Abstract
תלת ממד תרבות (3D) היא שיטה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגיה מודל התנהגות תאי במבחנה משני תרבות ממדים. קרצינומות, כולל קרצינומות השד, הן רקמות 3D מורכבים מורכב מתאי אפיתל סרטן ורכיבים סטרומה, כולל fibroblasts ו תאי מטריקס (ECM). עם זאת, רוב במבחנת מודלים של סרטן שד פולשני מורכבים רק תאי אפיתל סרטן, השמטת stroma, ולכן ארכיטקטורת 3D של גידול in vivo. המודלים של קרצינומה 3D מתאימים חשובים הבנה מדויקת של ביולוגית גידול, התנהגות, ואת תגובה לטיפול. עם זאת, משך תרבות ונפח של מודלי 3D הוא מוגבל על ידי הזמינות של חמצן וחומרים מזינים בתוך התרבות. בזאת, אנחנו מדגימים שיטה שבה שד קרצינומה תאי אפיתל פיברובלסטים סטרומה ישולבו ECM כדי ליצור פונדקאי סרטן שד 3D הכולל stroma ויכול להיות מתורבתת כמומבנה 3D מוצק או באמצעות מערכת bioreactor זלוף לספק חמצן וחומרים מזינים. בעקבות התקנת תקופת צמיחה ראשונית, פונדקאיים יכול לשמש לבדיקות סמים פרה-קליניות. לחלופין, המרכיבים הסלולר מטריצה של פונדקאי יכולים להיות שונים כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות. לאחר בתרבות, פונדקאיות הם קבועים ומעובדים כדי פרפין, באופן דומה את הטיפול דגימות קרצינומה שד קלינית, להערכת הפרמטרים של עניין. ההערכה של פרמטר אחד כזה, את הצפיפות של תאים הנמצאים, מוסבר, שבו מערכות תוכנה ניתוח התמונה ImageJ ו CellProfiler מוחלים photomicrographs סעיפים היסטולוגית של פונדקאיות לכמת את מספר התאים בעלי הגרעין ליחידת שטח. זה יכול לשמש כאינדיקטור של שינוי מספר תאים לאורך זמן או שינוי מספר התא וכתוצאה מתנאים וטיפולים צמיחה שונים.
Introduction
תלת ממד (3D) מודלי תרבות שיותר במדויק לחקות את אדריכלות גידול microenvironment in vivo חשובים מחקרים שמטרתם לנתח את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי microenvironment שלהם כדי לבחון את היעילות של טיפולים מועמדים. חמצן גידול משפיע ממדי והדרגות מזינות, אחידות חשיפה לסמים, זרימת לחץ / דם ביניים, ו 3D אדריכלות 1-4. הנוכחות של המיקרו-סביבת סטרומה המתאימה תורמת השפעות ממדיות גידול איתות תא ECM ואיתות paracrine בין תאי סטרומה ותאי אפיתל ממאירים. ההשפעות של ממדיות גידול ואת microenvironment על תפקוד הסלולר מבוססות היטב, עם שני גורמי שינוי תרופה בתגובה 1,3,5-8. בנוסף, קינטיקה צמיחה הסלולר, קצב חילוף חומרים, ואיתות תא שונה בין שני ממדיים (2D) תרבות ותרבות 3D, עם גורמים אלה affecting תגובה תאית 1,3,8-10.
במבחנה, במיקרו-סביבה של פונדקאית הגידול יכול להיות מווסתת על ידי כולל מרכיבים ECM יציגים ונוגעים אוכלוסיות תאים סטרומה. תאי אפיתל ממאירים מושפעים ECM ותאי סטרומה הסרטן קשור או באופן סינרגיסטי / מגן לקדם התקדמות גידול או באופן מדכא לעכב 5,6,10 התפשטות גידול נוספת. בשני ההקשר, stroma יכול להשפיע על תגובה טיפולית משלוח סמים באמצעות איתות paracrine ו / או על ידי הגדלת לחץ ביניים בגידול הדבר שגרם לפגיעת משלוח סמים 1,6. לכן, התוספת של ECM ותאי סטרומה לתוך במודלים פרה תעזור לשחזר היבטים של הגידול כי לא יכול להיות מודל היטב בתרבות 2D.
בזאת שיטת להקים פונדקאיות סרטן השד משלב microenvironment מסכם, כולל מרכיבי ECM ו- sתאי tromal, בנפח 3D מתואר. בשנת סרטן השד, אוכלוסיית תאי סטרומה מורכבת ברובה של פיברובלסטים הסרטן קשור (CAF) ואת ECM סטרומה מורכב ברובה מסוג קולגן אני עם שיעור נמוך יותר של רכיבים מטריקס המצויים קרום המרתף, כולל laminin וסוג קולגן IV 1,4,11-13. לכן, רכיבים אלה של microenvironment סרטן שד (כלומר, CAF, אני קולגן, ואת קרום במרתף) שולבו את התחליפים. שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור פונדקאיות 3D מוצק, בלתי-perfused (איור 1 א) או יכול להיות מותאם לכלול זלוף של המדיום דרך פונדקאית באמצעות מערכת bioreactor (איור 1B). שתי הגישות המתוארות כאן. שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי לכלול אלמנטים סטרומה אחרים, כגון מקרופאגים גידולים הקשורים, או לבנות מודל גידולים מוצקים אחרים על ידי התאמת מרכיבים תאיים ו ECM, לפי העניין.
הניתוח מתאים של פונדקאיות הוא חיוני כדי לקבל מידע רלוונטי לגבי תפקוד הסלולר בתגובה לייחס או מניפולציות אחרות. מחליפים ניתן לנתח בשיטות שונות, כולל הדמיה ישירה של פונדקאיות שלמות באמצעות מיקרוסקופ confocal או אמצעים אחרים של הדמיה לא פולשנית, ניתוח הסלולר עקיף על ידי מנסה לאמוד תקשורת המותנה, או perfusate עבור מוצרים מופרשים, או ניתוח על סעיפים היסטולוגית לאחר קיבוע ועיבוד לפָּרָפִין. פרמטר אחד כזה שיכול להיות מוערך על סעיפים היסטולוגית הוא צפיפות תאים. אנו מציגים גישה אחת למדוד צפיפות התאים (כלומר, את מספר התאים בעלי הגרעין לכל אזור סעיף) באמצעות טכניקות עיבוד תמונה חצי אוטומטי להחיל photomicrographs סעיפים היסטולוגית פונדקאית מוכתם hematoxylin ו eosin (H & E). צפיפות התאים יכולים לשמש כאינדיקטור את השינוי היחסי מספר הסלולרי לאורך זמן או הנובע תנאים וטיפולים צמיחה שונים.
איור 1. נפח 3D ומערכת bioreactor. א) סכמטי של התהליך על מנת ליצור פונדקאיות 3D מוצקות. למעלה: קריקטורה של נפח 3D מוצק המכיל ECM (ורוד), קרצינומה של תאי אפיתל (צהובים), CAF (כתום); תחתון:. מבט מלמעלה של פונדקאיות המכילות שקופיות קאמריות 8-גם B) סכמטי של התהליך על מנת ליצור perfused פונדקאית 3D. למעלה: cartoon של נפח 3D עם ערוצים כדי לאפשר זלוף בינוני המכיל ECM (ורוד), קרצינומה של תאי אפיתל (צהוב), CAF (כתום); התיכון: תמונה של ערוץ זרימה PDMS המכיל קצף PDMS (חץ שחור) להיות מוזרק עם תא + ECM וחדרה ידי חוטי נירוסטה מצופה פולימר (חץ ורוד) מדידת 400 מיקרומטר קוטר; תחתונה:. תמונה של ערוץ הזרימה PDMS המכיל פונדקאית המחוברים למערכת bioreactor כדי לאפשר זלוף תווך רציף (משאבת peristaltic ואת המאגר התקשורת לא מוצג) C) תמונות של מדרגות עיבוד הן פונדקאיות מוצק perfused לאחר התרבות. משמאל: תמונה של cryomold המכיל דגימת עיבוד ג'ל פונדקאית; תיכון: תמונה של בלוק פרפין המכיל פונדקאי קבועה ומעובדים; מימין:. תמונה של זכוכית שקופית עם קטע היסטולוגית מוכתם E H & של פונדקאית אנא לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים
- להפשיר רכיב BM לילה ב 4 מעלות צלזיוס, על הקרח.
- מדיום חמים 37 ° C. כדי לתמוך בצמיחה של שני 231 תאים CAF, השתמש בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS).
הערה: התקשורת המשמש יהיה תלוי בסוג התא ואת מטרות הניסוי. - הסר בינוני מצלחת תרבות (10 ס"מ) של תאים ליד ומחוברות 231 ולהוסיף 1.5 מ"ל טריפסין / EDTA. דגירה של 1 עד 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ניטור עבור ניתוק התא. לאחר התאים מתחילים לעגל ולבוא מצלחת, לעצור את התגובה על ידי הוספת 3 מ"ל של סרום המכיל בינוני. פיפטה המדיום ותאי לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה בינוני התאים ב XG 150 במשך 5 דקות. הסר את supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 2 מ"ל בינוני.
- ספירת תאים לכל נפח באמצעות trypan כחול ו hemocytometer. כדאיויות תא צריכות להיות גדולות מ -90%.
- חזור עלתהליך עם סוגי תאים אחרים להיכלל הפונדקאי. עבור הפונדקאית המתוארת כאן, התהליך חוזר על עצמו עם CAF.
- לקבוע את הנפח המתאים של כל השעית תא להשיג את המספר הרצוי של תאים.
הערה: הפונדקאית המתוארות כאן, צפיפות תאים של 2.1 x 10 6 תאים לכל 100 μl של ECM, עם יחס של 2: 1 של תאי אפיתל פיברובלסטים (1.4 x 10 6 231 תאים ו -7 x 10 5 CAF ל -100 μl ECM), משמש. צפיפות התאים זוהי נקודת התחלה טובה; עם זאת, את צפיפות התא האופטימלית תהיה תלויה בסוג התא, משך התרבות, ואת מטרות הניסוי. - מניח את הנפח המתאים של כל השעית תא לתוך צינור חרוטים 15 מיליליטר (שפופרת אחת לכל סוג תא). צנטריפוגה בינוני התאים ב XG 150 במשך 5 דקות.
- בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant, מחדש להשעות סוג תא אחד בתאמים תרבות כיתה (178.8 μl, ראה טבלה 1) ואת סוג תא אחר 10x DMEM (100 μl, ראו טבלה 1, המכיל פנול אדום כדי לפקח pH). מניחים את הצינורות המכיל את התאים על הקרח ולהמשיך במהירות כדי הכנת ECM להלן. הגבל את הזמן כי התאים נשארים במים כדי לשמר יכולת קיום.
הערה: שניהם 10x DMEM ומי כיתת תרבית תאים הם רכיבים דרושים של ECM; ולכן, בחרנו מחדש להשעות תאים בשני. כאן בחרנו באופן שרירותי מחדש להשעות את 231 התאים במי תרבות כיתת תא CAF ב 10x DMEM, למרות או סוג התא יכול להיות מושעה מחדש באחת משני רכיבים אלה.
2. הכנת תאים ב ECM (6 מ"ג / מ"ל שור קולגן Type I + 10% BM)
הערה: ECM מורכב 90% קולגן I + 10% בע"מ נבחרה לדגמן קרצינומה שד פולשני משום stroma הגידול ממאיר זה מורכב בעיקר של קולגןאני עם רכיבים של BM, כגון laminin, קולגן IV, ו entactin, המהווים חלק קטן יותר של 12,13,18,19 ECM.
- על קרח, להוסיף רכיבים המפורטים בטבלה 1, לפי הסדר, לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל.
הערה: הכמות הזו מספיקה עבור 8 פונדקאיות מוצקות או, באמצעות מערכת bioreactor המתוארת כאן, 4 פונדקאיות perfused.
| הכנת התאים ECM (6 מ"ג / מ"ל שור קולגן Type I + 10% BM) | |
| 178.8 μl | מים ניידים תרבות כיתה המכילים את המספר הרצוי של 231 תאים (נקבע לעיל) |
| 606 μl | קולגן אני (10 מ"ג / מ"ל שור), להוסיף טיפה אחר טיפה |
| 100 μl | קרום מרתף, מופשר |
| 100 μl | 10x DMEM (פנול אדום המכיל) עם המספר הרצוי של CAF (נקבע לעיל) |
| 15.2 μl | 7.5% (V / V) סודיום ביקרבונט, להוסיף טיפה אחר טיפה |
טבלה 1. הכנת התאים ECM.
- לערבב בעדינות על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות. לפקח על רמת החומציות באמצעות פנול אדום 10x DMEM. בדוק את התערובת היא צבע כתום / ורוד מה שמעיד על pH של ~ 7. אם ה- pH נמוך מדי (צהוב מדי), לאט להוסיף סודיום ביקרבונט 7.5% נוספים טיפה אחת בכל פעם (~ 5 μl) עד הצבע המתאים הוא הגיע.
- שמור תערובת על קרח לעבוד במהירות כדי למנוע פילמור ECM המוקדם.
3. הכנת סרוגייט
- עבור תרבויות 3D מוצקות (איור 1 א):
- עבודה במנדף תרבית תאים באמצעות טכניקה סטרילית, לתייג את המכסה של שקופית קאמרית 8-גם סטרילי כדי לציין כל וריאציה ניסיונית בתחליפים.
- שמירה על השקופית הקאמרית על קרח כדי למנוע פילמור ECM המוקדם, לאט פיפטה 100 μl של תערובת התאים + ECM לבאר כל השקופית הקאמרית 8-היטב.
הערה: pipetting את תערובת התא + ECM מסביב לקצוות של הבאר הראשונה עוזר להפיץ את תערובת התאים + ECM טוב יותר גם כן. - דגירה פונדקאית על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 45 דקות, כדי לאפשר פילמור ECM.
- בעקבות פילמור ECM, להוסיף 100 תקשורת ותרבות μl היטב כל לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור תקופת הניסוי,שינוי התרבות בינוני כל יומיים.
- עבור תרבויות 3D perfused במערכת bioreactor (איור 1B):
- לעקר את כל רכיבי bioreactor עבור התקנת תרבות 3D (כלומר, bioreactor, צינורות, מלקחיים, ואבזרים הדרושים להתקנת bioreactor) באמצעות תהליך מסוים עבור bioreactor לשמש.
- עבור מערכת bioreactor למשל מנוצלת כאן, להשתמש בשילוב של מעוקר (למשל, 12 חשיפה דקה ב 121.1 מעלות צלזיוס עם 15 דקות ייבוש) דוגרת באתנול 70% במשך שעה 1.
- הכן ולהרכיב את החלק של מערכת bioreactor שירכז הפונדקאי.
- עבור מערכת bioreactor למשל משמש כאן, להכניס עמוד שדרה קצף PDMS לתוך התעלה תזרים PDMS צינורות באמצעות מלקחיים. לדחוף ארבעה (400 מיקרומטר) חוטי נירוסטה מצופה פולימר לתוך הקצף PDMS ליצור microchannels במקביל.
- במנדף תרבית תאים, באמצעות sterilטכניקה דואר ומחט 26 מד עם מזרק, להזריק את תערובת תאים + ECM לאזור של bioreactor זלוף מתוכנן להכיל תאים. המשך במהירות לשלב הבא.
- כדי להבטיח יותר אפילו חלוקת התאים בתוך פונדקאיות, למקם את רכיב bioreactor דיור את התחליפים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל (מתחת למכסה המנוע תרבית תאים) וסובב ברציפות ב ~ 18 סל"ד בעוד דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות כדי לאפשר ECM פילמור.
הערה: סיבוב ניתן להשלים באמצעות הכתף בחממה או בתנור עם מובנה הכתף, כגון הכלאה להגדיר בתנור על 37 מעלות צלזיוס. - חבר את הרכבת bioreactor המכיל הפונדקאי למשאבת זלוף באמצעות הוראות היצרן.
הערה: הפרטים של תהליך זה ישתנה בהתאם על bioreactor ומשאבה בשימוש.- עבור מערכת bioreactor למשל משמש כאן, להסיר את חוטי נירוסטה לפני חיבור bioreaהרכבת ctor למשאבה.
- התחל זלוף בינוני (קצב הזרימה עיקר 167.1 μl / min; מאמץ הגזירה קיר microchannel של 1 דיין / 2 ס"מ) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: שיעור זלוף בינוני יכול להיות מותאם, ובהתאם להגדרות bioreactor ואת המטרות ואת העיצוב של הניסוי. - המשך זלוף בינוני עבור תקופת הניסוי, שינוי המדיום תרבות כל שבעה ימים.
- לעקר את כל רכיבי bioreactor עבור התקנת תרבות 3D (כלומר, bioreactor, צינורות, מלקחיים, ואבזרים הדרושים להתקנת bioreactor) באמצעות תהליך מסוים עבור bioreactor לשמש.
קיבוע סרוגייט 4. עיבוד (איור 1 ג)
- cryomolds לייבל וקלטות רקמות פלסטיק עבור קיבעון ועיבוד פונדקאיים.
- לאחר מכן, פונדקאי לשים בארגז בג'ל עיבוד דגימה, אשר מהווה חומר מימי כי הוא נוזלי בטמפרטורות חמות, אבל מבצר בטמפרטורת חדר. הדגימה עיבוד ג'ל מסייע בשמירה על פונדקאיות ללא פגע במהלך עיבוד ומקל היסטולוגית חתך 14,20-22.
- ממיסים הדגימה עיבוד ג'ל באמבט מים C ° 60 להנזלת זה, שמירה בטמפרטורה זו עד מוכן לשימוש. הזז את bioreactor עם הפונדקאית לארון בטיחות ביולוגית.
- פיפטה כ 300 μl הדגימה ג'ל עיבוד לתוך החלק התחתון של cryomold שכותרתו (תרשים 1C, פאנל משמאל).
- באמצעות סכין אזמל (מס '10 מועדפת) ו מלקחיים ובזהירות להסיר את הפונדקאית מן bioreactor או מהבאר של שקופית קאמרית 8 היטב ומניחים אותו לתוך cryomold המכיל הדגימה עיבוד ג'ל.
הערה: צבעי סימון רקמות (ראה חומרים / ציוד רשימה עבור דוגמה ספציפית) בצבעים שונים שניתן להשתמש בהם כדי לסמן ממלאי מקום, ובכך לאפשר דגימות מרובות להיכלל קלטת ברקמה אחת באופן להבחין. - פיפטה כ 300 הדגימה μl עיבוד ג'ל לכסות הפונדקאית ב cryomold דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי solidify.
- לאחר ג'ל עיבוד הדגימה יש הקרושה, להסיר את הג'ל עיבוד הדגימה המכיל הפונדקאית מן cryomold, ולמקם אותו לתוך קלטת רקמות.
- מניחים את קלטת רקמה המכילה הפונדקאית לתוך 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין למשך 10 עד 12 שעות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר קיבעון מוחלט.
- בעקבות קיבעון, להזיז את קלטת רקמה המכילה הפונדקאית אתנול 70% עד מעובד כדי פרפין.
הערה: העברה הפונדקאית מן פורמלין כדי אתנול מונעת על-קיבעון עם פורמלין אשר יכול לגרום לאובדן immunoreactivity של כמה אפיטופים 23. משך הזמן באתנול אינו קריטי. שינוי של מקבע זה חשוב אם פונדקאית ישמש אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence. הפונדקאית הקבועה מוכנה כעת לצורך עיבודו פרפין (איור 1 ג, פנל באמצע). עיבוד זה מבוצע בדרך כלל במעבד רקמות הממוקם appropriately מצויד מעבדת היסטולוגיה. תוכנית קצרה מומלץ בשל גודלו ואופי עדין של פונדקאיות. 24
5. חתך ו- H & E מכתים (תרשים 1C, פאנל מימין)
- בעקבות עיבוד של ממלאי המקום בלוק פרפין, סעיף אותם באמצעות microtome סטנדרטי עבור חתך של קבוע בפורמלין, רקמות-מוטבע פרפין 24,25.
הערה: זה יכול להתבצע במעבדה היסטולוגיה מוסמכת, או מעבדת מחקר, אם מצויד ומנוסה כמו שצריך. העובי של סעיפים היסטולוגית יכול להשתנות בהתאם לשימוש המיועד של חלקים; עם זאת, אנו משתמשים בדרך כלל חלקים כי הם 5 מיקרומטר עובי. קצף PDMS משמש כאן את תחליפי perfused מחולק בקלות עם microtome. - מניח בסעיפים בשקופיות היסטולוגית זכוכית רגילות.
- לאחר חתך, לאפות בסעיפים היסטולוגית ב -58 מעלות צלזיוס במשך 10-12 שעות להתכונן מכתיםעם hematoxylin ו eosin (H & E). האפייה ממסה את פרפין וגם מאפשרת היצמדות טובה יותר של חלקים לשקופית הזכוכית.
- צביעת H & E:
- הגדרת התחנות המתואר בטבלה 2 בצנצנות coplin או מנות מכתימות זכוכית, תלוי במספר השקופיות להכתים. לאחר ריאגנטים מוגדרים, להזיז את החלקים דרך כל תחנה, לפי סדר, דוגר בפעם המצוינת בהמשך 24.
- הר coverslip כל שקופית באמצעות תקשורת הרכבה.
- אפשר תקשורת הרכבה להתייבש לפני ההדמיה.
| H & E מכתימה | ||
| תַחֲנָה | פִּתָרוֹן | זְמַן |
| 1 | קסילן | 5 דקות |
| 2 | קסילן | <דקות td> 5|
| 3 | קסילן | 5 דקות |
| 4 | 100% אתנול | 5 דקות |
| 5 | 100% אתנול | 5 דקות |
| 6 | 95% אתנול | 5 דקות |
| 7 | 95% אתנול | 5 דקות |
| 8 | מי ברז | 5 דקות |
| 9 | מי דה מיונן | 5 דקות |
| 10 | hematoxylin 7211 | 5 דקות |
| 11 | מי ברז | 5 דקות |
| 12 | להבהיר * | 10 מטבלים |
| * ריצ'רד אלן # 7401 או 70% אתנול + 0.5% HCl | ||
| 13 | מי ברז | 5 דקות |
| 14 | Bluing מגיב | 30 שניות |
| 15 | מי ברז | 5 דקות |
| 16 | 95% אתנול | 10 מטבלים |
| 17 | Eosin-Y | דקה 1 |
| 18 | 95% אתנול | 10 מטבלים |
| 19 | 95% אתנול | 10 מטבלים |
| 20 | 100% אתנול | 10 מטבלים |
| 21 | 100% אתנול | 10 מטבלים |
| 22 | 100% אתנול | 5 דקות |
| 23 | קסילן | 10 מטבלים |
| 24 | 5 דקות | |
טבלה 2. H & E מכתים.
6. מדידת צפיפות התאים
- תמונה לפחות בסעיף היסטולוגית כולו אחד H & E מוכתם של פונדקאית באמצעות מיקרוסקופ brightfield בהגדלה 400X, שמירת תמונות כמו .tif קבצים.
הערה: עיבוד התמונה תיאר הושלם רק באמצעות תמונות צבע. בעוד שלא נבדק, אנו מאמינים כי באותה העיבוד צריך גם לחול על תמונות בגוונים אפורות. - הורד CellProfiler מן Broad Institute 26 (http://cellprofiler.org/download.shtml) ו ImageJ מן המכונים הלאומיים לבריאות (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), הן של אשר זמינים בפומבי ללא תשלום.
- כדי למדוד את השטח של פונדקאית כל תמונה, ImageJ פתוח, בחר "קבע ומדידה" (תחת הלשונית "לנתח"), בחר "שטח", ולאחר מכן בחר "אוקיי & #34 ;.
- פתח (קובץ .tif) תמונה של הפונדקאית. באמצעות כלי פוליגון ImageJ (ראה איור 2), מתאר את השטח של הפונדקאי בתמונה על ידי גרירת העכבר והלחיצה לעשות נקודות עיגון. השתמש הקצוות של ECM כמדריך. לאחר שתואר, בחר "מדוד" תחת הלשונית "לנתח".
ניתוח ImageJ איור 2.. תמונת מסך של עיבוד ImageJ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- חזור על הפעולה עבור כל תמונה של הפונדקאית רקמות. שמור מדידות ומזהה תמונה מתאימה לתכנית גיליון אלקטרונית.
- העלה קבצי תמונה המשמשים למדידת שטח ImageJ לתוך CellProfiler ידי גרירת קבצי תמונה אל "רשימת הקבצים". קצה שם לתמונות המיובאות"NamesAndTypes" מודול קלט ובחר את סוג התמונה (כלומר, "צבעי תמונה").
איור 3. צינור למשל CellProfiler. תמונת מסך של צינור שנועד למדוד את מספר התאים בעלי הגרעין ב CellProfiler. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- צור צינור ניתוח הכולל את המודולים הבאים כדי לחשב את מספר תאים לכל תמונה, על ידי לחיצה על הסימן "+" ליד "התאם מודול" (איור 3, בתחתית הלוח השמאלי). להוסיף בכל אחד מהמודולים להלן.
- בחר "ColorToGray" (איור 4).
- בחר את שם תמונת הקלט מן התפריט הנפתח, שם תמונת הפלט, ובחר את סוג התמונה המקורי (<em> כלומר, RGB אם קלט תמונה צבעונית).
הערה: מודול זה לא יהיה צורך אם באמצעות תמונות בגוונים אפורות
- בחר את שם תמונת הקלט מן התפריט הנפתח, שם תמונת הפלט, ובחר את סוג התמונה המקורי (<em> כלומר, RGB אם קלט תמונה צבעונית).
- בחר "ImageMath" (איור 5).
- בחר את הפעולה "הפוך", שם את תמונת הפלט, ובחר את התמונה בגווני אפור ב "תמונה לבחור ראשונה" הכרטיסייה.
- בחר "IdentifyPrimaryObjects" (איור 6).
- תמונת קלט בחר (תמונה לאחר תיקון מתמטיקה), שם האובייקט הראשוני להיות מזוהה (גרעינים), והזן את הטווח בקוטר עבור החפצים כדי להימדד ביחידות פיקסל (כ -25 עד 65). "הסתגלות" בחר באסטרטגיה הסף "Otsu" שיטת thresholding עם "שלוש כיתות". אל תשנה שום פרמטרים אחרים מהגדרות ברירת המחדל.
הערה: טווח אופטימלי של קטרים צריך להיקבע על ידי פתיחת תמונה במודול תמונת קלט ומדידת הקוטר של גרעינים (כלומר,האובייקט הראשוני) באמצעות כלי אורך מידה.
- תמונת קלט בחר (תמונה לאחר תיקון מתמטיקה), שם האובייקט הראשוני להיות מזוהה (גרעינים), והזן את הטווח בקוטר עבור החפצים כדי להימדד ביחידות פיקסל (כ -25 עד 65). "הסתגלות" בחר באסטרטגיה הסף "Otsu" שיטת thresholding עם "שלוש כיתות". אל תשנה שום פרמטרים אחרים מהגדרות ברירת המחדל.
- בחר "IdentifySecondaryObjects" (איור 7).
- בחר תמונת הקלט (תמונה לאחר תיקון מתמטיקה), בחר את אובייקטי קלט (גרעינים), ואת שם חפץ להיות מזוהים (תאים). בחר את השיטה "התפשטות" לזהות אובייקטים משניים, להשתמש באסטרטגית סף "אדפטיבית" ו "Otsu" שיטה עם "שתי כיתות" מזעור "שונה משוקלל". בחר "אין חלקה" ו בגורם תיקון סף של 1, להפחית ו לתחום העליון של 0 ו -1, וגרם הסדרה 0.05. אל תשנה שום פרמטרים אחרים מהגדרות ברירת המחדל.
- בחר "MeasureObjectSizeShape" (איור 8).
- בחרו את תאים (אובייקט משני) גרעינים (אובייקט ראשוני) כמו החפצים כדי להימדד.
- בחר "FilterObjects" (איור 9
- שם אובייקטים פלטו ובחר את הגרעינים (אובייקט ראשוני) כאובייקט לסנן.
- שמור על שני הפרמטרים הבאים על פי הגדרות ברירת המחדל. בחר "AreaShape" כמו המדידה לסנן לפי קטגוריה, ו "FormFactor" כמו המדידה.
- בחר "כן" כדי לסנן באמצעות ערך מדידה למינימום, ומוסיף ערך מינימאלי של 0.52.
- "לא" בחר כדי לסנן באמצעות מדידה מקסימלית.
- בחר "כן" כדי לשמר את קווי המתאר של עצמים מסוננים שם התמונה התוותה.
- בחר "ColorToGray" (איור 4).
- בחר "ExportToSpreadsheet" (איור 10)
- בחר היכן לשמור את הקובץ בשם "קבצי פלט".
- לאחר בצנרת הניתוח נוצרת (צעדים 6.7.1 ל 6.7.7.1), להתחיל "בדיקת מצב" ב CellProfiler ולהעריך כל שלב, כולל גרעיני תמונת הניסיון מסוננים כראוי, כדי להבטיח pa האופטימליrameters נבחר כדי לזהות תאים. איור 11 מציג תמונת פלט CellProfiler הבא סינון, שבו גרעינים מזוהים כראוי (בעיגול ירוק), והרקע מסונן החוצה.
- לאחר פרמטרים מוערכים וקבעו להיות מספיק, לשמור את הפרויקט ולאחר מכן לחץ על "נתח תמונות". פרויקט זה יכול לשמש שוב ושוב לצורך ניתוח עתידי.
הערה: לאחר פרמטרים הוקמו, התכנית מוגדרת לנתח את כל התמונות "רשימת הקבצים", ברצף. זה יגרום חלונות מרובים לפתוח עבור כל תמונה המנותחת, מה שגורם זמן עיבוד ארוך יותר.- כדי למנוע זמן עיבוד ארוך יותר, לחץ על סמל העין על כל המודולים למעט "ExportToSpreadsheet" תחת הסעיף "מודולים ניתוח".
- לאחר שכל התמונות הפונדקאיות שעובדו על ידי CellProfiler, לפתוח את הגיליון האלקטרוני המכיל את נתוני תמונה שנוצר על ידי Cell Profiler ואת גיליון אלקטרוני המכיל את האזור הנמדד עם ImageJ. העתק את נתוני גרעינים מסוננים (עמודה D בגיליון האלקטרוני CellProfiler) ואת מזהים תמונה (R טור) ולהדביק אותם לתוך הגיליון האלקטרוני המכיל את נתוני השטח הנמדד.
- חשב את הסכום של כל המדידות המתקבלות עבור במספר הגרעינים לכל תמונה של הפונדקאית.
- לחשב הסכום של המדידות שהתקבלו עבור אזור פונדקאי מכל תמונה של הפונדקאי. מחלקים את השטח הכולל נמדדת 1x10 6.
- מחלקים את המספר הכולל של גרעינים על ידי מדידת השטח הכולל בשלב לעיל כדי לקבל ערך עבור מספר התאים לכל 1x10 6 פיקסלים 2.
איור 4. צינור CellProfiler: שינוי תמונה בגווני אפור המסך של מודול "ColortoGray".. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig4highres.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. צינור CellProfiler:.. תמונת היפוך המסך של מודול "ImageMath" אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. צינור CellProfiler:.. גרעיני זיהוי המסך של מודול "IdentifyPrimaryObjects" אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ב-page = "1"> 
איור 7. צינור CellProfiler:.. תאים לזיהוי תמונת מסך של מודול "IdentifySecondaryObjects" אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8. צינור CellProfiler:.. אובייקטי מדידת המסך של מודול "MeasureObjectSizeShape" אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צינור CellProfiler איור 9.:. סינון חפצים צילום מסך של "F"מודול ilterObjects. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צינור CellProfiler איור 10.:.. ייצוא נתונים מסך של "ExportToSpreadsheet" מודול אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פלט איור 11. CellProfiler הבאים סינון. צילום מסך של מסך התפוקה ב מאבחן תא הבאים סינון אובייקט. אנא לחץ כאן כדי להציג versi גדולעל של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שני מחליפי 3D מוצקים perfused סרטן השד הוכנו כמתואר לעיל גדל במשך 7 ימים. בהמשך לכך, פונדקאיות שתוקנו, מעובד כדי פרפין, מחולק, ומוכתמים hematoxylin ו eosin, כפי שתואר לעיל. מספר תאי בעלי גרעין ליחידת שטח (שניהם 231 התאים CAF) של כל פונדקאי נמדד. כפי שניתן לראות בתרשים 12, photomicrographs נציג הסעיפים המוכתמים E H & להפגין ריכוז גבוה של תאים הנמצאים את תחליפי perfused (איור 12 א) לעומת פונדקאיות המוצקות (איור 12 ב), אף על פי הצפיפות של תאים בתחילה שולבה את התחליפים היו זהה בשני התנאים מוצקים perfused. ייצוג חזותי זה של צמיחת תאים נתמך על ידי מספר ממוצע גבוה של תאים לכל אזור (צפיפות) את תחליפי perfused (n = 3) לעומת פונדקאיות המוצקות (n = 3), כפי שנקבע על ידי tהוא CellProfiler ניתוח (12C איור). כדי לקבל את הנתונים בתרשים 12C, חתך היסטולוגי גמור של כל פונדקאי היה צלם, מחייב מספר רב של תמונות לכל פונדקאי, ואת התמונות נותחו כמתואר לעיל. אז, המספר הכולל של גרעינים לכל פונדקאי חולק על ידי השטח הכולל של הפונדקאי (מבוטא במספר הגרעינים / 1 x 10 6 פיקסלים 2), מתן צפיפות תאים לכל פונדקאי. כדי לאמת את השימוש CellProfiler כימות תא גרעיני, התוצאות באמצעות תוכנית CellProfiler הושוו לאלו שהושגו על ידי פשוט ידני לספור את מספר תאים הנמצאים ליחידת שטח בכל אחת 6 פונדקאיות (לוח 3). צפיפות התאים של כל פונדקאי חושבה כמתואר לעיל. לא נמצא הבדל משמעותי נמצא צפיפות התא מתקבלת על ידי ספירה ידנית וניתוח CellProfiler עבור פונדקאיות או perfused (p = 0.855) או בתחליפים מוצקים ( p = 0.553). כדי לתמוך כי ההבדל בין צפיפות התאים את התחליפים המוצקים perfused בקורלציה עם הבדל צמיחת תאים, התפשטות תאים של כל פונדקאי הוערכה באמצעות ניתוח immunohistochemical של תיוג Ki-67 (איור 12D) 27. אותה המגמה נמצאה, עם אחוז גבוה משמעותי של מתרבים התאימו את תחליפי perfused (n = 3) לעומת פונדקאיות המוצקות (n = 3), מה שמעיד על קצב צמיחה גבוה יותר את תחליפי perfused ו correlating עם צפיפות התאים גדלו של פונדקאיות אלה. בעוד סוג התאים (כלומר, אפיתל סרטן השד או CAF) לא הוערך במדידות אלה, immunostaining עבור סמני סוג תא ספציפי יכול לשמש כדי להבין טוב יותר את הצמיחה או הפצה בלעדית של אוכלוסיית תאים ספציפית. פרוטוקולים המפרטים תהליך זה פורסמו בעבר 25,28.
les / ftp_upload / 54,004 / 54004fig12.jpg "/>
איור 12. נציג תוצאות. א) תמונת נציג קטע מוכתם E H & מן פונדקאי perfused גדל במשך 7 ימים (גדלה מקורית 400X). B) תמונת נציג קטע מוכתם E H & מן פונדקאי מוצק גדל במשך 7 ימים עם מדיום השתנתה כל 2 ימים (400X הגדלה מקורית). ג) השוואה בין המספר הממוצע של תאי בעלי גרעין לכל אזור, או צפיפות תאים, לאחר צמיחה של 7 ימים של perfused (ללא שינוי של תקשורת) ושל ממלאי מוצקים (מדיה שונה בכל 2 ימים). ד) השוואת קי 67 מדד תיוג (כלומר, אחוז התאים באוכלוסייה המבטאים Ki-67), מידה של התפשטות תאים, בעקבות 7 ימי צמיחה של פונדקאיות perfused ומוצקות. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM, n = 3 לכל מצב, ** מציין p≤0.01 ו *** מצביע p≤0.001 (מבחן t)."Target =" tp_upload / 54,004 / 54004fig12highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| לְנַסוֹת | תאי בעלי גרעין לכל אזור: CellProfiler | מדריך: תאים בעלי גרעין לכל אזור | CellProfiler הממוצע | ידני ממוצע | ערך P (מבחן מזווג t) |
| Perfused סרוגייט 1 | 88.178 | 75.532 | 97.225 | 99.901 | .855 |
| Perfused סרוגייט 2 | 107.528 | 117.812 | |||
| Perfused סרוגייט 3 | 95.967 | 106.359 | |||
| SOlid סרוגייט 1 | 19.797 | 17.480 | 16.491 | 12.991 | .553 |
| סרוגייט מוצק 2 | 8.612 | 5.650 | |||
| סרוגייט Solid 3 | 21.065 | 15.844 |
צפיפויות תא בטבלה 3. מתקבלות על ידי ניתוח הוראות או CellProfiler עבור 3 פונדקאי perfused מוצקות 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזאת, שיטה של תרבות 3D תואר המשלבת רכיבים של microenvironment הרקמות, כוללים תאי מטריקס (ECM) ו פיברובלסטים סטרומה אדם, בנפח שיותר מקרוב מודלי סרטן השד אנושי כדי לאפשר התפתחות של מורפולוגיה 3D מסכמת . השיטה תרבות 3D תיאר מייצג בצורה טובה יותר של מחלות אנושיות מאשר תרבית תאים 2D המסורתית כי סוגי תאים מרובים משולבים לתוך נפח 3D של ECM. מעבר לנדרש יצוין, כי פרמטרים אלה (כלומר, סוגי תאים מרובים, ECM, ונפח 3D) לספק קשר הופקע יותר ללמוד תהליכים ביולוגיים בגלל מבנה רקמה, אותות מן microenvironment, ו ממדי ננקטים בחשבון 1,8. שיטות אחרות של תרבות 3D תוארו בעבר כולל, התרבות של תאים על גבי מטריצה 3D 29, הדור של spheroids 30, Drop Hanging cutlures 31,nd את השימוש במכשירים microfluidic 32. בעוד כל אחת מהמערכות הללו יש יתרונות ייחודיים, בסך הכל הם לוקחים בחשבון גם רכיבי מטריקס, אוכלוסיות תאי סטרומה, או ממדי נציג. השיטה של תרבות 3D המתואר כאן כוללת כל אחד הפרמטרים האלה ניתן לקבוע באמצעות מערכת bioreactor כדי לאפשר לתקופות צמיחה כבר שקשה להשיג באמצעות תרבות 3D מוצקה. בנוסף, טפטוף של פונדקאיות מעניק מידה גדולה יותר של צמיחה בהשוואה פונדקאיות מוצק.
תכונה נוספת של גישה זו לתרבות במבחנה היא הגמישות בין סוגי ניתוחים שניתן לבצע באמצעות "הרקמות" הפונדקאיות. מגוון של נקודות קצה ניתן לנטר בעקיפין במהלך התרבות ידי הערכת התקשורת מותנה, או perfusate עבור מוצרים מסיסים (למשל, LDH כאינדיקטור של מוות של תאים, חלבונים המופרשים ספציפי או מטבוליטים כקובץ indicatאו של פונקציה פנוטיפי המתאים) או על ידי ניצול הדמיה לא פולשנית של תאים fluorescently או luminescently שכותרתו להעריך צמיחה שעות נוספות אדריכלות פונדקאית. בעקבות הצמיחה, ECM יכול להתעכל באמצעות פרוטאז ECM ותאי יכול להיות מבודדים המשמשים בניסויים ניתוח נוסף או יותר, כגון כימות תזרים cytometric 33. Lysates של התא ייוסר ECM יכול גם להיות מוערך genomically, ברמת תעתיק mRNA, או ביטוי חלבון. לחלופין, נקודות קצה ניתן למדוד ישירות הפונדקאיות הקבועות ומעובד "רקמות" לאחר לסיומו של הניסוי. אלו כוללים מגוון של פרמטרים מורפולוגיים (למשל, מורפולוגיה גרעינית / תא ומידת צבירת תא) על סעיפים היסטולוגית מוכתם E H & וניתוחים מולקולריים אחרים שבוצעו על סעיפים היסטולוגית באמצעות אימונוהיסטוכימיה (למשל, ביטוי של Ki-67 כאינדיקטור התא התפשטות) או בהכלאה באתרו (למשל., ביטוי RNA של מוצרי גן ספציפי). כמו כן ניתן לבצע ניתוחים מולקולריים נוספים, כגון בזמן אמת, PCR כמוני או רצף הדור הבא, על אלה קבועים פורמלין, פונדקאיים-מוטבע פרפין; עם זאת, בשל מולקולרי cross-linking המושרה על ידי קיבעון ועיבוד, snap-קפוא פונדקאיות עדיפים על אלו סוגים של ניתוחים. הערכות מולקולריות מורפולוגיים כאלה יכולים לספק מידע רב ערך לגבי צמיחת תאים, מוות, או תגובה לטיפול תרופתי ברחבי צמיחה וכן בעקבות התרבות.
היתרון העיקרי של השימוש בתוכנה CellProfiler כימות חצי אוטומטי של צפיפות התאים בעלי הגרעין הנוכחי בסעיפים היסטולוגית של פונדקאיות הוא חיסכון בזמן שהיא מספקת. למרות הסכום הכולל של זמן הנדרש לכל פונדקאי היא משתנה ותלוי במידה רבה על הגודל של הפונדקאי ומספר תמונות שנרכשו, זה אסתימגיעי הזדווגו כי צפיפות תאים מהתמונות הפונדקאיות דורש 4-5 שעות של ידות על זמן לכל פונדקאי כאשר לספור ידני לעומת חצי שעה לכל פונדקאי בעת השימוש בתכנית CellProfiler. רוב הידות על האמת באמצעות ניתוח CellProfiler מיוחס המדידה באזור הפונדקאי ImageJ. התוכנית CellProfiler עושה דרוש זמן כדי לעבד את התמונות באופן אוטומטי, אך אינו מחייב הידיים על הזמן שעובר החוקר למעט ייבוא התמונות.
קיימות מגבלות של שיטות ההתרבויות הפונדקאיות 3D המתואר כאן. כפי שניתן לראות בתרשים 12, השימוש במערכת bioreactor זלוף ספק מידה רבה יותר של צמיחה מ תרבויות מוצקות, שבה ההצטברות של תאים ושיעור ההתפשטות איטית באופן משמעותי. למרות שמערכת bioreactor זלוף משמש כאן סיפק יתרון צמיחה, מערכות זלוף יכול גם יש מגבלות משלהם. לדוגמה, PDMS הואלעתים קרובות משמש בייצור של מתקני גידול בשל קלות שימוש בו, תכונות אינרטי, ואת השחזור. עם זאת, חומר זה ידוע לקלוט מולקולות הידרופוביות ממדיה תרבית תאים ועשוי להימשך עד תרופות lipophilic 34-36. אמנם ניתן להשתמש בחומרים אחרים במקום PDMS אם המגבלות האלה הם בעלי עניין, וחומרים אחרים זמינים גם לבוא עם החסרונות שלהם כי יש לקחת בחשבון. בגלל ניתוח CellProfiler תלוי קלט הפרמטרים עבור בקוטר המעגלי של הגרעינים, אופטימיזציה של תשומות אלה עבור כל סוג פונדקאי / תא עשויה להיות נחוצה. זהו גם לציין כי מדידת צפיפות התאים המוצג כאן אינו בגדר מדידה ישירה של כדאיות התא. כבר ציינו בעבר כי מדידה ישירה של כדאיות התא הוא מאתגר במערכות תרבות 3D 37. עם זאת, השפלה גרעינית היא חלק הוא אפופטוזיס ונימק, השניים שולטים צורות של מוות של תאים. אפופטוזיס, שברי הגרעין,תהליך הנקרא karyorrhexis, לאחר עיבוי הכרומטין, או pyknosis 38,39. זה נבדל נמק, שבו מתנפח התא למות גרימת קרום התא להיקרע ולשחרר את התוכן של הציטופלסמה שלו. היסטולוגית, נמק מאופיין karyolysis (כלומר, פירוק גרעין), ואחריו pyknosis ו karyorrhexis 40. גרעינים שעברו שינויים אלה ניתן לראות על H & חלקים היסטולוגית E מוכתמות אבל לא יוכרו גרעינים שלמים ידי תכנית CellProfiler. שינויים הגרעיניים אלה מתרחשים יחסית מאוחרים בתהליך של מוות תאי אולם. לכן, קשה לכמת את מספר התאים בעלי הגרעין לכל אזור עשויים לכלול תאים הנמצאים בשלבים המוקדמים של מוות של תאים, אבל בכל זאת יספק מידע שימושי לגבי כדאיות התא בעת קיבוע פונדקאית. שיטות אחרות שיכול לשמש כדי לציין כדאיות או צמיחה כוללות ניתוחים של perfusates (למשל, Alamar כחול או מבחני LDH) oהערכת r של התפשטות הפונדקאית "הרקמות" (למשל, באמצעות תיוג Ki-67 על ידי אימונוהיסטוכימיה).
צעדים קריטיים בפרוטוקול עבור התקנה פונדקאית כוללים פילמור ECM, שבו טמפרטורה, pH, וזמן כולם חייב להיות במעקב על מנת להבטיח פילמור מלא לפני הרחצה הפונדקאית במדיום. בנוסף, שמירה על תערובת תאים + ECM על קרח לפני ציפוי בתוך שקופית קאמרית 8-היטב או הזרקה לתוך מערכת bioreactor קריטי למניעת פילמור מוקדמת. כמו כן כדי למנוע פילמור במהלך התקנה פונדקאית, את סודיום ביקרבונט להשתמש כדי להגדיל את ה- pH ל 7 יש להוסיף לתערובת האחרונה. לבסוף, זמן דגירה נאות ב- C ° 37 חייב להינתן על מנת להבטיח פילמור ECM מלא; 45 דקות הוכיחו להיות מספיק. גורם חשוב נוסף לקראת פונדקאי הוא ההימנעות של היווצרות בועה. בשתי המערכות המוצקות perfused, עדיף למנוע ההיווצרות של bubbles בתערובת התא + ECM לא ליצור גוש לזרימה של חומרים מזינים במהלך התרבות. כמו כן, חשוב להימנע בועות במהלך מבוא בינוני במערכת זלוף שבה בועה תתפקד כמו תסחיף אוויר, שחסם את זרם בינוני.
הקיבעון נכון חשוב לניתוח במורד זרם; ולכן, לב קיבעון סטנדרטי ועקבי (כולל סוג של קיבעון ואת משך הזמן מקבע) ועיבוד הכרחי כדי להשיג תוצאות בשכפול הדנ"א. המשך וסוג הקיבעון הוא פחות בעיה עבור צביעת H & E המתוארת כאן, אך פרמטרים אלה עשויים להשפיע סוגים אחרים של ניתוח המולקולרי של פונדקאי. הסיבה לכך היא כי קיבעון פורמלין, בפרט, גורם cross-linking של מולקולות, כוללים חלבונים, DNA, ו- RNA באופן מעט תלוי זמן מולקולה ספציפית 41,42. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת בניתוח immunohistochemical, כאשר הכרת נוגדן ניתן יןdered ידי cross-linking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM) | Corning CellGro | 10-014-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| Tissue Culture plates, 100 mm | CellTreat Scientific Products | 229620 | Sterile |
| Tissue Culture plates, 35 mm | CellTreat Scientific Products | 229638 | For PDMS foam formation |
| 9" Glass pipette | Fisher | 13-678-20D | Sterile |
| 10 ml pipette | CellTreat Scientific Products | 229210B | Sterile |
| 1,000 µl piptette tips | FisherBrand | 02-717-166 | Sterile Filtered |
| 200 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-141 | Sterile Filtered |
| 10 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-158 | Sterile Filtered |
| 15 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229410 | Sterile |
| 50 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229422 | Sterile |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | FisherBrand | 05-408-129 | Sterile |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | Sterile |
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor. |
| PDMS Foam | Made in-house for use in our in-house bioreactor. | ||
| High Concentration Bovine Collagen Type I | Advanced Biomatrix | 5133-A | FibriCol ~10 mg/ml |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane) | Corning | 354230 | Basement membrane material |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S8761 | |
| Molecular Biology Grade Water | Fisher | BP2819-1 | |
| DMEM 10x | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| Nunc Lab-Tek Chamber Slide System | Thermo Scientific | 177402 | 8-well |
| Bioreactor | Made in-house. | ||
| Spring-Back 304 Stainless Steel—Coated with PTFE polymer | McMaster-Carr | 1749T19 | Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house bioreactor system. 0.016" Diameter |
| BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14 | Masterflex | EW-96440-14 | For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in. |
| 2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52 mm ID | Cole-Parmer | EW-74906-36 | For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump). |
| Six Channel precision micro peristaltic pump | Cole-Parmer | EW-74906-04 | For use with our in-house bioreactor system |
| Tuberculin Syringes | BD Medical | 309625 | 26 gauge 3/8 in. needle; Sterile |
| Dissecting Tissue Forceps | FisherBrand | 13-812-36 | 5.5 inch |
| Mini Tube Rotator | Boekel Scientific | 260750 | Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753) |
| 50 ml tube carousel | Boekel Scientific | 260753 | Used with mini tube rotator |
| Bambino Hybridization Oven | Boekel Scientific | 230301 | Equipment option for surrogate rotation |
| HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Specimen Processing Gel described in Step 5.2 |
| Cryomold | Andwin Scientific | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Tissue Marking Dye | Cancer Diagnostics, inc. | 03000P | Can be used to mark surrogates, allowing multiple samples to be included in one tissue cassette |
| Hinged tissue cassettes | FisherBrand | 22-272-416 | |
| Formalin | Fisher | 23-245-685 | |
| GoldSeal Plain Glass Slides | Thermo Scientific | 3048-002 | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Decon Laboratories, Inc. | 2805M | |
| Hematoxylin | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Clarifier | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7401 | |
| Bluing Solution | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | |
| Cytoseal XYL mounting media | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 83124 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5G |
References
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome. J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, S66-S72 (2013).
- Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies. JBC. 204 (3), 291-301 (2014).
- Sadlonova, A., et al. Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 4, (2004).
- Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity. Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).
- Marshall, L. E., et al. Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. Polymeric foams with functional nanocomposite cells. RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, (2014).
- Lochter, A., Bissell, M. J. Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer. Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).
- Varsegi, G. M., Shidham, V. Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells. J Vis Exp. (29), e1316 (2009).
- Sadlonova, A., et al. Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease. Am J Pathol. 170 (3), (2007).
- Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol. Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).
- Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering. J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).
- Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies. J Vis Exp. (11), (2008).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Kwon, Y. -J., et al. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines. Clin Exp Metastasis. (28), (2011).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J Vis Exp. (99), e52293 (2015).
- Pal, A., Kleer, C. G. Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells. J Vis Exp. (86), e51311 (2014).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J Vis Exp. (51), e2720 (2011).
- Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), e52526 (2015).
- Sadlonova, A., et al. Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts. Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).
- Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels. Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).
- Caruso, R. A., et al. Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review). Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
- Ogino, S., et al. Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease. Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).
- Otali, D., et al. Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition. Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).
