Abstract
A lente do olho é um órgão transparente que refrata e focaliza a luz para formar uma imagem nítida sobre a retina. Nos seres humanos, os músculos ciliares contrato para deformar a lente, levando a um aumento na potência óptica das lentes para focar objetos próximos, um processo conhecido como acomodação. mudanças relacionadas à idade na rigidez da lente têm sido associados a presbiopia, uma redução na capacidade da lente para acomodar, e, por extensão, a necessidade de óculos de leitura. Mesmo que as lentes do mouse não acomodar ou desenvolver presbiopia, modelos de ratos pode fornecer uma ferramenta genética inestimável para patologias lente compreensão, eo envelhecimento acelerado observado em camundongos permite o estudo de mudanças relacionadas à idade na lente. Este protocolo demonstra um método simples, precisa e de custo eficaz para determinar a rigidez da lente do mouse, utilizando lamelas de vidro para aplicar sequencialmente crescente cargas de compressão na lente. Os dados representativos confirmar que as lentes do mouse se tornar mais rígida com a idade, comolentes humanas. Este método é altamente reprodutível e pode, potencialmente, ser ampliados por meios mecânicos lentes de teste a partir de animais maiores.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelos Institutos Nacionais de Saúde e sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal no Scripps Research Institute.
1. Lens Dissection
- Euthanize camundongos acordo com as recomendações dos Institutos Nacionais de Saúde "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" e protocolos de uso instituição animais aprovados.
- Enuclear o olho de ratos usando uma pinça curva. Deprimir o tecido em volta do olho com a pinça para trazer o olho para fora da tomada, e depois arrancar o olho do soquete com a pinça. Transferir os olhos ao fosfato 1x salina fresca tamponada (PBS) no prato de dissecação.
- Cortar o nervo óptico tão perto do globo ocular possível. Suavemente e com cuidado insira uma pinça reta finos no globo ocular através do wher buracoe o nervo óptico sai do posterior.
- Cuidadosamente fazer uma incisão com tesoura no globo ocular a partir do posterior para o bordo da córnea. lentes de roedores ~ ocupar 30% do olho. Faça essas incisões cuidadosamente, e não introduza pinças ou tesouras muito profundo no olho para evitar danificar a lente.
- O corte ao longo da junção entre a córnea e a esclera, pelo menos, a meio caminho em torno do globo ocular.
- Com cuidado, empurre sobre a córnea para remover a lente do olho, através da abertura feita nas etapas 1.4 e 1.5.
- Use uma pinça ponta reta finos para remover cuidadosamente qualquer grande detritos que ainda está ligado à lente. inspecionar visualmente a lente por qualquer dano antes de prosseguir com as medidas de rigidez.
2. Medidas de rigidez
- Pesar pelo menos 10 lamelas a partir da mesma caixa usando uma balança analítica. Encontre o peso médio das lamelas. Para consistência, use a mesma caixa de lamelas para todos os experimentos. Pré-molhadoAs lamelas e em ângulo recto espelho em 1x PBS à temperatura ambiente durante pelo menos duas horas antes de começar as experiências.
- Encha a câmara de medição (ver Figura 1) com 65 - 75 ml de 1x PBS. A câmara de medição foi feita de Plexiglas por uma loja de máquina em casa, e divots na câmara foram feitas por uma imprensa de broca ajustado para a profundidade desejada com uma broca apropriada. Lentes permanecer transparente em 1x PBS, à temperatura ambiente, durante a duração do teste mecânico.
Figura 1:. Rigidez Medição Secção Uma foto que mostra as dimensões da câmara de medição de rigidez feito por medida com uma variedade de torrões de diferentes profundidades e formas. Os divots redondas que são 200 mm ou 300 mm de profundidade (setas amarelas) são utilizados para as medições em lentes de rato. Divots são 2 mm de diâmetro e 13 ~-. 14 mm a partir da borda da câmara Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque espelho de ângulo direito para dentro da câmara a uma distância constante do torrão que vai ser usada para segurar a lente. Certifique-se o espelho não se move durante o experimento.
- Transferência de lentes dissecados a câmara de medição com cuidado com apreensão fórceps ou pinças curvas.
- Dê uma vista de cima imagem da lente descarregado directamente de cima. Tome rato fotos lente em 30X de ampliação com iluminação de microscópio de dissecação (inferior) e uma fonte de luz de fibra óptica nas laterais esquerda e direita. Definir a fonte de alimentação da fibra óptica a 80% da intensidade de luz máxima. Ajustar a saída da fonte de alimentação com base na iluminação ambiente, a preferência do usuário e qualidade de imagem, conforme necessário.
- Dê uma vista lateral imagem da lente sem carga, o que pode ser visto através do riespelho GHT-ângulo. Se a câmera não está calibrado, tirar uma foto da borda do espelho no foco. A aresta do espelho é de 5 mm de comprimento, e essa medida pode depois ser usado para determinar a pixels / mm e servir como uma barra de escala nas imagens.
- lente lugar no torrão, e confirme que a lente está sentado de forma segura e em linha reta no torrão. Tire uma foto da lente antes do carregamento. A lente deve estar descansando na torrão sobre o seu anterior ou pólo posterior.
- Coloque uma lamela suavemente sobre a lente. Aguarde 2 min para permitir a fluência, e pegue outro lado-vista de imagem da lente carregado.
- Continue adicionando lamelas como no passo 2.8 e tendo side-ver fotos após a adição de cada lamela como no passo 2.8 até um total de 10 lamelas são aplicadas.
- Remova todas as lamelas. Aguarde 2 min, e dar uma visão lateral imagem da lente (dentro e fora do torrão) após a remoção de todas as lamelas.
Medição 3. Lens Nucleus
- para determine o tamanho núcleo da lente, mover a lente para uma placa de Petri limpa preenchido com 1x PBS.
- Gentilmente decapsulate a lente usando uma pinça reta finos.
- Slough fora das células das fibras corticais por rolando a lente entre os dedos enluvados. O núcleo do cristalino remanescente vai se sentir como um mármore duro. Usar este procedimento para isolar o núcleo em lentes de adultos a partir de 1 mês de idade. Uma vez que o núcleo isolado é um corpo rígido, mais ensaios mecânica do núcleo da lente não pode ser executada utilizando este método descrito.
- Lave o núcleo da lente em 1x PBS numa placa de Petri.
- Coloque o núcleo da lente de volta para a câmara de medição (não no torrão), e tomar uma imagem do núcleo da lente através do espelho de ângulo direito.
Figura 2:. A Lenses mouse comprimido por Lamelas (A) Esquema e (B) fotografia do exconfiguração perimental mostrando uma lente de 2 meses de idade mouse em um torrão de 200 mm de profundidade na câmara de medição preenchida com 1x PBS. Um espelho ângulo direito e uma câmera digital acoplada a um microscópio de dissecação foram usadas para recolher imagens da lente durante a compressão por lamelas. (C) Fotos de pontos de vista sagital de um 2 meses de idade lente de tipo selvagem comprimido sucessivamente um número crescente de lamelas, desde que os dados brutos para medir diâmetros axiais e equatoriais e calculando tensões axiais e equatoriais durante o teste de compressão à base de lamela. A reflexão da lente pode, por vezes, ser visto nas lamelas (mais claramente visível na imagem uma lamela). Ao fazer medições, ignorar a reflexão e medir até o ápice da lente. (D) Fotos de pontos de vista sagital dos 2 meses de idade, do tipo selvagem lente pós-compressão eo núcleo isolado lente. A lente pós-compressão e núcleo isolado está sentado fora do torrão. Barras de escala, de 1 mm. Este valor é modificado a partir Gokhin, et al. PLoS ONE, 19, 2012. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Análise 4. Imagem
- Medir diâmetros equatoriais e axiais de lentes antes do carregamento e após cada etapa de carregamento usando ImageJ ou software similar. Medir o diâmetro de cada núcleo da lente. O núcleo da lente é esférica de modo quase uma medição em qualquer orientação será suficiente 19,21.
- Corrigir a lente axial diâmetros adicionando a profundidade do torrão utilizado. Na câmara de medição, o torrão obscurecido 200 uM (lentes de 2 meses de idade) ou de ratinho (300 um lentes de 4 meses de idade e 8 meses de idade) do rato da espessura axial da lente.
- Calcule o axial e estirpes equatoriais a partir das medições do diâmetro da lente usando a equação, ε = (d - d 0) / d 0, onde ε é a tensão, d é a axial ou ediâmetro quatorial a uma determinada carga, e d é o diâmetro 0 axial ou equatorial correspondente a uma carga nula.
- Traça-se a estirpes axial e equatorial como funções da carga aplicada (em mg).
- Traçar a axial, equatorial e diâmetros nucleares. Calcular e traçar a relação de aspecto lente dividindo o diâmetro axial pelo diâmetro equatorial.
- Calcular e definir o volume da lente usando a equação, Volume = 4/3 x π × 2 × R e R a, em que Re é o raio equatorial e R a é o raio medido a partir axial da fotografia tirada no passo 2.6. Esta equação assume a lente é um esferóide oblato (elipsóide) 1,22.
- Calcular e definir o volume nuclear utilizando a equação, Volume = 4/3 x π × R 3 N, em que R N é o raio do núcleo da lente, conforme medido a partir da fotografia tirada no passo 3.5. Esta equação assume que o núcleo da lente iesfera sa 19,21.
- Calcular e representar graficamente a fracção nuclear, tal como a razão do volume nuclear para o volume da lente.
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Representative Results
A rigidez e dimensões de lentes 2-, 4- e 8 meses de idade rato foram medidos. Os ratinhos foram todos os animais de tipo selvagem sobre um fundo puro estirpe C57BL6 obtido a partir da criação de animais Facilidade TSRI animal, e cada lente foi carregado com 1 a 10 lamelas. As estirpes axiais e equatoriais foram calculadas como uma função da carga aplicada através da medição do diâmetro equatorial e axial da lente após a adição de cada lamela, e depois normalizando a cada mudança de diâmetro com o diâmetro correspondente descarregado. Oito lentes a partir de cada idade foram testadas, e os resultados são expressos como o ± erro padrão da média. Como mostrado anteriormente 19, deformação axial é uma função logarítmica da carga aplicada (Figura 3A). Houve uma diminuição estatisticamente significativa dependente da idade em estirpes axiais e equatoriais sob a carga máxima aplicada (Figura 3), indicando que a lente rato endurece com a idade. Stmedições chuva eram altamente reprodutível entre as lentes da mesma idade, como demonstrado pelos pequenos erros padrão.
Os dados de imagem recebidos no decurso desta experiência também foram utilizadas para determinar várias características morfológicas outra lente (Figura 4). Como esperado, axial e equatorial diâmetros e o volume da lente aumentaram com a idade (Figura 4A, 4B e 4D). A proporção indica que a lente tem um diâmetro equatorial ligeiramente maior que o diâmetro axial, e este parâmetro não se alterou com a idade (Figura 4C). O diâmetro, o volume e a fracção do núcleo da lente aumentaram com a idade (Figura 4E, 4F e 4G). Estes resultados sugerem que o núcleo da lente remodela a aumentar em tamanho em relação com o envelhecimento da lente.
Estes dados mostram que as lentes de rato aumento da rigidez com a idade, semelhante às mudanças numaging lentes humanos 9,15. Estes dados também concordam com as observações anteriores efectuadas utilizando um método semelhante 18 e por microscopia óptica de Brillouin 23 que as lentes de rato aumento da rigidez com a idade. Dois outros estudos têm utilizado o método descrito para mostrar que tropomodulin-1, um actina apontou-end capping proteínas, CP49, uma proteína filamento intermediário frisada, e aquaporin 0 são necessários para manter a lente rigidez 19,20. Com este método, a multiplicidade de modelos de ratinhos para patologias de lente e o envelhecimento acelerado de ratinhos podem ser utilizados para compreender alterações lente de rigidez devido a variação genética e / ou envelhecimento. Este método também pode ser adaptado para as lentes a partir de outras espécies. As dimensões da câmara utilizada para estas experiências são optimizados para lentes de rato, mas pode ser facilmente aumentada a escala para lentes de espécies maiores. No futuro, seria interessante determinar se o tamanho da lente escalas com a rigidez da lente entre as espécies.
Figura 3:. Axial e equatorial Curvas estirpe de carga para 2, 4 e 8 meses de idade (2M, 4M e 8M) de tipo selvagem do rato Lentes (A) axial tensão de compressão representada graficamente como uma função da carga aplicada ( mg). comp (B) Equatorialestirpe ressive representados graficamente como uma função da carga aplicada (mg). Quatro e lentes de 8 meses de idade apresentaram menos tensão do que as lentes de 2 meses de idade em cargas máximas equivalentes, indicando um aumento na rigidez da lente com a idade. **, P <0,01. Note-se que o eixo Y é diferente entre (A) e (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Características morfológicas de 2, 4 e 8 meses de idade (2M, 4M e 8M) do tipo selvagem mouse Lenses (A) diâmetro axial e (B) diâmetro equatorial aumentar progressivamente com a idade. A relação de aspecto da lente (C) mostra que as lentes de rato são ligeiramente mais largos no equador do cristalino. volume de Lente (D), o diâmetro nuclear (E), o volume nuclear (F) e a fracção nuclear (L) aumentar progressivamente com a idade. **, P <0,01. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há várias considerações importantes quando se usa este método para medir a rigidez da lente. Em primeiro lugar, as lamelas são aplicados para a lente com um ângulo ligeiramente oblíquo (8-8,5 °) em relação ao fundo da câmara (θ). Isto aplica-se um componente muito pequeno da carga equatorial ao invés de axial. No entanto, essa carga equatorial é considerado insignificante, porque o pecado θ ≈ 0,1 19. Se este método é adaptado para lentes maiores, o ângulo das lamelas para o fundo da câmara que têm de ser medidos para determinar se a carga equatorial deve ser tido em conta em cálculos de deformação. Em segundo lugar, é crucial para permitir que a lente se equilibrar, depois da adição de cada lamela. O período de espera de 2 minutos permite que a deformação dependente do tempo (isto é., A deformação) a ocorrer, de modo a que apenas as imagens são tiradas quando a lente está em um formato de equilíbrio 19. Em terceiro lugar, este protocolo é otimizado para medir tensão de compressão em mOuse lentes através de uma ampla faixa dinâmica de cargas. Em estudos-piloto, uma carga aplicada de 1293 mg (ou seja, dez lamelas 18 x 18 mm) compactada a lente do rato para uma estirpe máximo, além do qual o aumento de cargas não provocam apreciável deformação adicional. Isto é devido à presença do núcleo da lente rígida que não se deforma apreciavelmente 19 sob compressão. Em quarto lugar, este protocolo evita prejuízos irreversíveis. Em experiências anteriormente publicados, não há mudanças nas propriedades mecânicas das lentes de rato foram observadas após o carregamento de repetição, sugerindo que este método não danifica a lente 19. Quando mecanicamente testando as lentes de uma espécie diferente ou lentes de mutantes, os testes piloto deve ser feito para determinar a carga máxima necessária para a tensão máxima, repetindo os passos 2,8-2,10 e comparar as curvas de deformação de carga, diâmetros de lente e volumes lente entre o primeiro e segundo Carregando. Finalmente, este método proporciona uma medida empírica da rigidez ó f toda a lente e não é possível diferenciar as contribuições de diferentes tipos de células (células epiteliais, fibras, fibras corticais nucleares) e a cápsula da lente para as propriedades mecânicas de toda a lente.
As estirpes axiais e equatoriais são representados aqui como funções da carga imposta. Estudos anteriores quantificados lente do mouse rigidez 19,21, a resiliência 21 ou a mudança de diâmetro de 18 em cima da carga aplicada. A estirpe é uma quantidade adimensional que permite a comparação directa entre as lentes de tamanhos diferentes. Note-se que a extensão equatorial (estirpe positivo) ocorre simultaneamente com a aplicação de compressão axial (estirpe negativa) devido à conservação do volume da lente (ou seja, o efeito de Poisson). No entanto, as estirpes equatoriais observadas foram muito menor em valor absoluto do que as estirpes axiais, indicando que este método tem menos resolução para detectar pequenas alterações na tensão equatorial em relação à tensão axial.
nt "> Em resumo, este método simples com um dispositivo de fácil montagem para medir a rigidez da lente do mouse pode ser aplicado de maneira geral e amplamente em pesquisa lente para entender melhor como mutações em proteínas, patologias e / ou envelhecimento afeta a rigidez da lente. Quando as lentes do rato não acomodar, este método ainda pode elucidar as proteínas e modificações relacionadas com a idade que contribuem para o aumento da rigidez da lente, e, potencialmente, contribuir com novos conhecimentos para o desenvolvimento de novos tratamentos para presbiopia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
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