Abstract
Ögat objektivet är ett öppet organ som bryter och fokuserar ljuset att bilda en klar bild på näthinnan. Hos människor, att ögonmuskler kontrakt deformera linsen, vilket leder till en ökning av objektivets optiska effekten att fokusera på närliggande föremål, en process som kallas boende. Åldersrelaterade förändringar i lins styvhet har kopplats till presbyopi, en minskning i linsen förmåga att rymma, och i förlängningen, behovet av läsglasögon. Även om mus linser inte rymma eller utveckla ålderssynthet, kan musmodeller ge ett ovärderligt genetiska verktyg för att förstå lins sjukdomar, och accelererat åldrande hos möss möjliggör studier av åldersrelaterade förändringar i linsen. Detta protokoll visar en enkel, exakt och kostnadseffektiv metod för att bestämma mus lins styvhet, med hjälp av täckglas av glas för att tillämpa sekventiellt ökande tryckbelastningar på linsen. Representativa data bekräftar att mus linser blir styvare med åldern, sommänskliga linser. Denna metod är mycket reproducerbar och kan potentiellt skalas upp till mekaniskt provlinser från större djur.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med rekommendationerna i handledningen för vård och användning av försöksdjur av National Institutes of Health och under ett godkänt protokoll av Institutional Animal Care och användning kommittén vid The Scripps Research Institute.
1. Lins Dissection
- Avliva möss enligt rekommendationerna i National Institutes of Health "Guide för skötsel och användning av försöksdjur" och godkända institution djuranvändning protokoll.
- Enucleate ögat från möss med hjälp av böjda pincett. Tryck vävnaden runt ögonen med pincett för att föra ögat ur vägguttaget, och sedan plocka ögat från sockeln med pincett. Överför ögon frisk 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i dissektion skålen.
- Avskurna synnerven så nära ögongloben som möjligt. Försiktigt och noggrant sätta fina raka pincett i ögongloben genom hålet where synnerven lämnar den bakre.
- Noggrant göra ett snitt med en sax in i ögongloben från den bakre till kanten av hornhinnan. Gnagare linser upptar ~ 30% av ögat. Gör noggrant dessa snitt, och inte in en pincett eller sax för djupt in i ögat för att undvika att skada linsen.
- Skär längs förbindelsen mellan hornhinnan och senhinnan åtminstone halvvägs runt ögongloben.
- Tryck försiktigt på hornhinnan för att avlägsna linsen från ögat genom öppning i steg 1,4 och 1,5.
- Använd fin spets raka pincett för att försiktigt ta bort alla stora partiklar som fortfarande är kopplad till linsen. Inspektera lins för eventuella skador innan man mätningarna styvhet.
2. Stelhet Mätningar
- Väga minst 10 täck från samma låda med hjälp av en analytisk balans. Hitta den genomsnittliga vikten av täck. För enhetlighetens skull använder samma låda täck för alla experiment. Pre-våtden täckglas och rätvinklig spegel i 1 x PBS vid rumstemperatur under åtminstone 2 h före start experiment.
- Fyll mätkammaren (se figur 1) med 65 - 75 ml 1x PBS. Mätkammaren var gjord av plexiglas med en egen verkstad och divots i kammaren gjordes av en pelarborrmaskin satt till önskat djup med en lämplig borr. Linser förbli öppen i 1x PBS vid rumstemperatur under varaktigheten av mekanisk provning.
Figur 1:. Styvhet mätkammare Ett foto som visar dimensionerna hos skräddarsydd styvhet mätkammare med en mängd divots med olika djup och former. De runda divots som är 200 um eller 300 um djup (gula pilspetsar) används för mätningar på mus linser. Divots är 2 mm i diameter och ~ 13-. 14 mm från kanten av kammaren Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Placera rätvinklig spegel in i kammaren på ett konstant avstånd från divot som kommer att användas för att hålla linsen. Se till spegeln rör sig inte under experimentet.
- Överför dissekerade linser till mätkammaren försiktigt med beslag pincett eller böjda pincett.
- Ta en topp-view bild av den obelastade linsen från direkt overhead. Ta mus lins bilder på 30X förstoring med belysning från dissekera mikroskop (botten) och en fiberoptisk ljuskälla på vänster och höger sida. Ställ den fiberoptiska strömförsörjningen till 80% av den maximala ljusintensiteten. Justera strömförsörjningsutgång baserat på omgivande ljus, användarpreferenser och bildkvalitet som krävs.
- Ta en sida-view bild av den obelastade lins, som kan ses genom riGHT-vinkel spegel. Om kameran inte är kalibrerad, ta en bild av spegelkanten i fokus. Spegeln kanten är 5 mm lång, och denna mätning kan senare användas för att bestämma pixel / mm och fungera som en skala bar i bilderna.
- Placera objektivet i divot, och bekräftar att linsen sitter säkert och rakt i divot. Ta en bild av linsen före lastning. Linsen ska vila i divot på sin främre eller bakre stolpen.
- Placera ett täck försiktigt på linsen. Vänta 2 min för att tillåta krypning, och ta en annan sida-view bild av den laddade linsen.
- Fortsätt att lägga täck som i steg 2,8 och med sido visa bilder efter tillsats av varje täck som i steg 2,8 tills totalt 10 täck tillämpas.
- Ta bort alla täck. Vänta två minuter och ta en sida-view bild av linsen (insidan och utsidan av divot) efter avlägsnande av alla täck.
3. Lins Nucleus Mätning
- att determine lins kärna storlek, flytta linsen till en ren petriskål fylld med 1x PBS.
- decapsulate försiktigt linsen med fina raka pincett.
- Slough bort kortikala fiberceller genom att rulla linsen mellan handskar fingrar. Den återstående linscellkärnan kommer att kännas som en hård marmor. Använd denna procedur för att isolera kärnan på vuxna linser börjar vid en månads ålder. Eftersom den isolerade kärnan är en stel kropp, inte kan utföras ytterligare mekanisk provning av linscellkärnan med hjälp av denna beskrivna metoden.
- Skölj försiktigt linskärnan i 1x PBS i en petriskål.
- Placera linskärnan tillbaka in i mätkammaren (inte i divot), och ta en bild av linskärnan genom det rätvinkliga spegel.
Figur 2: a. Mus linser Komprimerade av Täck (A) Schematisk och (B) Ett fotografi av experimental installation som visar en två månader gammal mus lins i en 200-um-djup divot i mätningen kammare fylld med 1x PBS. En rätvinklig spegel och en digital kamera monterad på en dissektion mikroskop användes för att samla bilder av linsen under kompression av täck. (C) Bilder av sagittala vyer av en två månader gammal vildtyp lins komprimeras med successivt ökande antal täck förutsatt att rådata för att mäta axiella och ekvatoriella diametrar och beräkna axiella och ekvatoriella stammar under täckbaserade tryckprovning. En återspegling av linsen kan ibland ses i täck (mest tydligt i en täck bilden). Vid mätningar ignorera reflektion och mät till toppen av linsen. (D) Bilder av sagittala vyer av två månader gamla vildtyp lins efter kompression och isolerade linskärnan. Efterkompressions lins och isolerad kärna sitter utanför divot. Skalstrecken, 1 mm. Denna siffra är modifierad från Gokhi et al. PLoS ONE, 2012 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Bildanalys
- Mät ekvatoriella och axiella diameter av linser före lastning och efter varje belastningssteg med hjälp av ImageJ eller liknande programvara. Mät diametern på varje lins kärna. Lins kärna är nästan sfärisk så en mätning vid varje orientering räcker 19,21.
- Korrigera linsen axiella diametrar genom att lägga till djupet av divot användas. I mätkammaren, skymmas divot 200 um (2 månader gamla mus linser) eller 300 pm (4 månader gamla och 8 månader gamla mus linser) av den axiella tjockleken hos linsen.
- Beräkna axiella och ekvatoriella stammar från mätningar linsen diameter med hjälp av ekvationen, ε = (d - d 0) / d 0, där ε är stam, är d axiell eller eekvatoriellt diameter vid en given belastning, och d 0 är motsvarande axiell eller ekvatoriell diameter vid nollbelastning.
- Plotta de axiella och ekvatoriella stammar som funktioner av den pålagda lasten (i mg).
- Rita axiella, Ekvatorial och nukleära diametrar. Beräkna och plotta sidförhållande linsen genom att dividera den axiella diametern av tvärsnittsdiametern.
- Beräkna och rita linsen volymen med ekvationen volym = 4/3 × π × r E 2 × r A, där r E är ekvatorial radie och r A är den axiella radie mätt från bild tagen i steg 2,6. Denna ekvation förutsätter linsen är en oval sfäroid (ellipsoid) 1,22.
- Beräkna och plotta kärn volymen med ekvationen volym = 4/3 × π × r N 3, där r N är radien på linskärnan mätt från bild tagen i steg 3,5. Denna ekvation förutsätter linskärnan isa sfären 19,21.
- Beräkna och plotta den nukleära fraktionen som förhållandet mellan den nukleära volymen till linsens volym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Styvheten och dimensionerna av 2-, 4- och 8 månader gamla mus linser mättes. Möss var alla vildtyp djur på en ren C57BL6 stam bakgrund erhålls från TSRI husdjursgenetik Facility, och varje lins laddades med 1 till 10 täck. De axiella och ekvatoriella stammar beräknades som en funktion av pålagt belastning genom att mäta den axiella och ekvatoriella diametrar av linsen efter tillsatsen av varje täckglas, och sedan normalisera varje ändring i diameter till motsvarande obelastade diameter. Åtta linser från varje ålder testades, och resultaten är uttryckta som medelvärdet ± standardfel. Såsom visats tidigare 19, är axiellt stam en logaritmisk funktion av pålagd last (figur 3A). Det fanns en statistiskt signifikant åldersberoende minskning av axiella och ekvatoriella stammar under maximal pålagd last (Figur 3), vilket indikerar att mus lins stelnar med åldern. stregnmätningar var mycket reproducerbar över linser i samma ålder, vilket framgår av de små standardfel.
De bilddata som samlats in under detta experiment användes också för att bestämma flera andra lins morfologiska egenskaper (Figur 4). Som väntat, axiella och ekvatoriella diametrar och linsvolymen ökade med ålder (Figur 4A, 4B och 4D). Sidförhållandet indikerar att linsen har en något större tvärsnittsdiametern än axiella diameter, och denna parameter inte förändras med åldern (figur 4C). Diametern, volym och andel av linskärnan ökade med åldern (figur 4E, 4F och 4G). Dessa resultat tyder på att linskärnan remodels att öka i relativ storlek som lins åldrar.
Dessa uppgifter visar att mus linser ökar i styvhet med ålder, liknande förändringar i enging mänskliga linser 9,15. Dessa data är också överens med tidigare observationer som gjorts med hjälp av en liknande metod 18 och Brillouin optisk mikroskopi 23 som mus linser ökar i styvhet med åldern. Två andra studier har använt den beskrivna metoden för att visa att tropomodulin-1, en aktin pekade-ändskyddande protein, CP49, en pärlstav mellanliggande filament protein, och aquaporin 0 behövs för att bibehålla lins styvhet 19,20. Med denna metod kan den uppsjö av musmodeller för lins sjukdomar och accelererat åldrande hos möss användas för att förstå lins styvhet förändringar på grund av genetisk variation och / eller åldring. Denna metod kan också anpassas för linser från andra arter. Dimensionerna hos kammaren som används för dessa experiment är optimerade för mus linser, men kan lätt skalas upp för objektiv från större arter. I framtiden skulle det vara intressant att bestämma huruvida lins storlek skalor med lins stelhet över arter.
Figur 3:. Axiella och ekvatoriella Strain-belastningskurvor för 2-, 4- och 8-månader gammal (2M, 4M och 8M) Vildtyp Mus Objektiv (A) Axial tryckpåkänning ritas som en funktion av den anbringade belastningen ( mg). (B) Ekvatorial kompressive stam ritas som en funktion av den anbringade belastningen (mg). Fyra och åtta månader gamla linser uppvisade mindre belastning än två månader gamla linser på motsvarande maximal belastning, vilket tyder på en ökning av lins styvhet med åldern. **, P <0,01. Observera att Y-axeln skiljer mellan (A) och (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Morfologiska egenskaperna hos 2-, 4- och 8 månader gamla (2M, 4M och 8M) Vildtyp mus objektiv (A) Axial diameter och (B) tvärsnittsdiametern progressivt ökar med åldern. Linsbildförhållande (C) visar att mus linser är något bredare vid linsens ekvator. Lins volym (D), kärndiameter (E), kärnkraft volym (F) och nukleära fraktionen (G) successivt ökar med åldern. **, P <0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga faktorer när man använder denna metod för att mäta lins styvhet. Först är täckglasen appliceras på linsen i en något sned vinkel (8-8,5 °) med avseende på botten av kammaren (θ). Detta kommer att gälla en mycket liten komponent av lasten ekvatoriellt snarare än axiellt. Men detta ekvatorial belastning vara försumbar eftersom synd θ ≈ 0,1 19. Om denna metod är anpassad för större linser, skulle vinkeln på täckglasen till botten av kammaren behöver mätas för att avgöra om ekvatorial belastning bör vägas in i stam beräkningar. För det andra är det viktigt att göra det möjligt för linsen att komma i jämvikt efter tillsats av varje täckglas. Väntetiden på 2 minuter möjliggör tidsberoende deformation (dvs., Krypning) ske, så att bilderna endast tas när linsen är en jämviktsform 19. För det tredje är detta protokoll optimerad för att mäta tryckpåkänning på mOuse linser över ett brett dynamiskt område av laster. I pilotstudier, en applicerad belastning av 1293 mg (dvs tio 18 x 18 mm täck) komprimeras musen linsen till en maximal påfrestning, bortom vilken ökade belastningar inte orsakar märkbar ytterligare deformation. Detta beror på närvaron av den styva linscellkärnan som inte deformeras märkbart under kompression 19. För det fjärde undviker detta protokoll irreversibel vävnadsskada. I tidigare publicerade experiment, observerades inga förändringar i de mekaniska egenskaperna hos mus linser observeras vid upprepad belastning, vilket tyder på att denna metod inte skadar linsen 19. När mekaniskt testa linser av en annan art eller muterade linser, bör pilottester göras för att bestämma den maximala belastningen som krävs för maximal påfrestning genom att upprepa steg från 2,8 till 2,10 och jämföra dragbelastningskurvor, objektivdiameter och lins volymer mellan den första och andra läser in. Slutligen ger denna metod en empirisk mätning av styvheten o f hela linsen och kan inte skilja bidragen från olika celltyper (epitel-celler, kortikala fibrer, kärnfibrer) och linskapseln till hel-lins mekaniska egenskaper.
De axiella och ekvatoriella stammar plottas här som funktioner av den pålagda lasten. Tidigare studier har kvantifierat mus lins styvhet 19,21, elasticitet 21 eller förändringen i diameter 18 på tillämpad belastning. Stammen är en dimensionslös storhet som tillåter direkt jämförelse mellan linser av olika storlekar. Observera att ekvatorial förlängning (positiv stam) sker samtidigt med den applicerade axiella kompression (negativ stam) på grund av bevarande av linsvolymen (dvs Poisson effekt). Dock de observerade ekvatoriella stammar var mycket mindre i absolut magnitud än de axiella stammar, vilket tyder på att denna metod har mindre upplösning för att detektera små förändringar i ekvatorial stam jämfört med axiella påfrestningar.
nt "> Sammanfattningsvis kan denna enkla metod med en lättmonterad enhet för mätning av mus lins styvhet tillämpas allmänt och brett lins forskning för att bättre förstå hur mutationer i proteiner, sjukdomar och / eller åldrande påverkar lins styvhet. Medan mus linser inte rymma denna metod kan fortfarande belysa proteinerna och åldersrelaterade förändringar som bidrar till ökad lins stelhet och eventuellt bidra med ny kunskap till att utveckla nya behandlingar för presbyopi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
