Abstract
La lentille de l'œil est un organe transparent qui réfracte et se concentre la lumière pour former une image claire sur la rétine. Chez l'homme, les muscles ciliaires se contractent pour déformer la lentille, ce qui conduit à une augmentation de la puissance optique de la lentille de se concentrer sur des objets proches, un processus connu sous le nom d'hébergement. les changements liés à l'âge de la rigidité de la lentille ont été liés à la presbytie, une réduction de la lentille 'capacité à accueillir, et, par extension, le besoin de lunettes de lecture. Même si les lentilles de souris ne peuvent accueillir ou de développer la presbytie, des modèles de souris peuvent fournir un outil génétique inestimable pour la compréhension des pathologies de l'objectif, et le vieillissement accéléré observé chez la souris permet l'étude des changements liés à l'âge dans la lentille. Ce protocole présente un procédé simple, précise et économique pour la détermination de la rigidité de la lentille de la souris, en utilisant des lamelles de verre pour appliquer séquentiellement des charges de compression croissante sur la lentille. Les données représentatives confirment que les lentilles de souris deviennent plus rigide avec l'âge, commeLentilles humaines. Ce procédé est très reproductible et peut potentiellement être étendu par des moyens mécaniques des lentilles d'essai à partir des animaux plus gros.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire par les National Institutes of Health et en vertu d'un protocole approuvé par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Institut de recherche Scripps.
1. Objectif Dissection
- Euthanasier souris selon les recommandations dans les National Institutes of Health "Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire» et les protocoles d'utilisation institution d'animaux approuvés.
- Énucléer l'œil de souris à l'aide des pinces incurvées. Enfoncer le tissu autour de l'œil avec la pince pour amener l'œil de la prise, puis arracher l'œil de la prise avec la pince. Transfert yeux frais phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS) dans un plat de dissection.
- Coupez le nerf optique au plus près du globe oculaire que possible. Doucement et soigneusement insérer des pincettes droites fines dans le globe oculaire à travers le wher troue nerf optique quitte le postérieur.
- faire une incision soigneusement avec des ciseaux dans le globe oculaire à partir de la partie postérieure du bord de la cornée. Rongeur lentilles occupent environ 30% de l'oeil. Faire ces incisions soigneusement, et ne pas insérer des pinces ou des ciseaux trop profondément dans l'œil pour éviter d'endommager la lentille.
- Couper le long de la jonction entre la cornée et la sclérotique au moins à mi-chemin autour du globe oculaire.
- Poussez doucement sur la cornée pour enlever la lentille de l'oeil à travers l'ouverture pratiquée dans les étapes 1.4 et 1.5.
- Utilisez pince fine pointe de droites pour éliminer soigneusement les gros débris qui est encore attaché à la lentille. Inspecter visuellement l'objectif de tout dommage avant de procéder aux mesures de rigidité.
2. Mesures de rigidité
- Peser au moins 10 lamelles de la même boîte en utilisant une balance analytique. Trouver le poids moyen des lamelles. Par souci de cohérence, utilisez la même boîte de lamelles pour toutes les expériences. Pré-humideles lamelles et à angle droit miroir 1x PBS à la température ambiante pendant au moins 2 heures avant de commencer les expériences.
- Remplir la chambre de mesure (voir Figure 1) avec 65 - 75 ml de PBS 1x. La chambre de mesure a été faite de plexiglas par un atelier dans la maison-machine et divots dans la chambre ont été faites par une presse de forage fixé à la profondeur désirée avec une mèche appropriée. Objectifs restent transparents dans 1x PBS à la température ambiante pendant toute la durée des essais mécaniques.
Figure 1:. Rigidité Chambre de mesure Une photo montrant les dimensions de la chambre de mesure de rigidité sur mesure avec une variété de divots de différentes profondeurs et formes. Les divots rondes qui sont 200 um ou 300 um de profondeur (flèches jaunes) sont utilisés pour les mesures sur les lentilles de souris. Les mottes de gazon sont de 2 mm de diamètre et de 13 ~-. 14 mm du bord de la chambre S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Placez un miroir à angle droit dans la chambre à une distance constante du divot qui sera utilisé pour maintenir la lentille. Assurez-vous que le miroir ne se déplace pas pendant l'expérience.
- Transfert lentilles disséqués à la chambre de mesure soigneusement avec une pince ou une pince saisissant incurvées.
- Prenez une vue de dessus l'image de la lentille déchargé directement du dessus. Prenez des photos de lentilles de souris à 30X grossissement avec éclairage du microscope de dissection (en bas) et une source de lumière à fibres optiques sur les côtés gauche et droit. Régler l'alimentation en fibre optique à 80% de l'intensité lumineuse maximale. Régler la sortie de l'alimentation en fonction de l'éclairage ambiant, la préférence de l'utilisateur et la qualité de l'image en tant que de besoin.
- Prenez une vue latérale image de la lentille à vide, qui peut être vu à travers la rimiroir ght-angle. Si l'appareil photo est pas étalonné, prendre une photo du bord du miroir au point. Le bord du miroir est de 5 mm de long, et cette mesure peut ensuite être utilisée pour déterminer les pixels / mm et servir de barre d'échelle dans les images.
- Placez la lentille dans le divot, et confirmer que l'objectif est bien fixé et droite dans le divot. Prenez une photo de la lentille avant le chargement. La lentille doit reposer dans le divot sur sa face antérieure ou postérieure pôle.
- Placez 1 lamelle doucement sur la lentille. Attendre 2 min pour permettre le fluage, et de prendre une autre vue latérale image de la lentille chargée.
- Continuez à ajouter des lamelles comme dans l'étape 2.8 et la prise en vue latérale images après l'addition de chaque lamelle comme dans l'étape 2.8 jusqu'à un total de 10 lamelles sont appliquées.
- Retirez toutes les lamelles. Attendre 2 min, et de prendre une vue latérale image de la lentille (à l'intérieur et à l'extérieur de l'divot) après avoir enlevé tous les lamelles.
3. Objectif Nucleus Mesure
- Pour détermine la taille du noyau du cristallin, déplacer la lentille à un plat propre Petri remplie de PBS 1x.
- décapsuler doucement la lentille à l'aide des pinces droites fines.
- Slough au large des Les cellules fibreuses corticales par laminage de la lentille entre les doigts gantés. La lentille noyau restant se sentira comme un marbre dur. Utilisez cette procédure pour isoler le noyau sur les lentilles adultes à partir de 1 mois. Etant donné que le noyau isolé est un corps rigide, d'autres tests mécaniques du noyau de la lentille ne peut être effectuée en utilisant la méthode décrite.
- Rincer délicatement le noyau de lentille 1x PBS dans la boîte de Pétri.
- Placez le noyau de lentille arrière dans la chambre de mesure (pas dans le divot), et de prendre une image du noyau du cristallin à travers le miroir à angle droit.
Figure 2:. A Objectifs Souris comprimé par Lamelles (A) Schéma et (B) photographie de l'exconfiguration expérimentale montrant une lentille de souris à 2 mois dans un divot de 200 um de profondeur dans la chambre de mesure remplie de PBS 1x. Un miroir à angle droit et une caméra numérique montée sur un microscope à dissection ont été utilisés pour recueillir des images de la lentille lors de la compression par des lamelles. (C) Photos de vues sagittale d'un 2-month-old lentille de type sauvage comprimé en augmentant successivement le nombre de lamelles à condition que les données brutes pour mesurer des diamètres axiaux et équatoriaux et calcul déformations axiales et équatoriales au cours des essais de compression à base de lamelle. Une réflexion de la lentille peut parfois être vu dans les lamelles (le plus clairement visible dans l'image 1 lamelle). Lors de mesures, ignorer la réflexion et de mesurer à l'apex de la lentille. (D) Photos de vues sagittales du 2-month-old type sauvage lentille de post-compression et la lentille noyau isolé. La lentille de post-compression et le noyau isolé sont assis à l'extérieur du divot. Les barres d'échelle, 1 mm. Ce chiffre est modifié à partir Gokhdans, et al. PLoS One, 2012 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4. Analyse d'image
- Mesurer les diamètres équatoriales et axiales de lentilles avant le chargement et après chaque étape de chargement à l'aide ImageJ ou un logiciel similaire. Mesurer le diamètre de chaque noyau de la lentille. Le noyau de la lentille est presque sphérique de sorte une mesure à toute orientation suffira 19,21.
- Corrigez la lentille axiale diamètres en ajoutant la profondeur de la divot utilisée. Dans la chambre de mesure, la motte de terre obscurci à 200 um (verres 2-month-old souris) ou 300 um (lentilles 4-month-old et 8 mois souris âgées) de l'épaisseur axiale de la lentille.
- Calcul de la direction axiale et équatoriale des souches à partir des mesures du diamètre de la lentille en utilisant l'équation ε = (d - d 0) / d 0, où ε est la souche d est axiale ou ediamètre Quatorial à une charge donnée, et d 0 est le diamètre axial ou équatorial correspondant à une charge nulle.
- Tracer les déformations axiales et équatoriales en fonction de la charge imposée (en mg).
- Tracer la axiale, équatorial et diamètres nucléaires. Calculer et tracer le rapport d'aspect de la lentille en divisant le diamètre axial par le diamètre équatorial.
- Calculer et tracer le volume de la lentille à l' aide de l'équation, volume = 03.04 × π × r × E 2 R a, où R E est le rayon équatorial et R A est le rayon axial mesuré à partir de l'image prise à l' étape 2.6. Cette équation suppose la lentille est un sphéroïde (ellipsoïde) 1,22.
- Calculer et tracer le volume nucléaire en utilisant l'équation, volume = 03.04 × π × N r 3, où r N est le rayon du noyau de la lentille , telle que mesurée à partir de l'image prise à l' étape 3.5. Cette équation suppose la lentille noyau isa sphère 19,21.
- Calculer et tracer la fraction nucléaire comme étant le rapport du volume nucléaire au volume de la lentille.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La rigidité et les dimensions des lentilles de souris 2, 4 et 8-month-old ont été mesurés. Les souris étaient tous les animaux de type sauvage sur un pur souche C57BL6 fond obtenue à partir de l'élevage Facility IRST animaux, et chaque lentille a été chargé avec 1 à 10 lamelles. Les déformations axiales et équatoriales ont été calculées en fonction de la charge appliquée par mesure de la direction axiale et le diamètre equatorial de la lentille après l'addition de chaque lamelle couvre-objet, puis normaliser chaque changement de diamètre au diamètre correspondant déchargé. Huit lentilles de chaque groupe d'âge ont été testés et les résultats sont exprimés par la moyenne ± erreur type. Comme montré précédemment 19, la contrainte axiale est une fonction logarithmique de la charge appliquée (figure 3A). Il y avait une diminution statistiquement significative de l' âge-dépendante des déformations axiales et équatoriales sous la charge maximale appliquée (figure 3), ce qui indique que la lentille de la souris raidit avec l' âge. Stmesures de pluie étaient hautement reproductibles à travers les lentilles du même âge, comme en témoignent les petites erreurs standard.
Les données d'image recueillies au cours de cette expérience ont été également utilisés pour déterminer plusieurs caractéristiques morphologiques autres lentilles (figure 4). Comme prévu, le diamètre axial et equatorial et le volume de la lentille augmente avec l' âge (figure 4A, 4B et 4D). Le rapport d'aspect indique que la lentille a un diamètre équatorial légèrement plus grand que le diamètre axial, et ce paramètre n'a pas changé avec l' âge (figure 4C). Le diamètre, le volume et la fraction du noyau du cristallin augmente avec l' âge (figure 4E, 4F et 4G). Ces résultats suggèrent que le noyau du cristallin remodèle pour augmenter la taille relative du vieillissement de la lentille.
Ces données montrent que les lentilles de souris augmente la rigidité avec l'âge, semblables à des changements dans uneging lentilles humaines 9,15. Ces données concordent également avec les observations antérieures faites à l' aide d' un procédé similaire 18 et par Brillouin microscopie optique 23 que les lentilles de souris augmentent la rigidité avec l' âge. Deux autres études ont utilisé la méthode décrite pour montrer que tropomodulin-1, un actine a-coiffage d' extrémité protéine, CP49, une protéine de filament intermédiaire perlé et aquaporin 0 sont nécessaires pour maintenir la raideur lentille 19,20. Avec cette méthode, la multitude de modèles de souris pour des pathologies de la lentille et le vieillissement accéléré de la souris peut être utilisée pour comprendre les changements de rigidité de la lentille due à une variation et / ou le vieillissement génétique. Cette méthode peut aussi être adaptée pour des lentilles provenant d'autres espèces. Les dimensions de la chambre utilisée pour ces expériences sont optimisées pour les lentilles de souris, mais peuvent être facilement mis à l'échelle pour lentilles de plus grandes espèces. À l'avenir, il serait intéressant de déterminer si la taille de la lentille échelles avec une raideur de la lentille à travers les espèces.
Figure 3:. Axiaux et équatoriaux Courbes Strain-charge pour 2, 4 et 8-month-old (2M, 4M et 8M) de type sauvage Objectifs de souris (A) Axial contrainte de compression tracée en fonction de la charge appliquée ( mg). comp (B) équatorialesouche ressive tracée en fonction de la charge appliquée (mg). Quatre et lentilles 8-month-old présentaient moins de pression de 2 mois vieux lentilles à des charges maximales équivalentes, ce qui indique une augmentation de la rigidité de la lentille avec l'âge. ** P <0,01. Notez que l'axe Y est différent entre (A) et (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Caractéristiques morphologiques de 2, 4 et 8-month-old (2M, 4M et 8M) de type sauvage Objectifs de souris (A) de diamètre axial et (B) diamètre équatorial augmente progressivement avec l' âge. Le rapport d'aspect de la lentille (C) montre que les lentilles de souris sont légèrement plus large au niveau de l'équateur de la lentille. le volume de l'objectif (D), le diamètre nucléaire (E), volume nucléaire (F) et la fraction nucléaire (G) augmente progressivement avec l'âge. **, P <0,01. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il y a plusieurs considérations clés lors de l'utilisation de cette méthode pour mesurer la rigidité de la lentille. En premier lieu, les lamelles sont appliquées à la lentille à un angle légèrement oblique (8 à 8,5 °) par rapport au fond de la chambre (θ). Il en sera une très petite partie de la charge équatorial plutôt que axialement. Cependant, cette charge équatoriale est considéré comme négligeable parce que le péché θ ≈ 0,1 19. Si cette méthode est adaptée pour des lentilles plus grandes, l'angle des lamelles au fond de la chambre devrait être mesurée pour déterminer si la charge de l'équateur doit être pris en compte dans les calculs de déformation. En second lieu, il est essentiel de permettre à la lentille à équilibrer après l'addition de chaque lamelle. La période d' attente de 2 minutes permet la déformation en fonction du temps (ie., Fluage) de se produire, tels que les images ne sont prises lorsque la lentille est à une forme d'équilibre 19. Troisièmement, ce protocole est optimisé pour la mesure de contrainte de compression sur les mOuse lentilles à travers une large gamme dynamique de charges. Dans les études pilotes, une charge appliquée de 1293 mg (c. -à- dix 18 x 18 lamelles mm) comprimé la lentille de la souris à une déformation maximale, au - delà duquel l' augmentation des charges ne provoquent pas appréciable en outre la déformation. Ceci est dû à la présence du noyau de lentille rigide qui ne se déforme pas sensiblement sous compression 19. Quatrièmement, ce protocole permet d'éviter des dommages irréversibles des tissus. Dans des expériences publiées précédemment, aucun changement dans les propriétés mécaniques des lentilles de souris ont été observées lors du chargement de répétition, ce qui suggère que cette méthode ne pas endommager la lentille 19. Lors du test de mécanique des lentilles d'une espèce différente ou lentilles mutantes, des essais pilotes devraient être effectués pour déterminer la charge maximale nécessaire pour la contrainte maximale en répétant les étapes 2/8 à 2/10 et en comparant les courbes contrainte-charge, le diamètre des verres et des volumes de lentilles entre la première et la seconde chargement. Enfin, ce procédé donne une mesure empirique de la rigidité o f l'ensemble de lentille et ne peut pas distinguer les contributions des différents types de cellules (cellules épithéliales, des fibres corticales, de fibres nucléaires) et la capsule du cristallin à l'ensemble de lentilles propriétés mécaniques.
Les déformations axiales et équatoriales sont représentées ici en fonction de la charge imposée. Des études antérieures ont permis de quantifier la rigidité de la lentille de souris 19,21, la résistance 21 ou bien le changement de diamètre 18 à la charge appliquée. La souche est une quantité sans dimension qui permet une comparaison directe entre les lentilles de tailles différentes. Notez que l' extension équatoriale (souche positive) se produit en même temps que la compression axiale appliquée (souche négative) en raison de la conservation du volume de la lentille (ie, l' effet de Poisson). Cependant, les souches équatoriaux observées étaient beaucoup plus petites en valeur absolue que les déformations axiales, ce qui indique que ce procédé présente une résolution inférieure pour détecter de petits changements dans la souche équatoriale par rapport à la déformation axiale.
nt "> En résumé, cette méthode simple avec un dispositif facilement assemblé pour mesurer la rigidité de la lentille de la souris peut être appliquée de manière générale et largement dans la recherche de l'objectif de mieux comprendre comment des mutations dans les protéines, les pathologies et / ou le vieillissement affectent la rigidité de l'objectif. Bien que les lentilles de la souris ne sont pas accueillir, cette méthode peut encore élucider les protéines et les modifications liées à l'âge qui contribuent à la rigidité accrue de l'objectif, et contribuent potentiellement de nouvelles connaissances pour le développement de nouveaux traitements pour la presbytie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
