciona un ensayo fiable para evaluar cambios celulares dinámicos durante la respuesta inflamatoria a la infección por Plasmodium y se puede ampliar a otros patógenos de transmisión en la piel del huésped.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Patricia Baldacci, Vanessa lagal y Sabine Thiberge para la lectura crítica, Irina Dobrescu y Sabine Thiberge en busca de ayuda en la toma de fotografías y Pauline Formaglio para la enseñanza de imágenes in vivo de la motilidad esporozoito en la piel del ratón. También nos gustaría dar las gracias a Marek Szatanik y el Centro de Producción e infección de Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para la cría de mosquitos. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación AXA y fondos del Laboratoire d'Excellence "Biología Integrativa de Emerging Infectious Diseases" (concesión no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
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