Abstract
Tredimensionell (3D) kultur är en mer fysiologiskt relevant metod för att modellera cellens beteende in vitro än tvådimensionella kulturen. Karcinom, inklusive bröstkarcinom, är komplexa 3D vävnader som består av cancer epitelceller och stromala komponenter, inklusive fibroblaster och extracellulära matrix (ECM). Men de flesta modeller in vitro av bröstcancer består endast av cancer epitelceller, bortsett stroma och därmed 3D arkitektur av en tumör in vivo. Lämplig 3D-modellering av cancer är viktiga för en korrekt förståelse av tumörbiologi, beteende, och behandlingssvaret. Emellertid är varaktigheten av kulturen och volymen av 3D-modeller begränsas av tillgången på syre och näringsämnen inom kulturen. Häri, visar vi en metod i vilken bröstkarcinom epitelceller och stromala fibroblaster införlivas i ECM för att generera en 3D bröstcancer surrogat som inkluderar stroman och kan odlas som enfast 3D-struktur eller med hjälp av en perfusion bioreaktor system för att leverera syre och näringsämnen. Efter installation och en initial tillväxtperiod, kan surrogat användas för preklinisk drogtestning. Alternativt kan de cellulära och matriskomponenterna i surrogat modifieras för att hantera ett flertal biologiska frågor. Efter odling, är surrogat fixeras och bearbetas för att paraffin, på ett sätt som liknar hanteringen av kliniska bröstkarcinomceller prover, för utvärdering av parametrar av intresse. Utvärderingen av en sådan parameter, tätheten av celler närvarande, förklaras, där ImageJ och CellProfiler bildanalysmjukvarusystem appliceras på mikrofotografier av histologiska sektioner av surrogat för att kvantifiera antalet celler med cellkärna per område. Detta kan användas som en indikator på förändringen i antalet celler över tiden eller förändringen i antalet celler som härrör från olika tillväxtbetingelser och behandlingar.
Introduction
Tredimensionella (3D) kultur modeller som bättre efterliknar tumör arkitektur och mikro in vivo är viktig för studier som syftar till att dissekera de komplexa sambanden mellan celler och deras mikromiljö och för att testa effekten av kandidatterapier. Tumör dimensionalitet effekter syre och näringsämnen gradienter, likformigheten läkemedelsexponering, interstitiell tryck / blodflöde, och 3D-arkitektur 1-4. Närvaron av en lämplig stromal mikromiljö bidrar till tumör dimensionalitet och påverkar cell ECM signalering och parakrin signalering mellan stromaceller och maligna epitelceller. Effekterna av tumör dimension och mikro på cellulär funktion är väl etablerade, med båda faktorerna förändrar läkemedelssvar 1,3,5-8. Dessutom, celltillväxt kinetik, metabolic hastigheter och cellsignalering skiljer sig mellan tvådimensionell (2D) kultur och kultur i 3D, med dessa faktorer affecting cellulär respons 1,3,8-10.
In vitro kan tumören surrogatmikromoduleras genom att inkludera representativa ECM beståndsdelar och stromal cellpopulationer. Maligna epitelceller påverkas av ECM och cancerassocierade stromaceller antingen i en synergistisk / skyddande sätt för att främja tumörprogression eller i ett undertryckande sätt att förhindra ytterligare tumörutbredning 5,6,10. I båda sammanhang kan stroma påverka terapeutisk respons och läkemedelstillförsel via parakrina signalering och / eller genom att öka interstitiell trycket i tumören vilket resulterar i minskad läkemedelstillförsel 1,6. Därför kommer tillsatsen av ECM och stromala celler in i prekliniska modeller hjälpa rekapitulera aspekter av tumör som inte kan modelleras väl i 2D kultur.
Häri en metod för att fastställa bröstcancer surrogat som innehåller en sammanställning mikro, inklusive ECM beståndsdelar och stromal celler, i en 3D-volym beskrivs. I bröstkarcinom, är den stromala cellpopulationen övervägande bestod av cancer associerade fibroblaster (CAF) och den stromala ECM består till stor del av kollagen typ I med en mindre andel av matriskomponenter som återfinns i basalmembranet, inklusive laminin och kollagen typ IV 1,4,11-13. Därför är dessa komponenter i bröstkarcinom mikromiljö (dvs., CAF, kollagen I, och basalmembran) har införlivats i de surrogat. Denna metod kan användas för att alstra fast ämne, un-perfusion 3D surrogat (Figur 1A) eller kan anpassas för att inkludera perfusion av mediet genom surrogat via ett bioreaktorsystem (Figur 1B). Båda metoderna beskrivs här. Denna metod skulle också kunna modifieras för att innefatta andra stromala element, såsom tumörassocierade makrofager, eller för att modellera andra fasta tumörer genom att justera de cellulära och ECM-komponenter, som är lämpligt.
Lämplig analys av de surrogat är avgörande för att få relevant information om cellulär funktion som svar på behandling eller manipuleras på annat sätt. Surrogat kan analyseras genom olika metoder inklusive direkt avbildning av intakta surrogat med hjälp av konfokalmikroskopi eller andra former av icke-invasiv avbildning, indirekt cellulär analys genom att analysera det konditionerade mediet, eller perfusatet för utsöndrade produkter, eller analys på histologiska sektioner efter fixering och bearbetning tillparaffin. En sådan parameter som kan utvärderas på histologiska sektioner är celltäthet. Vi presenterar en metod för att mäta celldensitet (dvs., antalet kärnförsedda celler per sektion område) med användning av halvautomatiserade bildbehandlingstekniker som tillämpas på mikrofotografier av surrogat histologiska sektioner färgade med hematoxylin och eosin (H & E). Celldensiteten kan användas som en indikator på den relativa förändringen av antalet celler över tid eller som är resultatet av varierande tillväxtbetingelser och behandlingar.
Figur 1. 3D-volym och bioreaktorsystem. A) Schematisk bild av processen för att generera solida 3D surrogat. Överst: tecknad film av fast 3D-volym som innehåller ECM (rosa), epitelceller cancerceller (gul), och CAF (orange); Nederst:. Ovanifrån av åtta brunnar kammare slide innehåller surrogat B) Schematisk bild av processen för att generera perfusion 3D surrogat. Top: cartoon av 3D-volym med kanaler för att möjliggöra medieperfusionshastighet och innehållande ECM (rosa), epiteliala karcinom-celler (gul), och CAF (orange); Mitten: bilden av PDMS flödeskanal innehållande PDMS skum (svart pil) som ska injiceras med cell + ECM och penetreras av polymerbelagda tråd av rostfritt stål (rosa pil) mäter 400 mm i diameter; Nederst:. Bilden av PDMS flödeskanalen innehåller ett surrogat och är ansluten till bioreaktorn systemet för att möjliggöra kontinuerligt medium perfusion (peristaltisk pump och mediebehållare visas inte) C) Bilder av processteg för både fasta och perfusion surrogat efter kultur. Vänster: bild av cryomold innehåller provbehandling gel och surrogat; Mitten: bilden av en paraffin block som innehåller en fast och bearbetas surrogat; Höger:. Bilden av en glasskiva med en H & E-färgade histologiskt snitt av ett surrogat klicka god här för att se enstörre version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling
- Tina BM komponent över natten vid 4 ° C, på is.
- Varmt medium till 37 ° C. För att stödja tillväxten av både 231-celler och CAF, använd Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) plus 10% fetalt bovint serum (FBS).
Notera: De medier som används kommer att bero på celltypen och de experimentella mål. - Avlägsna mediet från odlingsskålen (10 cm) av nära sammanflytande 231-celler och tillsätt 1,5 ml Trypsin / EDTA. Inkubera i 1-3 minuter vid 37 ° C, övervakning för cell lossnar. När cellerna börjar runda och lossna plattan, stoppa reaktionen genom att tillsätta 3 ml av medium innehållande serum. Pipettera mediet och cellerna in i ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera mediet och cellerna vid 150 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 ml medium.
- Räkna antalet celler per volym med hjälp av trypanblått och en hemocytometer. Cellviabiliteten bör vara större än 90%.
- Upprepaprocess med andra celltyper som skall ingå i surrogat. För surrogat som beskrivs här, är processen upprepas med CAF.
- Bestämma den lämpliga volymen av varje cellsuspension för att erhålla det önskade antalet celler.
Obs! Surrogat som beskrivs här, en celltäthet på 2,1 x 10 6 celler per 100 pl ECM, med en 2: 1-förhållande av epitelceller till fibroblaster (1,4 x 10 6 231 celler och 7 x 10 5 CAF per 100 ^ ECM), används. Denna celltäthet är en bra utgångspunkt; dock kommer den optimala celltätheten beror på celltyp, varaktighet kultur och målen för försöket. - Placera den lämpliga volymen av varje cellsuspension i en 15 ml koniskt rör (ett rör för varje celltyp). Centrifugera mediet och cellerna vid 150 xg under 5 min.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten, återsuspendera en celltyp i cellodlingsgrad vatten (178,8 | il, se tabell 1) och den andra celltypen i 10x DMEM (100 | j, l, se tabell 1, som innehåller fenolrött för att övervaka pH). Placera rören innehållande cellerna på is och gå snabbt till framställning av ECM nedan. Begränsa den tid som cellerna förblir i vatten för att bevara livsduglighet.
Notera: Både 10x DMEM och cellodlingskvalitet vatten krävs komponenter i ECM; Därför, har vi valt att återsuspendera celler i båda. Här har vi godtyckligt valde att återsuspendera 231-celler i cellodlingskvalitet vatten och CAF i 10x DMEM, även om någon celltyp kan återsuspenderas i någon av dessa två komponenter.
2. Beredning av celler i ECM (6 mg / ml bovint kollagen typ I + 10% BM)
Obs: En ECM består av 90% kollagen I + 10% BM valdes att modellera invasiv bröstcancer eftersom tumörstroma i denna malignitet består främst av kollagenI med komponenterna i BM, såsom laminin, kollagen IV, och entaktin, innefattande en mindre del av ECM 12,13,18,19.
- På is, tillsätt komponenter som anges i tabell 1, i ordning, i en 2 ml mikrocentrifugrör.
Obs: Detta belopp är tillräckligt för 8 fasta surrogat eller med hjälp av bioreaktor system som beskrivs här, 4 perfunderade surrogat.
| Framställning av celler i ECM (6 mg / ml bovint kollagen typ I + 10% BM) | |
| 178.8 μl | Cellodlingskvalitet vatten innehållande det önskade antalet 231-celler (som bestämts ovan) |
| 606 | il | Kollagen I (10 mg / ml bovint), tillsätt droppvis |
| 100 ^ | Basalmembranet, upptinade |
| 100 ^ | 10x DMEM (innehållande fenolrött) med önskat antal CAF (bestämt ovan) |
| 15,2 | il | 7,5% (volym / volym) natriumbikarbonat, tillsätt droppe för droppe |
Tabell 1. Framställning av celler i ECM.
- Blanda försiktigt genom att pipettera att undvika bubbelbildning. Övervaka pH-värdet med hjälp av fenolrött i 10x DMEM. Kontrollera att blandningen är en orange / rosa färg indikerar ett pH ~ 7. Om pH är för lågt (för gul), långsamt tillsätta ytterligare 7,5% natriumbikarbonat en droppe i taget (~ 5 pl) tills lämplig färg uppnås.
- Håll blandningen på is och arbeta snabbt för att förhindra för tidig ECM polymerisation.
3. Surrogat Framställning
- För fasta 3D kulturer (Figur 1A):
- Att arbeta i en cellkultur huva med steril teknik, märka locket på en steril 8 brunnar kammare glida för att indikera något experimentellt variation i surrogat.
- Hålla kammarobjektglas på is för att förhindra för tidig ECM polymerisation, långsamt pipettera 100 | il av cell + ECM blandningen i varje brunn i 8-brunnars kammarobjektglas.
Notera: pipettera cellen + ECM blandningen runt kanterna på brunnen första hjälper till att bättre fördela cellen + ECM blandningen i brunnen. - Inkubera surrogat vid 37 ° C, 5% CO2 under 45 minuter för att tillåta ECM polymerisation.
- Följande ECM polymerisation, tillsätt 100 | il odlingsmedia till varje brunn och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under hela experimentet,förändrade odlingsmedium varannan dag.
- För perfusion 3D kulturer i en bioreaktor system (figur 1B):
- Sterilisera alla bioreaktor komponenter för 3D kultur setup (dvs bioreaktor, slangar, pincett, och installationer som är nödvändiga för bioreaktor inställning) med hjälp av processen som är specifik för bioreaktorn som ska användas.
- För exemplet bioreaktorsystem utnyttjas här, använda en kombination av autoklavering (t.ex. 12 min exponering vid 121,1 ° C med 15 min torkning) och inkubering i 70% etanol under 1 timme.
- Förbered och montera den del av bioreaktor system som kommer att inrymma surrogat.
- För exemplet bioreaktor system som används här, infoga en PDMS skum ryggrad i PDMS flödeskanalen slang med hjälp av pincett. Tryck fyra (400 um) polymerbelagda tråd av rostfritt stål i PDMS skum för att skapa parallella mikro.
- I en cellkultur huva, med hjälp av sterile teknik och en 26 gauge nål med spruta, injicera cellen + ECM blandningen i området för perfusionsbioreaktor utformad för att innehålla celler. Gå snabbt till nästa steg.
- Att säkerställa en mer jämn fördelning av cellerna inom de surrogat, placera bioreaktor komponent som inrymmer de surrogat i en 50 ml koniskt rör (under cellodlings huva) och kontinuerligt rotera med ~ 18 rpm medan inkubering vid 37 ° C under 45 min för att medge ECM polymerisation.
Notera: Rotation kan slutföras med hjälp av en rotator i inkubatorn eller en ugn med ett inbyggt rotator, såsom en hybridisering ugn inställd på 37 ° C. - Anslut bioreaktorn enheten innehåller surrogat till perfusion pumpen med tillverkarens instruktioner.
Notera: Detaljerna i denna process kommer att variera beroende på bioreaktorn och pump som används.- För exemplet bioreaktor system som används här, ta bort rostfria ståltrådar innan du ansluter bioreactor enheten till pumpen.
- Starta medieperfusionshastighet (bulkflödeshastighet av 167,1 | j, l / min; mikrokanalväggen skjuvspänning av en dyn / cm 2) i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
Obs: Hastigheten för medieperfusionshastighet kan justeras, beroende på bioreaktorn setup och målen och utformningen av experimentet. - Fortsätta medieperfusionshastighet för varaktigheten av försöket, ändra odlingsmediet var sjunde dag.
- Sterilisera alla bioreaktor komponenter för 3D kultur setup (dvs bioreaktor, slangar, pincett, och installationer som är nödvändiga för bioreaktor inställning) med hjälp av processen som är specifik för bioreaktorn som ska användas.
4. surrogat Fixering och Processing (Figur 1C)
- Etikett cryomolds och plastvävnadskassetter för surrogat fixering och bearbetning.
- Nästa, innesluta surrogat i provbearbetning gel, som är en vattenhaltig material som är flytande vid varma temperaturer, men stelnar vid rumstemperatur. De provbehandling gel hjälper till att hålla surrogat intakt under bearbetning och underlättar histologiska sektione 14,20-22.
- Smält provbehandling gel i en 60 ° C vattenbad för att smälta det, hålla vid denna temperatur tills den ska användas. Flytta bioreaktorn med surrogat till en biosäkerhet skåp.
- Pipettera cirka 300 pl provbehandling gel in i botten av den märkta cryomold (Figur 1C, vänster panel).
- Med hjälp av ett skalpellblad (nr 10 föredraget) och pincett försiktigt bort surrogat från bioreaktorn eller från brunnen av en 8-väl kammare bild och placera den i cryomold innehåller provbehandling gel.
Obs: Vävnads märkning färgämnen (se Material / utrustningslista för ett specifikt exempel) i olika färger kan användas för att markera surrogat, varigenom flera prover som ska ingå i en vävnad kassett i en urskiljbar sätt. - Pipetten approximativt 300 | il provbehandling gel för att täcka surrogat i cryomold och inkubera vid 4 ° C under 30 min för att solidify.
- När provbehandling gelen har stelnat, ta bort provbehandling gel som innehåller surrogat från cryomold, och placera den i en vävnad kassett.
- Placera vävnaden kassett innehållande surrogat i 10% neutral buffrad formalin under 10 till 12 h vid rumstemperatur för att medge fullständig fixering.
- Efter fixering, flytta vävnad kassett innehållande surrogat till 70% etanol tills bearbetas till paraffin.
Obs: Överföring surrogat från formalin till etanol förhindrar över fixering med formalin som kan orsaka förlust av immunoreaktivitet av vissa epitoper 23. Den tidslängd i etanol är inte kritisk. Denna förändring av fixativ är viktigt om surrogat kommer att användas för immunohistokemi eller immunofluorescens. Den fasta surrogat är nu redo för bearbetning till paraffin (Figur 1C, mellersta panel). Denna behandling utförs typiskt i en vävnadsprocessor som ligger i en ca.opriately utrustade histologi laboratorium. En kortare program rekommenderas på grund av storleken och känsliga naturen hos surrogat. 24
5. Sektione och H & E färgning (Figur 1C, höger panel)
- Efter behandling av surrogat till en paraffinblock avsnitt dem med en vanlig mikrotom för snittning av formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader 24,25.
Obs: Detta kan utföras i en kvalificerad histologi laboratorium eller i ett forskningslaboratorium, om det är korrekt utrustade och erfarna. Tjockleken av de histologiska snitt kan variera beroende på den avsedda användningen av sektionerna; Men använder vi vanligtvis sektioner som är 5 mikrometer i tjocklek. PDMS skum som används här i perfuserade surrogat lätt sektion med en mikrotom. - Placera avsnitt om vanligt glas histologiska diabilder.
- Efter snitt, baka de histologiska snitt vid 58 ° C under 10 till 12 timmar för att förbereda sig för färgningmed hematoxylin och eosin (H & E). Bakning smälter paraffin och även möjliggör bättre vidhäftning av delar till objektglaset.
- H & E-färgning:
- Ställ in stationer som beskrivs i tabell 2 i Coplin burkar eller glasfärgnings rätter, beroende på hur många bilder till fläcken. När reagens sätts upp, flytta avsnitt genom varje station i tur och ordning inkubation under den tid som anges under 24.
- Montera ett täck till varje bild med hjälp av monterings media.
- Låt monterings media torka innan avbildning.
| H & E-färgning | ||
| Station | Lösning | Tid |
| 1 | xylen | 5 min |
| 2 | xylen | <td> 5 min|
| 3 | xylen | 5 min |
| 4 | 100% etanol | 5 min |
| 5 | 100% etanol | 5 min |
| 6 | 95% Etanol | 5 min |
| 7 | 95% Etanol | 5 min |
| 8 | Kranvatten | 5 min |
| 9 | Avjoniserat vatten | 5 min |
| 10 | hematoxylin 7211 | 5 min |
| 11 | Kranvatten | 5 min |
| 12 | Clarifier * | 10 dips |
| * Richard Allan # 7401 eller 70% etanol + 0,5% HCl | ||
| 13 | Kranvatten | 5 min |
| 14 | blåelse Reagens | 30 sek |
| 15 | Kranvatten | 5 min |
| 16 | 95% Etanol | 10 dips |
| 17 | Eosin-Y | 1 min |
| 18 | 95% Etanol | 10 dips |
| 19 | 95% Etanol | 10 dips |
| 20 | 100% etanol | 10 dips |
| 21 | 100% etanol | 10 dips |
| 22 | 100% etanol | 5 min |
| 23 | xylen | 10 dips |
| 24 | 5 min | |
Tabell 2. H & E-färgning.
6. Att mäta celltäthet
- Bild åtminstone en hel H & E färgade histologiska delen av surrogat med hjälp av bright mikroskopi vid 400X förstoring, spara bilderna som .tif filer.
Obs! Bildbehandling beskrivs endast har utförts på färgbilder. Medan oprövade, tror vi samma behandling bör också vara tillämplig på gråskalebilder. - Ladda ner CellProfiler från Broad Institute 26 (http://cellprofiler.org/download.shtml) och ImageJ från National Institutes of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), båda som är allmänt tillgänglig utan kostnad.
- För att mäta den del av surrogat i varje bild, öppna ImageJ, välj "Mätningar" (under fliken "Analysera"), välj "Area", och välj sedan "Okej & #34 ;.
- Öppna en bild (.tif-fil) av surrogat. Använda polygonverktyget i ImageJ (se figur 2), beskriva den del av surrogat i bilden genom att dra musen och klicka för att fästpunkter. Använda kanterna av ECM som en guide. När skiss, välj "Measure" under fliken "Analysera".
Figur 2. ImageJ analys. Skärmdump av ImageJ bearbetning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Upprepa för varje bild av vävnaden surrogat. Spara mätningar och motsvarande bild identifierare till ett kalkylprogram.
- Ladda upp bildfiler som används för att mäta området ImageJ i CellProfiler genom att dra bildfiler till "File List". Tilldela ett namn till bilderna importeras iden "NamesAndTypes" ingångsmodul och välj bildtypen (dvs "Färgbild").
Figur 3. CellProfiler exempel pipeline. Skärmdump av rörledningen konstruerad för att mäta antalet celler med cellkärna i CellProfiler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Skapa en analys pipeline som innehåller följande moduler för att beräkna antalet celler per bild, genom att klicka på "+" tecknet bredvid "Justera Module" (Figur 3, längst ned i vänstra panelen). Lägg varje modul nedan.
- Välj "ColorToGray" (Figur 4).
- Välj ingångsbilden namn från rullgardinsmenyn, namnge utgångsbilden, och välj den ursprungliga bilden typ (<em> dvs RGB om färgbild ingång).
Obs: Denna modul skulle inte behövas om du använder gråskalebilder
- Välj ingångsbilden namn från rullgardinsmenyn, namnge utgångsbilden, och välj den ursprungliga bilden typ (<em> dvs RGB om färgbild ingång).
- Välj "ImageMath" (Figur 5).
- Välj "Invertera" operation, namnge utgångsbilden, och välj gråskalebilden i "välj första bilden" -fliken.
- Välj "IdentifyPrimaryObjects" (Figur 6).
- Välj ingångsbild (bilden efter matematik korrigering), namn det primära syftet att identifiera (kärnor), och ange diameterintervall för objekten som ska mätas i pixel enheter (cirka 25 till 65). Välj "adaptiv" tröskel strategi med "Otsu" tröskelmetoden med "tre klasser". Ändra inte några andra parametrar från standardinställningarna.
Notera: Optimal diameterområde bör bestämmas genom att öppna en bild i den inmatade bilden modulen och mäta diametern av kärnor (dvsdet primära syftet) hjälp åtgärden längd.
- Välj ingångsbild (bilden efter matematik korrigering), namn det primära syftet att identifiera (kärnor), och ange diameterintervall för objekten som ska mätas i pixel enheter (cirka 25 till 65). Välj "adaptiv" tröskel strategi med "Otsu" tröskelmetoden med "tre klasser". Ändra inte några andra parametrar från standardinställningarna.
- Välj "IdentifySecondaryObjects" (Figur 7).
- Välj den inmatade bilden (bild efter matematik korrigering), välja ingångs objekt (kärnor), och namnge de föremål som skall identifieras (celler). Välj "förökning" metod för att identifiera sekundära objekt, använd "adaptiva" tröskel strategi och "Otsu" metod med "två klasser" minimera "vägt varians". Välj "ingen utjämning" och en tröskel korrektionsfaktor 1, nedre och övre gränserna för 0 och 1, och en reglering faktor på 0,05. Ändra inte några andra parametrar från standardinställningarna.
- Välj "MeasureObjectSizeShape" (Figur 8).
- Markera cellerna (sekundärt syfte) och kärnor (primärt syfte) som föremålen som skall mätas.
- Välj "FilterObjects" (Figur 9
- Namn utgångs objekt och välj kärnorna (primärt syfte) som objekt att filtrera.
- Håll nästa två parametrar som per standardinställningar. Välj "AreaShape" som mått för att filtrera efter kategori, och "formfaktor" som mätningen.
- Välj "Ja" för att filtrera med minst mätvärde och lägga till ett minimivärde av 0,52.
- Välj "Nej" för att filtrera med hjälp av en maximal mätning.
- Välj "Ja" för att behålla konturerna av filtrerade objekt och namnge den skisserade bilden.
- Välj "ColorToGray" (Figur 4).
- Välj "ExportToSpreadsheet" (Figur 10)
- Välj var du vill spara filen och namnet "Utdatafiler".
- Efter rörledningen analys genereras (steg 6.7.1 till 6.7.7.1), börjar "Test Mode" i CellProfiler och utvärdera varje steg, bland annat att kärnorna i testbilden på lämpligt sätt filtreras, för att säkerställa optimal pametrar valdes för att identifiera celler. Figur 11 visar en utgångsbild från CellProfiler efter filtrering, där kärnor korrekt identifierats (inringade i grönt), och bakgrunden filtreras bort.
- När parametrar utvärderas och bedöms vara tillräcklig, spara projektet och klicka sedan på "Analysera bilder". Detta projekt kan användas upprepade gånger för framtida analys.
Obs! När parametrar har fastställts, är det program som för att analysera alla bilderna i "File List", sekventiellt. Detta kommer att resultera i flera fönster som öppnas för varje bild som analyseras, vilket orsakar en längre bearbetningstid.- För att undvika en längre behandlingstid, klicka på ikonen öga på alla moduler utom "ExportToSpreadsheet" under avsnittet "Analysis moduler".
- När alla surrogat bilderna har bearbetats av CellProfiler öppnar kalkylbladet som innehåller bilddata som genereras av Cell Profiler och kalkylblad som innehåller arean mäts med ImageJ. Kopiera filtrerade kärnor data (kolumn D i CellProfiler kalkylblad) och bild identifierare (kolumn R) och klistra in dem i kalkylbladet som innehåller mätdata området.
- Beräkna summan av alla de mätningar som erhålls för antalet kärnor per bild av surrogatet.
- Beräkna summan av mätvärdena för surrogat område från varje bild av surrogat. Dividera den totala ytan mätt med 1x10 6.
- Dividera det totala antalet kärnor med det totala mätområdet i steget ovan för att erhålla ett värde för antalet celler per 1x10 6 pixlar 2.
Figur 4. CellProfiler pipeline: ändra bilden till gråskala Skärmdump av "ColortoGray" modul..s: //www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig4highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. CellProfiler pipeline.. Invertera bilden Skärmdump av "ImageMath" modul Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. CellProfiler pipeline.. Identifiera kärnor Skärmdump av "IdentifyPrimaryObjects" modul Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. CellProfiler pipeline.. Identifiera celler Skärmdump av "IdentifySecondaryObjects" modul Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. CellProfiler pipeline.. Mätobjekt Skärmdump av "MeasureObjectSizeShape" modul Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. CellProfiler pipeline. Filtrera objekt Skärmdump av "FilterObjects "modul. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. CellProfiler pipeline.. Exportera data Skärmdump av "ExportToSpreadsheet" modul Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11. CellProfiler utgång efter filtrering. Skärmdump av produktionen skärmen i cell profiler efter objekt filtrering. Klicka här för att se en större versipå denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både fasta och perfuserade 3D bröstcancer surrogat framställdes såsom beskrivits ovan och odlades under 7 dagar. Därefter tillsattes surrogat fast, behandlas för att paraffin, snittades och färgades med hematoxylin och eosin, såsom beskrivits ovan. Antalet kärnförsedda celler per område (både 231-celler och CAF) av varje surrogat mättes. Såsom kan ses i figur 12, representativa mikrofotografier av de H & E-färgade snitt visar en högre koncentration av celler som finns i de perfuserade surrogat (Figur 12A) jämfört med de fasta surrogat (Figur 12B), trots att densiteten av celler som ursprungligen införlivats i de surrogat var densamma i både fasta och perfunderade betingelser. Denna visuella representation av celltillväxt stöds av ett högre genomsnittligt antal celler per area (densitet) i perfuserade surrogat (n = 3) jämfört med de fasta surrogat (n = 3), som bestäms av than CellProfiler analys (Figur 12C). För att erhålla data i Figur 12C, var en komplett histologiskt tvärsnitt av varje surrogat avbildas, vilket kräver flera bilder för varje surrogat, och bilderna analyserades såsom beskrivits ovan. Sedan tillsattes det totala antalet kärnor för varje surrogat dividerat med den totala arean av surrogat (uttryckt som antalet kärnor / 1 x 10 6 pixlar 2), vilket ger en celldensitet för varje surrogat. Att kontrollera användningen av CellProfiler för kärncell kvantifiering, var resultaten med hjälp av CellProfiler program jämfört med de som erhålls genom att helt enkelt manuellt räkna antalet celler närvarande per område i varje 6 surrogat (tabell 3). Celldensiteten hos varje surrogat beräknades såsom beskrivits ovan. Ingen signifikant skillnad hittades i celldensiteter erhålls genom manuell räkning och CellProfiler analys för antingen perfusion surrogat (p = 0,855) eller fasta surrogat ( p = 0,553). För att stödja att skillnaden i celldensiteten mellan de fasta och perfuserade surrogat korrelerar med en skillnad i celltillväxt, var cellproliferation av varje surrogat utvärderas via immunohistokemisk analys av Ki-67 märkning (Figur 12D) 27. Samma trend konstaterades, med en betydligt högre andel prolifererande celler i de perfuserade surrogat (n = 3) jämfört med de fasta surrogat (n = 3), vilket indikerar en högre tillväxttakt i perfuserade surrogat och korrelerar med den ökade celltätheten av dessa surrogat. Medan den celltyp (dvs bröstcancer epitel- eller CAF) utvärderades inte i dessa mätningar, immunfärgning för cell typspecifika markörer kan användas för att bättre förstå tillväxten eller spridningen av en specifik cellpopulation. Protokoll detailing denna process har tidigare publicerats 25,28.
les / ftp_upload / 54004 / 54004fig12.jpg "/>
Figur 12. Representativa resultat. A) representativ bild av en H & E-färgade avsnitt från en perfusion surrogat som odlas för 7 dagar (400X ursprunglig förstoring). B) representant bild av en H & E-färgade avsnitt från en fast ersättning som odlas för 7 dagar med mediet byts var 2 dagar (400X ursprunglig förstoring). C) Jämförelse av det genomsnittliga antalet celler med cellkärna per område, eller celldensitet, efter 7 dagars tillväxt på perfuserade (ingen förändring av media) och fasta surrogat (media byts var 2 dagar). D) Jämförelse av Ki 67 märkningsindex (dvs den procentuella andelen celler i en population som uttrycker Ki-67), ett mått på cellproliferation, efter 7 dagars tillväxt på perfuserade och fasta surrogat. Data representerar medelvärdet ± SEM, n = 3 per tillstånd, ** anger p≤0.01 och *** indikerar p≤0.001 (Students t-test).tp_upload / 54004 / 54004fig12highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Experimentera | CellProfiler: kärnförsedda celler per område | Manuell: kärnförsedda celler per område | genomsnittlig CellProfiler | genomsnittlig Manual | P-värde (oparat t-test) |
| Perfuserades surrogat en | 88,178 | 75,532 | 97,225 | 99,901 | 0,855 |
| Perfuserades Surrogat 2 | 107,528 | 117,812 | |||
| Perfuserades Surrogat 3 | 95,967 | 106,359 | |||
| Solid surrogat en | 19,797 | 17,480 | 16,491 | 12,991 | 0,553 |
| Solid surrogat 2 | 8,612 | 5,650 | |||
| Solid surrogat 3 | 21,065 | 15,844 |
Tabell 3. celldensiteter som erhölls genom manuell eller CellProfiler analys för 3 fast och 3 perfunderade surrogat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri, har en metod för 3D-kultur har beskrivits som inkorporerar komponenterna i vävnaden mikromiljö, inklusive den extracellulära matrisen (ECM) och humana stromala fibroblaster, i en volym som mer modeller nära human bröstcancer för att möjliggöra utvecklingen av en periodisk 3D morfologi . 3D kultur beskrivna metoden är mer representativ för den mänskliga sjukdomen än traditionella 2D cellodling i att flera celltyper ingår i en 3D-volymen av ECM. Det har konstaterats att dessa parametrar (dvs flera celltyper, ECM, och 3D-volym) ger en mer disponeras sammanhang att studera biologiska processer eftersom vävnadsarkitektur, signaler från mikro och dimension beaktas 1,8. Andra metoder för 3D-kultur har tidigare beskrivits, inklusive, odling av celler på toppen av en 3D-matris 29, genereringen av sfäroider 30, cutlures hängande droppe 31, ennd användningen av mikroflödessystem enheter 32. Även om vart och ett av dessa system har unika fördelar, samlade de misslyckas med att inkludera antingen matriskomponenter, stromala cellpopulationer, eller en representativ dimension. Metoden av 3D-kultur som beskrivs här innefattar var och en av dessa parametrar och kan fastställas med hjälp av en bioreaktor system för att möjliggöra längre tillväxtperioder som är svåra att uppnå med fast 3D-kultur. Dessutom perfusion av surrogat ger en högre grad av tillväxt jämfört med solida surrogat.
Ett annat inslag i denna strategi för in vitro-kultur är flexibiliteten i de typer av analyser som kan utföras med hjälp av surrogat "vävnader". En mängd olika slutpunkter kan övervakas indirekt under odling genom att utvärdera det konditionerade mediet, eller perfusatet, för lösliga produkter (t.ex. LDH som en indikator på celldöd, specifika utsöndrade proteiner eller metaboliter som ett indicateller lämplig fenotypisk funktion) eller genom att använda icke-invasiv avbildning av fluorescerande eller luminiscensmärkta celler för att utvärdera tillväxt och surrogat arkitektur övertid. Efter tillväxt, kan ECM brytas ned med hjälp av en ECM-proteas och cellerna kan isoleras och användas för ytterligare analys eller ytterligare experiment, såsom flödescytometrisk kvantifiering 33. Lysat av cellerna avlägsnades från ECM kan också utvärderas genomiskt, på mRNA-transkriptet nivå, eller för proteinuttryck. Alternativt kan slutpunkter mätas direkt från de fasta och bearbetade surrogat "vävnader" efter experimentet har ingått. Dessa inkluderar en mängd olika morfologiska parametrar (t.ex. kärn / cellmorfologin och graden av cell aggregation) på H & E-färgade histologiska sektioner och andra molekylära analyser utförda på histologiska sektioner med hjälp immunohistokemi (t.ex. uttryck av Ki-67 som en indikator på cell spridning) eller isitu-hybridisering (t.ex.., RNA-expression av specifika genprodukter). Det är också möjligt att utföra ytterligare molekylära analyser, såsom i realtid, kvantitativ PCR eller nästa generations sekvensering, om dessa formalinfixerade, paraffininbäddade surrogat; emellertid, på grund av molekylär tvärbindning inducerad av fixering och bearbetning, är snäpp frysta surrogat föredragna för dessa typer av analyser. Sådana molekylära och morfologiska utvärderingar kan ge värdefull information om celltillväxt, död, eller svar på farmakologisk behandling under tillväxt samt efter kultur.
Den huvudsakliga fördelen med att använda den CellProfiler program för halvautomatiserad kvantifiering av tätheten av kärnförsedda celler som finns i histologiska sektioner av surrogat är tidsbesparingarna som den ger. Även den totala tid som krävs per surrogat är variabel och beror till stor del på storleken av surrogat och antalet bilder som förvärvats, är det estiparade att komma fram till en celltäthet från surrogat bilder kräver 4-5 timmars hands-on tid per surrogat vid manuell räknar kontra en halvtimme per surrogat när du använder CellProfiler programmet. Majoriteten av hands-on-tid med hjälp av CellProfiler analys tillskrivs mätning av surrogatområdet i ImageJ. Den CellProfiler programmet kräver tid för att automatiskt bearbeta bilderna, men kräver inte hands-on tid från annat än att importera bilderna forskare.
Det finns begränsningar av de metoder och 3D surrogat kulturer som beskrivs här. Såsom visas i fig 12, användningen av perfusionsbioreaktor systemet gav en större grad av tillväxt än fasta kulturer, i vilka ackumuleringen av celler och graden av proliferation är avsevärt långsammare. Fastän perfusionsbioreaktor system som används här som en tillväxtfördel, kan perfusionssystem också ha sina egna begränsningar. Till exempel är PDMSanvänds ofta vid tillverkning av bioreaktorer på grund av dess användarvänlighet, inerta egenskaper och reproducerbarhet. Emellertid är detta material känt för att absorbera hydrofoba molekyler från cellodlingsmedia och kan ta upp lipofila läkemedel 34-36. Medan andra material kan användas i stället för PDMS, om dessa begränsningar är av intresse, i annat material kommer också med sina egna nackdelar som måste beaktas. Eftersom CellProfiler analys är beroende av parametrar ingång för diametern och cirkularitet av kärnorna, kan optimering av dessa ingångar för varje typ surrogat / cell vara nödvändig. Det är också att notera att mätningen celltätheten presenteras här är inte ett direkt mått på cellviabilitet. Det har tidigare noterats att en direkt mätning av cellviabilitet är utmanande i 3D-kultursystem 37. Emellertid är kärn nedbrytning en del av både apoptos och nekros, de två dominerande formerna av celldöd. I apoptos, nucleus fragment, enprocess som kallas karyorrhexi efter kromatinkondensation eller pyknos 38,39. Detta skiljer sig från nekros, där döende cellen sväller orsakar cellmembranet att brista och frigöra innehållet i sin cytoplasma. Histologiskt är nekros som kännetecknas av karyolys (dvs., upplösning av en kärna), följt av pyknos och karyorrhexi 40. Kärnor som har genomgått dessa förändringar kan ses på H & E-färgade histologiska snitt, men kommer inte att erkännas som intakta kärnor vid CellProfiler programmet. Dessa kärn förändringar relativt sent i processen av celldöd dock. Därför kan kvantifiera antalet celler med cellkärna per område innefattar celler som i de tidigare stadierna av celldöd, men kommer ändå att ge användbar information om cellviabilitet vid tidpunkten för surrogat fixering. Andra metoder som kan användas för att indikera lönsamhet eller tillväxt inkluderar analyser av perfusat (t.ex. Alamar Blue eller LDH-analyser) or utvärdering av proliferation i surrogat "vävnader" (t.ex. via Ki-67 märkning av immunohistokemi).
Kritiska steg i protokollet för surrogat installation inkluderar ECM polymerisation, där temperatur, pH och tid alla måste kontrolleras för att säkerställa fullständig polymerisation före bad surrogat i mediet. Dessutom är avgörande för att förhindra för tidig polymerisation hålla cellen + ECM blandningen på is före plätering i en 8-väl kammare glida eller injektion i en bioreaktor systemet. Också för att förhindra polymerisation under surrogat setup, natriumvätekarbonat används för att öka pH-värdet till 7 bör läggas till blandningen sist. Slutligen måste tillräcklig inkubationstid vid 37 ° C ges för att säkerställa fullständig ECM polymerisation; 45 minuter har visat sig vara tillräcklig. En annan viktig faktor i surrogat förberedelse är att undvika bubbelbildning. I både de fasta och perfunderade system, är det bäst att undvika bildandet av bubbles i cellen + ECM blandning för att inte skapa ett block för flödet av näringsämnen under odling. Det är också viktigt att undvika bubblor under medel introduktion i perfusion system där en bubbla kan fungera som en luftemboli, blockerar medieflödet.
Korrekt fixering är viktig för efterföljande analys; Därför är nödvändig uppmärksamhet standardiserad och konsekvent fixering (inklusive typ av fixering och den tid i fixativ) och behandling för att erhålla replikativa resultat. Varaktigheten och typ av fixering är ett mindre problem för H & E-färgning som beskrivs här, men dessa parametrar kan påverka andra typer av molekylär analys av surrogat. Detta beror på formalinfixering, i synnerhet, orsakar tvärbindning av molekyler, inklusive protein, DNA och RNA i en något tidsberoende och molekyl specifikt sätt 41,42. Detta är särskilt viktigt i immunohistokemisk analys, när antikropps-igenkänning kan hinSAS Aviation genom tvärbindning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM) | Corning CellGro | 10-014-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| Tissue Culture plates, 100 mm | CellTreat Scientific Products | 229620 | Sterile |
| Tissue Culture plates, 35 mm | CellTreat Scientific Products | 229638 | For PDMS foam formation |
| 9" Glass pipette | Fisher | 13-678-20D | Sterile |
| 10 ml pipette | CellTreat Scientific Products | 229210B | Sterile |
| 1,000 µl piptette tips | FisherBrand | 02-717-166 | Sterile Filtered |
| 200 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-141 | Sterile Filtered |
| 10 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-158 | Sterile Filtered |
| 15 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229410 | Sterile |
| 50 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229422 | Sterile |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | FisherBrand | 05-408-129 | Sterile |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | Sterile |
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor. |
| PDMS Foam | Made in-house for use in our in-house bioreactor. | ||
| High Concentration Bovine Collagen Type I | Advanced Biomatrix | 5133-A | FibriCol ~10 mg/ml |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane) | Corning | 354230 | Basement membrane material |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S8761 | |
| Molecular Biology Grade Water | Fisher | BP2819-1 | |
| DMEM 10x | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| Nunc Lab-Tek Chamber Slide System | Thermo Scientific | 177402 | 8-well |
| Bioreactor | Made in-house. | ||
| Spring-Back 304 Stainless Steel—Coated with PTFE polymer | McMaster-Carr | 1749T19 | Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house bioreactor system. 0.016" Diameter |
| BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14 | Masterflex | EW-96440-14 | For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in. |
| 2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52 mm ID | Cole-Parmer | EW-74906-36 | For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump). |
| Six Channel precision micro peristaltic pump | Cole-Parmer | EW-74906-04 | For use with our in-house bioreactor system |
| Tuberculin Syringes | BD Medical | 309625 | 26 gauge 3/8 in. needle; Sterile |
| Dissecting Tissue Forceps | FisherBrand | 13-812-36 | 5.5 inch |
| Mini Tube Rotator | Boekel Scientific | 260750 | Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753) |
| 50 ml tube carousel | Boekel Scientific | 260753 | Used with mini tube rotator |
| Bambino Hybridization Oven | Boekel Scientific | 230301 | Equipment option for surrogate rotation |
| HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Specimen Processing Gel described in Step 5.2 |
| Cryomold | Andwin Scientific | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Tissue Marking Dye | Cancer Diagnostics, inc. | 03000P | Can be used to mark surrogates, allowing multiple samples to be included in one tissue cassette |
| Hinged tissue cassettes | FisherBrand | 22-272-416 | |
| Formalin | Fisher | 23-245-685 | |
| GoldSeal Plain Glass Slides | Thermo Scientific | 3048-002 | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Decon Laboratories, Inc. | 2805M | |
| Hematoxylin | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Clarifier | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7401 | |
| Bluing Solution | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | |
| Cytoseal XYL mounting media | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 83124 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5G |
References
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome. J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, S66-S72 (2013).
- Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies. JBC. 204 (3), 291-301 (2014).
- Sadlonova, A., et al. Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 4, (2004).
- Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity. Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).
- Marshall, L. E., et al. Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. Polymeric foams with functional nanocomposite cells. RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, (2014).
- Lochter, A., Bissell, M. J. Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer. Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).
- Varsegi, G. M., Shidham, V. Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells. J Vis Exp. (29), e1316 (2009).
- Sadlonova, A., et al. Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease. Am J Pathol. 170 (3), (2007).
- Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol. Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).
- Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering. J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).
- Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies. J Vis Exp. (11), (2008).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Kwon, Y. -J., et al. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines. Clin Exp Metastasis. (28), (2011).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J Vis Exp. (99), e52293 (2015).
- Pal, A., Kleer, C. G. Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells. J Vis Exp. (86), e51311 (2014).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J Vis Exp. (51), e2720 (2011).
- Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), e52526 (2015).
- Sadlonova, A., et al. Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts. Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).
- Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels. Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).
- Caruso, R. A., et al. Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review). Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
- Ogino, S., et al. Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease. Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).
- Otali, D., et al. Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition. Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).
