Abstract
La lente occhio è un organo trasparente che rifrange e si concentra la luce per formare una chiara immagine sulla retina. Negli esseri umani, contratto di muscoli ciliari deformare la lente, portando ad un aumento della potenza ottica della lente di concentrarsi su oggetti vicini, un processo noto come alloggio. Cambiamenti legati all'età in rigidità lente sono stati collegati a presbiopia, una riduzione nella lente 'possibilità di ospitare, e, per estensione, la necessità di occhiali da lettura. Anche se le lenti del mouse non ospitare o sviluppare presbiopia, modelli di mouse in grado di fornire uno strumento genetico prezioso per patologie lenti comprensione, e l'invecchiamento accelerato osservato nei topi permette lo studio dei cambiamenti legati all'età nella lente. Questo protocollo dimostra un metodo semplice, preciso e conveniente per determinare la rigidità della lente del mouse, utilizzando vetrini da applicare in sequenza crescente carichi di compressione sulla lente. Dati rappresentativi confermano che le lenti del mouse diventano più rigidi con l'età, comelenti umani. Questo metodo è altamente riproducibile e può potenzialmente essere scalata fino a meccanicamente le lenti di prova da animali più grandi.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dal National Institutes of Health e sotto un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali al The Scripps Research Institute.
1. Obiettivo dissezione
- Euthanize topi in base alle raccomandazioni del National Institutes of Health "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" e approvati utilizzano protocolli istituzione animali.
- Enucleate l'occhio da topo, utilizzando pinze curve. Premere il tessuto intorno l'occhio con le pinze per portare l'occhio dalla presa di corrente, e quindi cogliere l'occhio dalla presa con le pinze. Trasferire gli occhi di fresco 1x tampone fosfato salino (PBS) nel piatto dissezione.
- Tagliare il nervo ottico più vicino al bulbo oculare possibile. Delicatamente e con attenzione inserire sottili pinzette direttamente nel bulbo oculare attraverso il foro di where il nervo ottico esce dal posteriore.
- fare attenzione un'incisione con le forbici nel bulbo oculare dal posteriore al bordo della cornea. Lenti roditori occupano circa il 30% degli occhi. Fare queste incisioni attentamente, e non inserire le pinzette o forbici troppo in profondità nell'occhio per evitare di danneggiare l'obiettivo.
- Tagliare lungo la giunzione tra la cornea e nella sclera almeno mezzo giro del bulbo oculare.
- Premere delicatamente sulla cornea per rimuovere la lente dall'occhio attraverso l'apertura fatta in passi 1.4 e 1.5.
- Utilizzare pinza sottile punta diritta per rimuovere attentamente qualsiasi detriti di grandi dimensioni che è ancora attaccato alla lente. Visivamente la lente di eventuali danni prima di procedere con le misurazioni di rigidità.
2. Rigidità Misure
- Pesare almeno 10 vetrini dalla stessa scatola con una bilancia analitica. Trova il peso medio delle lamelle. Per coerenza, utilizzare la stessa confezione di lamelle per tutti gli esperimenti. Pre-bagnatoil coprioggetto e ad angolo retto specchio in 1x PBS a temperatura ambiente per almeno 2 ore prima di avviare esperimenti.
- Riempire la camera di misura (vedi figura 1) con 65 - 75 ml di PBS 1x. La camera di misurazione è stata fatta di plexiglas da un negozio di macchina in-house, e divots nella camera sono state fatte da un trapano a colonna impostato per la profondità desiderata con una punta da trapano appropriata. Lenti rimangono trasparenti in 1x PBS a temperatura ambiente per la durata della prova meccanica.
Figura 1:. Rigidità camera di misura Una fotografia che mostra le dimensioni della camera di misura rigidità misura con una varietà di zolle di diverse profondità e forme. Le zolle rotonde che si trovano a 200 micron o 300 micron di profondità (punte di freccia di colore giallo) sono utilizzati per le misurazioni su lenti del mouse. Divots sono 2 mm di diametro e 13 ~-. 14 mm dal bordo della camera Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Posizionare specchio ad angolo nella camera ad una distanza costante dal incavo che verrà utilizzato per tenere la lente. Assicurarsi che lo specchio non si sposta durante l'esperimento.
- Trasferire lenti sezionati per camera di misura con attenzione con una pinza sequestro o pinze curve.
- Prendete una vista dall'alto immagine della lente scaricato da sopra la sua testa. Prendete il mouse foto di lenti a 30X di ingrandimento con illuminazione da dissezione microscopio (in basso) e una sorgente di luce in fibra ottica sui lati destro e sinistro. Impostare l'alimentazione fibra ottica al 80% della massima intensità luminosa. Regolare la potenza di alimentazione sulla base di illuminazione ambientale, preferenze dell'utente e la qualità dell'immagine in base alle esigenze.
- Dai vista laterale immagine della lente a vuoto, che può essere visto attraverso la rispecchio GHT angolo. Se la telecamera non è calibrato, scattare una foto del bordo specchio a fuoco. Il bordo dello specchio è lungo 5 mm, e questa misurazione può successivamente essere utilizzato per determinare il pixel / mm e servire come una barra di scala nelle immagini.
- Posizionare lente nel divot, e confermare che l'obiettivo sia inserito in modo sicuro e dritto in incavo. Scatta una foto della lente prima di caricarla. L'obiettivo deve essere appoggiato nella zolla sulla sua anteriore o polo posteriore.
- Mettere 1 coprioggetto delicatamente sulla lente. Attendere 2 minuti per consentire al creep, e prendere un altro vista laterale immagine della lente caricato.
- Continuare ad aggiungere vetrini come al punto 2.8 e prendendo lato-vista le immagini dopo l'aggiunta di ogni vetrino come al punto 2.8 fino a quando vengono applicati un totale di 10 lamelle.
- Rimuovere tutte le lamelle. Attendere 2 minuti, e prendere una vista laterale immagine della lente (all'interno e all'esterno del divot) dopo aver rimosso tutte le lamelle.
Misurazione 3. Obiettivo Nucleus
- per determine la dimensione nucleo della lente, spostare l'obiettivo di un piatto pulito Petri riempita con PBS 1x.
- decapsulate delicatamente la lente con pinza sottile diritte.
- Spogliarci di cellule corticali fibra facendo rotolare la lente tra le dita guantate. Il nucleo della lente rimanente si sentirà come un marmo duro. Utilizzare questa procedura per isolare il nucleo sulle lenti per adulti a partire da 1 mese di età. Poiché il nucleo isolato è un corpo rigido, ulteriori prove meccaniche del nucleo lente non può essere eseguita utilizzando il metodo descritto.
- Lavare delicatamente il nucleo della lente in 1x PBS nella scatola di Petri.
- Posizionare il nucleo obiettivo posteriore nella camera di misura (non nel divot), e prendere una immagine del nucleo lente attraverso lo specchio ad angolo retto.
Figura 2:. A Lenti mouse compresso dal Coprioggetto (A) Schema e (B) fotografia della exl'installazione sperimentale che mostra un 2 mesi lente del mouse in una zolla di 200 micron di profondità nella camera di misura piena di PBS 1x. Uno specchio angolo retto e una fotocamera digitale montata su un microscopio dissezione stati usati per raccogliere le immagini della lente durante la compressione da coprioggetto. (C) Foto di viste sagittali di 2 mesi lente wild-type compressa in successione un numero crescente di vetrini fornito i dati grezzi per misurare i diametri assiali ed equatoriali e calcolando ceppi assiali ed equatoriali durante i test di compressione vetrino-based. Una riflessione della lente a volte può essere visto in i coprioggetti (più chiaramente visibile l'immagine del 1 vetrino in). Quando si effettuano misurazioni, ignorare il riflesso e misurare all'apice della lente. (D) Foto di vista sagittale del 2 mesi lente wild-type post-compressione e il nucleo della lente isolato. L'obiettivo post-compressione e nuclei isolati sono seduti al di fuori della incavo. Barre di scala, 1 mm. Questa cifra viene modificato da Gokhin, et al. PLoS ONE 2012 19. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Analisi 4. Immagine
- Misurare i diametri equatoriale e assiali delle lenti prima del carico e dopo ogni fase di carico utilizzando ImageJ o software simili. Misurare il diametro di ogni nucleo lente. Il nucleo della lente è quasi sferica così una misura in qualsiasi orientamento sarà sufficiente 19,21.
- Correggere la lente assiale diametri aggiungendo la profondità incavo utilizzato. Nella camera di misura, incavo oscurata 200 micron (lenti 2 mesi di età topo) o 300 micron (lenti 4 mesi di età e 8 mesi di età mouse) dello spessore assiale della lente.
- Calcolare il assiale e ceppi equatoriali dalle misurazioni del diametro della lente utilizzando l'equazione, ε = (d - d 0) / d 0, dove ε è la deformazione, d è la assiale o ediametro Quatorial a un determinato carico, e d 0 è il diametro assiale o equatoriale corrispondente al carico nullo.
- Tracciare assiale e ceppi equatoriali come funzioni del carico imposto (in mg).
- Tracciare assiale, equatoriale e diametri nucleari. Calcolare e tracciare le proporzioni obiettivo dividendo il diametro assiale dal diametro equatoriale.
- Calcolare e tracciare il volume della lente utilizzando l'equazione, volume = 4/3 × π × R e 2 × R A, dove r è il raggio E e R equatoriale A è il raggio assiale misurata dalla foto scattata nella fase 2.6. Questa equazione presuppone la lente è uno sferoide oblato (ellissoide) 1,22.
- Calcolare e tracciare il volume nucleare utilizzando l'equazione, volume = 4/3 × π × r N 3, dove r N è il raggio del nucleo cristallino come misurata dalla foto scattata al passo 3.5. Questa equazione assume il I nucleo della lentesa sfera 19,21.
- Calcolare e tracciare la frazione nucleare come il rapporto tra il volume nucleare per il volume obiettivo.
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Representative Results
La rigidità e dimensioni di 2, 4 e 8 mesi di età lenti di topo sono stati misurati. I topi sono stati tutti gli animali wild-type su un puro C57BL6 ceppo sfondo ottenuto dal Fondo Allevamento TSRI degli animali, e ogni obiettivo è stato caricato con da 1 a 10 lamelle. I ceppi assiali ed equatoriali sono stati calcolati in funzione del carico applicato misurando assiale e diametri equatoriale della lente dopo l'aggiunta di ciascun vetrino, quindi normalizzare ogni variazione di diametro al diametro scaricato corrispondente. Otto lenti di ogni età sono stati testati, ed i risultati sono espressi come media ± errore standard. Come mostrato in precedenza 19, deformazione assiale è funzione logaritmica di carico applicato (Figura 3A). C'è stata una diminuzione statisticamente significativa dipendente dall'età ceppi assiali ed equatoriali sotto il carico massimo applicato (figura 3), indicando che le lenti del mouse irrigidisce con l'età. Stmisurazioni pioggia erano altamente riproducibili attraverso le lenti della stessa età, come dimostrano i piccoli errori standard.
I dati di immagine raccolti durante questo esperimento sono stati usati anche per determinare alcune caratteristiche morfologiche altra lente (Figura 4). Come previsto, assiale e diametri equatoriale e il volume obiettivo aumentata con l'età (Figura 4A, 4B e 4D). Il rapporto indica che la lente ha un diametro equatoriale leggermente più grande del diametro assiale, e questo parametro non cambia con l'età (Figura 4C). Il diametro, il volume e la frazione del nucleo lente aumentavano con l'età (Figura 4E, 4F e 4G). Questi risultati suggeriscono che il nucleo della lente rimodella ad aumentare di dimensione relativa con l'invecchiamento della lente.
Questi dati mostrano che le lenti topo aumento della rigidità con l'età, simile a cambiamenti in unging lenti umane 9,15. Questi dati concordano anche con precedenti osservazioni fatte utilizzando un metodo simile 18 e Brillouin microscopia ottica 23 che le lenti del mouse aumento della rigidità con l'età. Altri due studi hanno utilizzato il metodo descritto per dimostrare che tropomodulin-1, un actina indicò-end capping proteine, CP49, una proteina filamento intermedio di perline, e aquaporin 0 sono necessari per mantenere la lente rigidezza 19,20. Con questo metodo, la pletora di modelli murini per patologie lenti e l'invecchiamento accelerato di topi può essere utilizzato per comprendere modifiche rigidità lente dovute alla variazione genetica e / o invecchiamento. Questo metodo può anche essere adattato per lenti da altre specie. Le dimensioni della camera utilizzata per questi esperimenti sono ottimizzati per le lenti di topo, ma possono essere facilmente scalati per lenti da specie più grandi. In futuro, sarebbe interessante per determinare se le dimensioni dell'obiettivo scale con rigidità lente tra le specie.
Figura 3:. Assiali ed equatoriali Curve Strain-carico per 2, 4 e 8 mesi (2M, 4M e 8M) Wild-tipo Lenti mouse (A) assiale ceppo di compressione tracciata in funzione del carico applicato ( mg). comp (B) equatorialeceppo ressive grafico in funzione del carico applicato (mg). Quattro e lenti a 8 mesi di età hanno mostrato meno sforzo di 2 mesi di età lenti a carichi massimi equivalenti, indicando un aumento della rigidità della lente con l'età. **, P <0,01. Si noti che l'asse Y è diversa tra (A) e (B). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Caratteristiche morfologiche del 2, 4 e 8 mesi (2M, 4M e 8M) Wild-tipo Lenti mouse (A) di diametro assiale e (B) del diametro equatoriale aumenta progressivamente con l'età. Il rapporto di aspetto lente (C) mostra che le lenti del mouse sono leggermente più ampio all'equatore lente. Volume Lens (D), diametro nucleare (E), il volume nucleare (F) e frazione nucleare (G) aumenta progressivamente con l'età. **, P <0.01. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diverse considerazioni importanti quando si utilizza questo metodo per misurare la rigidità della lente. Innanzitutto, i coprioggetti sono applicati alla lente con un angolo leggermente obliqua (8 - 8,5 °) rispetto al fondo della camera (θ). Questo si applica una piccola componente del carico equatoriale piuttosto che assialmente. Tuttavia, questo carico equatoriale è considerata trascurabile, perché il peccato θ ≈ 0.1 19. Se questo metodo è adattato per lenti più grandi, l'angolo delle coprioggetti al fondo della camera dovrebbe essere misurato per determinare se il carico equatoriale dovrebbe essere preso in considerazione in calcoli deformazione. In secondo luogo, è essenziale per consentire alla lente di equilibrare dopo l'aggiunta di ciascun coprioggetto. Il periodo di attesa di 2 minuti permette di deformazione in funzione del tempo (es., Creep) a verificarsi, in modo tale che le immagini sono prese solo quando la lente è in una forma di equilibrio 19. In terzo luogo, questo protocollo è ottimizzato per la misurazione della deformazione di compressione sulla mOuse lenti attraverso un ampio range dinamico dei carichi. Negli studi pilota, un carico applicato di 1.293 mg (vale a dire, dieci 18 x 18 mm coprioggetto) compresso la lente del mouse ad un ceppo massimo, oltre il quale aumentano i carichi non causano apprezzabile un'ulteriore deformazione. Ciò è dovuto alla presenza del nucleo lente rigida che non deforma apprezzabile sotto compressione 19. In quarto luogo, questo protocollo evita danni ai tessuti irreversibili. In esperimenti precedentemente pubblicati, sono stati osservati cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle lenti del mouse viene nuovamente carico, suggerendo che questo metodo non danneggiare la lente 19. Nella prova meccanicamente lenti di una specie diversa o lenti mutanti, test pilota dovrebbe essere fatto per determinare il carico massimo necessario per la massima deformazione ripetendo i punti 2.8 - 2.10 confrontando le curve sforzo-carico, diametri di obiettivi e volumi lenti tra la prima e la seconda Caricamento in corso. Infine, questo metodo fornisce una misura empirica della rigidità o f l'intera lente e non permette di distinguere i contributi di diversi tipi di cellule (cellule epiteliali, fibre corticali, fibre nucleari) e la capsula del cristallino per intero lenti proprietà meccaniche.
I ceppi assiali ed equatoriali sono riportati qui come funzioni del carico imposto. Precedenti studi hanno quantificato lente del mouse rigidità 19,21, resilienza 21 o la modifica del diametro 18 su carico applicato. Strain è una quantità adimensionale che consente il confronto diretto tra lenti di diverse dimensioni. Si noti che l'estensione equatoriale (ceppo positivo) avviene in concomitanza con la compressione assiale applicata (ceppo negativo) dovute alla conservazione del volume di lente (cioè, effetto Poisson). Tuttavia, i ceppi equatoriali osservati erano molto più piccole in valore assoluto rispetto ai ceppi assiali, indicando che questo metodo ha meno risoluzione di rilevare piccoli cambiamenti nel ceppo equatoriale rispetto alla deformazione assiale.
nt "> In sintesi, questo metodo semplice con un dispositivo facilmente montato per misurare la rigidità lente mouse può essere applicato in generale e ampiamente nella ricerca lente per capire meglio come mutazioni in proteine, patologie e / o invecchiamento influisce rigidità lente. Mentre le lenti del mouse no ospitare, questo metodo può ancora chiarire le proteine e le modifiche legate all'età che contribuiscono alla maggiore rigidità della lente, e potenzialmente contribuire nuove conoscenze per lo sviluppo di nuovi trattamenti per la presbiopia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
