Abstract
Göz merceği kırar ve retinada net bir görüntü oluşturmak için ışık odaklanan şeffaf bir organdır. İnsanlarda, siliyer kaslar kasılır yakındaki nesnelere odaklanmak lens optik güç, konaklama olarak bilinen bir süreç içinde bir artışa yol açarak, lensi deforme etmek. Lens sertliği yaşa bağlı değişiklikler presbiyopi bağlantılı olmuştur, uzantısına göre karşılamak için objektif yeteneğini azalma ve, okuma gözlükleri için gereklidir. Fare lensler karşılamak ya da presbiyop geliştirmek değil olsa bile, fare modelleri anlayış lens patolojileri için paha biçilmez bir genetik araç sağlayabilir ve farelerde gözlenen hızlandırılmış yaşlanma lens yaşa bağlı değişikliklerin çalışmayı sağlar. Bu protokol, fare lens sertliği belirleyen sırayla uygulamak lens üzerine sıkıştırma yüklerini artan cam lamelleri kullanarak, basit, hassas ve düşük maliyetli yöntem gösterilmektedir. Temsilcisi veri fare lensler gibi, yaşla birlikte daha sert hale teyitİnsan lensler. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve potansiyel büyük hayvanlar test lensleri mekanik olarak kadar ölçeklendirilebilir.
Protocol
Bütün hayvan prosedürleri Scripps Araştırma Enstitüsü'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından Sağlık ve onaylı protokol çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuzu'nda tavsiyeleri doğrultusunda yapıldı.
1. Mercek Diseksiyon
- Sağlık "Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu" National Institutes ve onaylanmış kuruluş hayvan kullanım protokolleri önerilere göre fareler Euthanize.
- Kavisli bir forseps kullanılarak farelerden göz aydınlatmak. soketten göz getirmek ve daha sonra forseps ile soketten göz koparmak için forseps ile göz etrafında doku basınız. diseksiyon çanak taze 1x fosfat tamponlu salin (PBS) gözleri aktarın.
- mümkün olduğunca göz küresinin kadar yakın optik siniri kesti. Yavaşça ve dikkatlice delik nereye yoluyla küresi içine ince düz bir cımbız eklemeke optik sinir posterior çıkar.
- Dikkatle korneanın kenarından posterior göz küresi içine makas ile bir kesi yapmak. Kemirgen lensler gözün ~% 30 işgal. dikkatle bu kesiler yapmak ve lensi zarar vermemek için çok derin göz içine cımbız veya makas takmayın.
- göz küresi etrafında en az yarım kornea ve sklera arasındaki kavşakta boyunca kesilir.
- Yavaşça adımlarda 1.4 ve 1.5 yapılan açıklıktan göz merceği kaldırmak için kornea üzerinde itin.
- dikkatle hâlâ lense bağlı herhangi bir büyük enkaz kaldırmak için ince uçlu düz forseps kullanın. Görme sertlik ölçümlerine geçmeden önce herhangi bir hasar lensi kontrol edin.
2. Sertlik Ölçümleri
- bir analitik terazi kullanarak aynı kutudan en az 10 lamelleri tartılır. lamelleri ortalama ağırlığını bulun. Tutarlılık için, tüm deneyler için lamelleri aynı kutusunu kullanın. Ön-yaşDeney başlamadan önce en az 2 saat oda sıcaklığında 1 x PBS içinde lamelleri ve sağ-açılı ayna.
- 1x PBS 75 ml - ölçüm gözüne doldurun 65 ile (Şekil 1 e bakınız). Ölçüm odası bir in-house makine atölyesi tarafından pleksiglas üzerinden yapıldığı ve odasında Divots uygun bir matkap ucu ile istenilen derinliğe kadar ayarlanmış bir matkap basın tarafından yapılmıştır. Lensler mekanik test süresince, oda sıcaklığında 1 x PBS içinde saydam kalır.
Şekil 1:. Sertlik Ölçüm Odası farklı derinliklerde ve şekiller divots çeşitli ısmarlama sertlik ölçüm odasının boyutlarını gösteren bir fotoğraf. 200 mikron veya 300 mikron derin (sarı ok başları) olan yuvarlak Divots fare lensler üzerinde ölçümler için kullanılmaktadır. Divots 2 mm çapında ve ~ 13 vardır-. Odanın kenarından 14 mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- lens tutmak için kullanılacak çimen sabit bir mesafede odasına dik açılı ayna yerleştirin. Ayna deney sırasında hareket olmadığından emin olun.
- dikkatle ele geçirmek forseps veya kavisli bir forseps ile ölçüm odasına transfer disseke lensler.
- tepeme gelen yüksüz lens bir üst görünüm resim çekin. mikroskop (altta) ve sol ve sağ tarafta bir fiber optik ışık kaynağı diseksiyon gelen aydınlatma ile 30X büyütmede fare lens fotoğraf çekmek. Maksimum ışık yoğunluğu% 80 fiber optik güç kaynağı olarak ayarlayın. gerektiği gibi ortam aydınlatması, kullanıcı tercihi ve resim kalitesine dayalı güç kaynağı çıkışını ayarlayın.
- ri aracılığıyla görülebilir yüksüz lensin yan görünüm resim çekinGHT-açılı ayna. Kamera kalibre değilse, odak ayna kenarına bir resim çekmek. Ayna kenarı 5 mm uzunluğunda ve bu ölçü daha sonra piksel / mm belirlemek ve görüntülerde bir ölçek çubuğu olarak hizmet için kullanılabilir.
- Yeri çimen içine lens ve lens çimen güvenli ve düz oturduğundan emin olun. yüklemeden önce lensin bir fotoğrafını çekin. lens, ön veya arka direğe çimen istirahat edilmelidir.
- lens üzerine yavaşça 1 lamel yerleştirin. sürünme izin vermek için 2 dakika bekleyin ve yüklü lens başka yan görünüm resim çekmek.
- Adım 2.8 gibi lamelleri ekleme ve 10 lamelleri toplam uygulanır kadar adım 2.8 gibi her lamel eklenmesinden sonra yan görünüm Fotoğraf çekmeye devam edin.
- Tüm lamelleri çıkarın. 2 dakika bekleyin ve tüm lamelleri çıkardıktan sonra lens (iç ve dış çimen ve) bir yan bakışı resim çekmek.
3. Objektif Nucleus Ölçümü
- unsurlar içinLens çekirdeği boyutu ine, 1x PBS ile dolu temiz bir Petri kabı objektif hareket.
- Yavaşça ince düz forseps kullanarak lensi açarlar.
- Slough off eldivenli parmakları arasında merceği yuvarlayarak kortikal lif hücreleri. Kalan lens çekirdeği sert bir mermer gibi hissedeceksiniz. yaş 1 ay başlayan yetişkin lensler üzerinde çekirdeğini izole etmek için bu yordamı kullanın. İzole çekirdeği katı bir cisim olduğundan, mercek çekirdeğin ileri mekanik test, bu anlatılan yöntemi kullanarak yapılamaz.
- Yavaşça Petri kabındaki 1x PBS lens çekirdeği durulayın.
- geri ölçüm odasına (değil çimen olarak) içine lens çekirdeği koyun ve dik açılı ayna aracılığıyla mercek çekirdeğinin bir görüntü alır.
Şekil 2:. Ex lameller tarafından Sıkıştırılmış bir fare Lensler (A) şematik ve (B) fotoğraf1x PBS ile dolu ölçüm odasında 200 mikron derinliğinde çimen içinde 2 aylık fare lensi gösteren deneysel bir kurulum. Bir dik açı ayna ve bir diseksiyon mikroskobu üzerine monte edilmiş bir dijital kamera lamelleri ile sıkıştırma sırasında lens görüntüleri toplamak için kullanılmıştır. (C) arka arkaya lamelleri artan sayıda sıkıştırılan 2 aylık vahşi tip lensin sagital görüş Fotoğraflar eksenel ve ekvatoral çapları ölçülerek ve lamel tabanlı sıkıştırma testi sırasında eksenel ve ekvatoral suşları hesaplamak için ham veri sağladı. lensin bir yansıması zaman lamelleri (çoğu açıkça görülebilir 1 lamel görüntüde) görülebilir. ölçümleri yaparken, yansıma görmezden ve lensin apekse ölçün. (D) 2 aylık vahşi tip objektif sonrası sıkıştırma ve izole objektif çekirdeğin sagital manzarası fotoğrafları. Post-sıkıştırma objektif ve izole çekirdek çimen dışında oturuyor. Ölçek çubukları, 1mM. Bu rakam, gökh modifiye edilirve ark. PLoS biri 2012 yılında 19. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4. Görüntü Analizi
- yüklemeden önce ve ImageJ veya benzer bir yazılım kullanarak her yükleme aşamasından sonra lenslerin ekvatoral ve eksenel çaplarını ölçün. Her mercek çekirdeğinin çapını ölçün. Herhangi bir yönde bir ölçüm 19,21 yeterli olacaktır bu yüzden objektif çekirdeği neredeyse küreseldir.
- kullanılan çimen derinliğini ekleyerek çapları eksenel lensi düzeltin. Ölçüm odasında, çimen lens eksenel kalınlığı 200 mikron (2 aylık fare lensler) ya da 300 mikron (4 aylık ve 8 aylık fare lensler) gizlenmiş.
- , Ε = (d - d 0) denklem kullanılarak lens çapı ölçümleri eksenel ve ekvatoral suşları hesaplayın ε suşu / d, 0, d eksenel veya equatorial belirli bir yük altında çapı ve d, 0, sıfır yükte karşılık gelen eksenel veya ekvatoral çapıdır.
- (Mg olarak) uygulanan yükün fonksiyonu olarak eksenel ve ekvatoral suşları çizilir.
- eksenel Ekvator ve nükleer çapları çiziniz. Hesaplayın ve ekvator çapı eksenel çapı bölerek mercek boy oranını arsa.
- Hesaplamak ve denklem kullanılarak objektif hacmini arsa hacmi = r E Ekvator yarıçapı ve r A adımında 2.6 alınan resimden ölçülen eksenel yarıçap olduğunu 4/3 × π × r E 2 × r A,. Bu denklem objektif bir basık küremsi (elipsoid) 1,22 olduğunu varsayar.
- Hesaplayın ve adım 3.5 alınan resimden ölçülen r N objektif çekirdeğinin yarıçapı r N 3, × denklemi, hacim = 4/3 × π kullanarak nükleer hacim arsa. Bu denklem lens çekirdeği i varsayarsa küre 19,21.
- Hesaplayın ve lens hacmine nükleer hacim oranı olarak nükleer fraksiyonu arsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sertliği ve 2, 4 ve 8 aylık bir fare lenslerin boyutlarının ölçüldü. Fareler TSRI Hayvancılık Tesisi elde edilen saf C57BL6 suşu arka planda tüm yabani tip hayvanlar vardı ve her lens 1 ila 10 lamelleri ile yüklendi. eksenel ve ekvatoral suşları her lamel ilave edildikten sonra lensin eksenel ve ekvatoral çapları ölçülerek ve daha sonra karşılık gelen boş çapa çapında her değişikliği normalize ederek uygulanan yükün bir fonksiyonu olarak hesaplandı. Her yaştan sekiz lensler test edildi ve sonuçlar ortalama ± standart hata olarak ifade edilir. Daha önce 19 gösterildiği gibi, eksenel kuvvet uygulandı yük (Şekil 3A) bir logaritmik fonksiyondur. Maksimum uygulanan yük (Şekil 3) altında, eksenel ve ekvatoral suşlar istatistiksel olarak anlamlı yaşa bağlı azalma Fare Lens yaşla sertleşir gösteren oluştu. Stküçük standart hataları gösterdiği gibi yağmur ölçümleri, aynı yaştaki lensler arasında yüksek oranda tekrarlanabilir.
Bu deney sırasında toplanan resim verileri, aynı zamanda pek çok diğer objektif morfolojik özellikleri (Şekil 4) tespit etmek için kullanıldı. Yaş (Şekil 4A, 4B ve 4D) ile artmış beklenen eksenel ve ekvatoral çapları ve lens hacmi olarak. Boy oranı lensi eksenel çapından biraz daha büyük bir ekvator çapa sahip olduğunu göstermektedir ve bu parametre yaş (Şekil 4C) ile değişmemiştir. Nükleus çapı, hacmi ve kesir yaş (Şekil 4E, 4F ve 4G) artmıştır. Bu sonuçlar objektif çekirdek mercek yaş olarak göreli büyüklüğü artmaya remodels düşündürmektedir.
Bu veri, fare lensler değişiklikler, yaşla birlikte sertlik benzer artış olduğunu göstermektedirİnsan lensleri 9,15 ging. Bu veriler de benzer bir yöntem 18 kullanılarak yapılan önceki gözlemlerle ve fare lensler yaşla birlikte sertlik artış Brilluoin optik mikroskop 23 ile katılıyorum. Diğer iki çalışmalar tropomodulin-1 göstermek için açıklanan yöntemi kullandık, bir aktin proteini, CP49, bir boncuklu ara filaman proteini kapatma sonu işaret ve aquaporin 0 mercek 19,20 sertlik korumak için gereklidir. Bu yöntemde, mercek patolojileri ve farelerin hızlandırılmış yaşlanma fare modellerinin bolluk genetik varyasyonu ve / veya yaşlanmaya bağlı mercek sertliği değişiklikleri anlamak için kullanılabilir. Bu yöntem, aynı zamanda, diğer türlerden lensler için uyarlanabilir. Bu deneyler için kullanılan odasının boyutları fare lensler için optimize edilmiş, ancak kolayca daha büyük türlerin lensler için ölçeklendirilebilir. Gelecekte, lens boyutu türler arasında objektif sertliği ile ölçekler olup olmadığını belirlemek için ilginç olacaktır.
Şekil 3:. 2, 4 ve 8 aylık (2 M, 4M ve 8M) vahşi-tür fare Lensler eksenel ve Ekvator Gerinim yük Eğriler (A) eksenel kompresif soyu (uygulanan bir yük fonksiyonu olarak çizilen mg). (B) Ekvator aboneressive streyn uygulanan yük (mg) bir fonksiyonu olarak grafiğe dökülür. Dört ve 8 aylık lensler yaşla birlikte mercek sertliği bir artış gösteren, eşdeğer maksimum yükte 2 aylık lensler daha az gerginlik sergiledi. ** P <0.01. Y ekseni (A) ve (B) arasındaki farklı olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. 2-, 4- ve 8 aylık (2M, 4M ve 8M) Yabani tip Fare Lensler Morfolojik Özellikleri (A) Eksenel çap ve (B) ekvator çapı, ilerleyen yaşla birlikte artar. Lens en-boy oranı (C), fare lenslere ekvator biraz daha geniş olduğunu gösterir. Objektif hacmi (D), nükleer çapı (E), nükleer hacmi (F) ve nükleer fraksiyon (G), ilerleyen yaşla birlikte artar. ** P <0.01. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lens sertliği ölçmek için bu yöntemi kullanırken birkaç önemli hususlar vardır. odanın (θ) alt kısmına göre - (8.5 ° 8) İlk olarak, lamelleri hafif eğik bir açıyla lens uygulanır. Bu da, eksenel fazla ekvatoryal yerine yük çok küçük bir bileşen uygulanır. Ancak, bu ekvatoral yük günah θ ≈ 0.1 19 çünkü önemsiz kabul edilir. Bu yöntem büyük lensler için adapte edilirse, odasının tabanına lamelleri açısı ekvator yük gerilme hesaplamaları hesaba gerekip gerekmediğini belirlemek üzere ölçülecek gerekir. İkinci olarak, lens her lamel eklenmesinden sonra denge sağlamak için çok önemlidir. 2 dakika bekleme süresi zamana bağlı deformasyon sağlar (yani., Sürünme) objektif bir denge şekil 19 olduğu zaman Resimlerde sadece alınır, öyle ki gerçekleştirilebilmektedir. Üçüncü olarak, bu protokol m sıkıştırılma yük ölçümü için optimize edilmiştiryüklerin geniş bir dinamik aralığında lensleri ouse. Pilot çalışmada, 1.293 mg (örneğin, on adet 18 x 18 mm lamelleri), uygulanan yük ötesinde yüklerin kayda değer daha deformasyona neden olmayan artış, maksimum gerginlik fare lens sıkıştırılmış. Bu sıkıştırma 19 altında kayda değer deforme olmayan katı nükleus varlığına bağlıdır. Dördüncüsü, bu protokol geri dönüşümsüz doku hasarı önler. Daha önce yayınlanan deneylerde fare lens mekanik özelliklerinde herhangi bir değişiklik, bu yöntemde mercek 19 zarar etmediğini ortaya koyarak, tekrar yükleme üzerine gözlenmiştir. Birinci ve ikinci arasındaki gerilme-yük eğrileri, objektif çapları ve objektif hacimleri 2.10 ve karşılaştırma - mekanik, farklı bir tür ya da mutasyona uğramış lenslerin lens test edilirken, deneme testleri adımları 2.8 tekrarlayarak maksimum zorlanma için gerekli azami yükü belirlemek için yapılmalıdır Yükleniyor. Son olarak, bu yöntem sertlik o ampirik bir ölçüm sağlar Bütün lens f ve farklı hücre tipleri katkılarını (epitel hücreleri, kortikal lifler, nükleer lifler) ve tüm lens mekanik özellikleri lens kapsülü ayırt edemez.
eksenel ve ekvatoral suşları dayatılan yük fonksiyonları olarak burada çizilir. Daha önceki çalışmalar, fare mercek sertliği 19,21, 21 ya da esneklik uygulanan yük üzerine çapı 18 değişim miktarı var. Gerilme farklı boyutlarda lensler arasında doğrudan karşılaştırma sağlayan bir boyutsuz bir büyüklüktür. Bu ekvator uzantısı (pozitif suş) nedeniyle mercek hacmi (yani, Poisson etkisi) korunması için uygulanan eksenel sıkıştırma (negatif zorlanma) ile eş zamanlı oluşur. Ancak, gözlenen ekvatoryal suşları eksenel türü ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, ekvator suşunda küçük değişiklikler tespit etmek için daha az çözünürlüğe sahip olduğunu gösteren, eksenel suşlara göre mutlak büyüklük olarak daha küçük.
Fare lensler yok ederken Özetle nt "> Fare Lens sertliğini ölçmek için kolayca monte cihazla bu basit yöntemi. daha iyi bir objektif sertliği nasıl etkilediğini mutasyonlar proteinler, patolojilerde ve / veya bekletme anlaşılması için mercek araştırmada genel ve yaygın olarak uygulanabilir Bu yöntem halen artan mercek sertliği katkıda protein ve yaşa bağlı değişiklikleri aydınlatmak olabilir, uyum ve potansiyel presbiyopi için yeni tedavilerin geliştirilmesi için yeni bilgiler katkıda bulunur.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
