Abstract
De ooglens is een transparante orgaan dat breekt en richt zich licht om een helder beeld op het netvlies te vormen. Bij mensen ciliaire spieren opdracht aan de lens vervormen, wat leidt tot een toename in optische sterkte van de lens te focussen op nabije objecten, een proces dat bekend staat als accommodatie. Leeftijd-gerelateerde veranderingen in lens stijfheid zijn gekoppeld aan presbyopie, een vermindering van de lens vermogen tot accommoderen, en daarmee de noodzaak van een leesbril. Hoewel de muis lenzen niet geschikt of te ontwikkelen presbyopie, kan muismodellen een waardevol hulpmiddel voor genetische begrip lens pathologieën te bieden, en de versnelde veroudering waargenomen in muizen maakt de studie van aan leeftijd gerelateerde veranderingen in de lens. Dit protocol toont op een eenvoudige, nauwkeurige en rendabele werkwijze voor het bepalen muis lens stijfheid, middels dekglaasjes sequentieel toenemende toepassing drukkrachten op de lens. Representatieve gegevens bevestigen dat de muis lenzen worden stijver met de leeftijd, zoalsmenselijke lenzen. Deze werkwijze is sterk reproduceerbaar en kan mogelijk worden opgeschaald naar onderzoekslenzen van mechanisch op grotere dieren.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren door de National Institutes of Health en onder een goedgekeurd protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Scripps Research Institute.
1. Lens Dissection
- Euthanaseren muizen volgens de aanbevelingen in de National Institutes of Health "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren" en erkende instelling dier gebruik protocollen.
- Ophelderen het oog van muizen met behulp van gebogen pincet. Druk het weefsel rond het oog met de tang voor het oog uit het stopcontact te brengen, en dan plukken het oog uit het stopcontact met de tang. Transfer ogen frisse 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in dissectie schotel.
- Snijd de oogzenuw zo dicht mogelijk bij de oogbol mogelijk. Zachtjes en voorzichtig steek Fijn recht pincet in de oogbol door het gat where de oogzenuw verlaat het achterste.
- maak zorgvuldig een incisie met een schaar in de oogbol van de achterste naar de rand van de cornea. Knaagdier lenzen bezetten ~ 30% van het oog. Maak deze incisies zorgvuldig, en gebruik niet pincet of een schaar te diep in het oog om te voorkomen dat schade aan de lens.
- Knip langs de kruising tussen het hoornvlies en sclera ten minste de helft weg in de oogbol.
- Duw op het hoornvlies om de lens uit het oog verwijderd door de opening in stappen 1,4 en 1,5.
- Gebruik fijne punt rechtdoor tang om zorgvuldig verwijder alle grote puin dat nog steeds is aangesloten op de lens. Inspecteer de lens voor schade alvorens tot de stijfheid metingen.
2. stijfheidsmetingen
- Weegt ten minste 10 dekglaasjes vanuit hetzelfde vak met een analytische balans. Wordt het gemiddelde gewicht van de dekglaasjes. Voor consistentie, maken gebruik van dezelfde doos van dekglaasjes voor alle experimenten. Pre-natde dekglaasjes en haakse spiegel in 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur voordat experimenten.
- Vul de meetkamer (zie figuur 1) met 65-75 ml 1x PBS. De meetkamer werd uit plexiglas gemaakt door een in-house machine winkel, en divots in de kamer werden gemaakt door een kolomboormachine ingesteld op de gewenste diepte met een geschikte boor. Lenzen transparant blijven in 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende de duur van de mechanische testen.
Figuur 1:. Stijfheid meetkamer Een foto die de afmetingen van de op maat gemaakte stijfheid meetkamer met verschillende uitsparingen van verschillende dieptes en vormen. De ronde uitsparingen die 200 urn of 300 urn diep (gele pijlpunten) worden gebruikt voor de metingen op muis lenzen. Divots zijn 2 mm in diameter en 13 ~-. 14 mm vanaf de rand van de kamer Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Plaats haakse spiegel in de kamer op een constante afstand van de graszode die wordt gebruikt om de lens te houden. Zorg ervoor dat de spiegel niet beweegt tijdens het experiment.
- Transfer ontleed lenzen om meetkamer zorgvuldig met het grijpen van een tang of gebogen tang.
- Maak een foto van de onbelaste lens bovenaanzicht rechtstreeks overhead. Neem de muis lens foto 30X vergroting met verlichting uit ontleden microscoop (bodem) en een fiber optic lichtbron aan de linker- en rechterkant. Stel de optische voeding 80% van de maximale lichtintensiteit. Pas de voeding uitgang op basis van omgevingslicht, voorkeur van de gebruiker en de beeldkwaliteit als dat nodig is.
- Maak een foto zijaanzicht van de onbelaste lens, die kan worden gezien door de right-hoek spiegel. Als de camera niet is gekalibreerd, neem een foto van de spiegel rand in focus. De spiegel rand 5 mm lang, en deze meting kan later worden gebruikt om de pixels / mm bepaald en dienen als een schaalbalk in de beelden.
- Plaats lens in de graszode, en bevestigen dat de lens stevig en recht zit in de graszode. Maak een foto van de lens voor het laden. De lens moet rusten in de graszode op zijn voorste of achterste paal.
- Plaats 1 dekglaasje zachtjes op de lens. Wacht 2 min te kruipen mogelijk te maken, en neem een foto van de beladen lens zijaanzicht.
- Blijven toevoegen dekglaasjes zoals in stap 2,8 en rekening zijaanzicht's na de toevoeging van elk dekglaasje als in stap 2,8 tot in totaal 10 dekglaasjes worden toegepast.
- Verwijder alle dekglaasjes. Wacht 2 min, en neem een foto van de lens (binnen en buiten de graszode) zijaanzicht na het verwijderen van alle dekglaasjes.
3. Lens Nucleus Measurement
- om de toonhoogteine de lens kern grootte, verplaats de lens om een schone petrischaal gevuld met 1x PBS.
- Voorzichtig decapsulate de lens met behulp van fijne rechte tang.
- Slough van de corticale fiber cellen door het rollen van de lens tussen gehandschoende vingers. De resterende lens nucleus zal voelen als een harde marmer. Gebruik deze procedure om de kern op volwassen lenzen te isoleren vanaf 1 maand oud. Aangezien de geïsoleerde kern een star lichaam, kunnen verdere mechanische testen van de lensnucleus niet worden uitgevoerd met deze beschreven methode.
- Voorzichtig spoel de lens nucleus in 1x PBS in de petrischaal.
- Plaats de lensnucleus terug in de meetkamer (niet in de graszode), en neemt een beeld van de lensnucleus via haakse spiegel.
Figuur 2:. Een muis Lenzen gecomprimeerd door Coverslips (A) Schematische en (B) een foto van de experimental opstelling met een 2-maanden oude muis lens in een 200-um-deep graszode in de meetkamer gevuld met 1x PBS. Een rechte hoek spiegel en een digitale camera gemonteerd op een dissectie microscoop werd gebruikt om beelden van de lens te verzamelen tijdens de compressie van dekglaasjes. (C) Foto's van de sagittale uitzicht op een 2-maanden-oude wild-type lens samengedrukt door achtereenvolgens toenemende aantallen dekglaasjes op voorwaarde dat de ruwe data voor het meten van axiale en equatoriale diameters en het berekenen van axiale en equatoriale stammen tijdens dekglaasje-gebaseerde compressie testen. Een reflectie van de lens soms door de dekglaasjes (het duidelijkst zichtbaar in het dekglaasje 1 in). Bij het maken van metingen, negeer de reflectie en meten met de top van de lens. (D) Foto's van de sagittale uitzicht op de 2-maanden oude wild-type lens post-compressie en de geïsoleerde lens kern. De post-compressie lens en geïsoleerde kern zitten buiten de graszode. Schaalbalken, 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Gokhin, et al. PLoS One, 2012 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Beeldanalyse
- Meet equatoriale en axiale diameters van lenzen vóór het laden en na elke lading stap met behulp van ImageJ of soortgelijke software. Meet de diameter van elk lensnucleus. De lens kern is bijna bolvormig zo een meting in elke richting kan worden volstaan met 19,21.
- Corrigeer de lens axiale diameters door toevoeging van de diepte van de graszode gebruikt. In de meetkamer, de graszode bedekt 200 urn (2 maanden oude muizen lenzen) of 300 urn (4 maanden oud en 8 maanden oude muis lenzen) van de axiale dikte van de lens.
- Bereken de axiale en equatoriale stammen van de lens diameter metingen met behulp van de vergelijking, ε = (d - d 0) / d 0, waarbij ε stam, d de axiale of equatorial diameter bij een gegeven belasting, en d 0 is de overeenkomstige axiale of equatoriale diameter bij nul belasting.
- Plot de axiale en equatoriale stammen als functies van de opgelegde belasting (in mg).
- Plot de axiale, equatoriale en nucleaire diameters. Bereken en plot van de lens aspect ratio met het verdelen van de axiale diameter door de equatoriale diameter.
- Bereken en plot de lens volume met de vergelijking, volume = 4/3 π × × r E 2 × A r, waarin r E de equatoriale radius r A de axiale straal gemeten vanaf het beeld dat in stap 2,6. Deze vergelijking neemt de lens een afgeplatte sferoïde (ellipsoïde) 1,22.
- Bereken en plot de nucleaire volume met de vergelijking, volume = 4/3 π × × r N 3, waarbij Rn de straal van de lensnucleus gemeten vanaf het beeld dat in stap 3,5. Deze vergelijking veronderstelt de lensnucleus isa bol 19,21.
- Bereken en plot de nucleaire fractie als de verhouding van de nucleaire volume van de lens volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stijfheid en de afmetingen van 2-, 4- en 8-maanden oude muizen lenzen werden gemeten. Muizen waren allemaal wild-type dieren op een zuivere C57BL6 stam achtergrond verkregen uit de TSRI Animal Breeding Facility, en elke lens was geladen met 1-10 dekglaasjes. De axiale en equatoriale stammen werden berekend als een functie van de toegepaste belasting door het meten van de axiale en equatoriale diameter van de lens na het toevoegen van elk dekglaasje en vervolgens normaliseren elke wijziging in diameter tot de overeenkomstige gelost diameter. Acht lenzen van elke leeftijd werden getest en de resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout. Zoals eerder aangetoond 19, axiale rek is een logaritmische functie van de toegepaste belasting (figuur 3A). Er was een statistisch significante leeftijdsafhankelijke afname in axiale en equatoriale stammen onder de maximale uitgeoefende belasting (figuur 3), wat aangeeft dat de muis lens verstijft met de leeftijd. Stregen metingen waren zeer reproduceerbare in lenzen van dezelfde leeftijd, zoals blijkt uit de kleine standaardfouten.
De beeldgegevens tijdens dit experiment verzameld werden ook gebruikt om verschillende andere lens morfologische kenmerken (figuur 4) te bepalen. Zoals verwacht, axiale en equatoriale diameters en de lens volume toe met de leeftijd (Figuur 4A, 4B en 4D). De verhouding geeft aan dat de lens een iets grotere diameter dan equatoriale axiale diameter en deze parameter niet veranderen met de leeftijd (figuur 4C). De diameter, volume en gedeelte van de lensnucleus toe met de leeftijd (figuur 4E, 4F en 4G). Deze resultaten suggereren dat de lensnucleus remodels toenemen in relatieve als de lens leeftijden.
Deze gegevens tonen aan dat muis lenzen toenemen stijfheid met de leeftijd, vergelijkbaar met veranderingen in eenGing menselijke lenzen 9,15. Deze gegevens ook eens met eerdere opmerkingen gemaakt met behulp van een soortgelijke methode 18 en door Brillouin optische microscopie 23 dat de muis lenzen verhogen van de stijfheid met de leeftijd. Twee andere studies hebben de beschreven methode om dat tropomodulin-1 laten zien, een actine wees-end capping proteïne, CP49, een kralen intermediaire filament eiwitten, en aquaporine 0 zijn nodig om te handhaven lens stijfheid 19,20. Met deze methode kan de overvloed van muismodellen voor lens pathologieën en versnelde veroudering muizen worden gebruikt om de lens stijfheid veranderingen als gevolg van genetische variatie en / of veroudering te begrijpen. Deze werkwijze kan ook worden aangepast voor lenzen van andere soorten. De afmetingen van de kamer gebruikt voor deze experimenten zijn geoptimaliseerd voor muizen lenzen, maar kan gemakkelijk worden opgeschaald voor grotere soorten lenzen. In de toekomst zou het interessant zijn om te bepalen of lensgrootte schalen met lens stijfheid tussen soorten.
Figuur 3:. Axiale en equatoriale Strain-belastingcurves voor 2-, 4- en 8-maanden oude (2M, 4M en 8M) Wildtype Muis lenzen (A) axiale drukbelasting uitgezet als functie van de uitgeoefende belasting ( mg). (B) Equatoriaal compingressive stam uitgezet als functie van de toegepaste belasting (mg). Vier- en 8 maanden oude lenzen vertoonden minder druk dan 2 maanden oude lenzen bij equivalente maximale belasting, wat wijst op een toename van de lens stijfheid met de leeftijd. **, P <0,01. Merk op dat de Y-as is verschillend tussen (A) en (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Morfologische Kenmerken van 2-, 4- en 8-maanden oude (2M, 4M en 8M) Wildtype Muis lenzen (A) axiale diameter en (B) equatoriale diameter geleidelijk toe met de leeftijd. De lens aspect ratio (C) laat zien dat muizen lenzen enigszins breder aan de lens equator. Lens volume (D), kern diameter (E), nucleaire volume (F) en nucleaire fractie (G) progressief toenemen met de leeftijd. **, P <0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke overwegingen bij het gebruik van deze methode om de lens stijfheid te meten. Eerst worden de dekglaasjes aangebracht op de lens op een enigszins schuine hoek (8-8,5 °) ten opzichte van de bodem van de kamer (θ). Dit zal een klein bestanddeel van de toepassing equatoriale plaats van axiaal. Echter, dit equatoriale belasting als verwaarloosbaar omdat sin θ ≈ 0,1 19. Wanneer deze methode wordt aangepast voor grotere lenzen, zou de hoek van de dekglaasjes naar de bodem van de kamer moeten worden gemeten om te bepalen of equatoriale belasting moet worden verwerkt in stam berekeningen. Ten tweede, is het cruciaal om de lens equilibreren na toevoeging van elk dekglaasje. De wachttijd van 2 minuten laat tijdsafhankelijke vervorming (bijv., Kruip) voor te komen, zodat foto's alleen worden gemaakt als de lens is op een evenwicht vorm 19. Ten derde, wordt het protocol geoptimaliseerd voor het meten drukspanning op mOuse lenzen over een breed dynamisch bereik van belastingen. In pilotstudies een toegepaste belasting van 1293 mg (dat wil zeggen, tien 18 x 18 mm dekglaasjes) gecomprimeerd met de muis lens tot een maximum stam, waarna verhoogde belasting niet noemenswaardig meer vervormen. Dit komt door de aanwezigheid van de stijve lensnucleus dat niet merkbaar niet vervormt onder druk 19. Ten vierde, dit protocol vermijdt onomkeerbare weefselschade. In eerder gepubliceerde experimenten werden geen veranderingen in de mechanische eigenschappen van muis lenzen waargenomen bij herhaalde belasting, wat suggereert dat deze methode de lens 19 niet beschadigt. Bij mechanisch testen lenzen van een andere soort of mutant lenzen moeten piloottesten worden gedaan om de maximale belasting nodig is voor maximale rek bepaald door stap 2,8-2,10 en vergelijking van de rek-belastingcurves, lens diameters en lens volumes tussen de eerste en tweede laden. Tenslotte, deze werkwijze verschaft een empirische meting van de stijfheid o f het gehele lens en kan de bijdrage van verschillende celtypen (epitheelcellen, corticale vezels, kern vezels) en het lenskapsel om globale lens mechanische eigenschappen onderscheiden.
De axiale en equatoriale stammen worden hier uitgezet als functie van de opgelegde belasting. Eerdere studies hebben gekwantificeerd muis lens stijfheid 19,21, veerkracht 21 of de verandering in de diameter 18 van de toegepaste belasting. Stam is een dimensieloos getal dat directe vergelijking tussen lenzen van verschillende afmetingen toelaat. Merk op dat equatoriale extensie (positieve stam) gebeurt gelijktijdig met de toegepaste axiale compressie (negatieve stam) als gevolg van het behoud van de lens volume (dat wil zeggen, Poisson effect). Echter, de waargenomen equatoriale stammen waren veel kleiner in absolute grootte dan de axiale spanningen, wat aangeeft dat deze methode een lagere resolutie om kleine veranderingen in equatoriale stam detecteren ten opzichte van axiale belasting.
nt "> Samenvattend, deze eenvoudige methode een gemakkelijk samengestelde inrichting voor het meten muis lens stijfheid worden algemeen en op grote schaal in de lens toegepast onderzoek beter te begrijpen hoe mutaties in eiwitten, pathologieën en / of veroudering invloed lens stijfheid. Terwijl muis lenzen niet geschikt, deze werkwijze nog de eiwitten en leeftijdsgebonden veranderingen die bijdragen tot een verhoogde stijfheid lens helderen en mogelijke nieuwe kennis bij tot de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor presbyopie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
