Abstract
Três cultura tridimensional (3D) é um método mais fisiologicamente relevante para modelar o comportamento de células in vitro do que dois cultura tridimensional. Carcinomas, incluindo carcinomas da mama, são tecidos complexos 3D compostas por células epiteliais de cancro e componentes do estroma, incluindo fibroblastos e matriz extracelular (ECM). No entanto, a maioria dos modelos in vitro de carcinoma da mama consistir apenas de células epiteliais de cancro, omitindo o estroma e, por conseguinte, a arquitectura 3D de um tumor in vivo. modelagem 3D apropriado de carcinoma é importante para a exata compreensão da biologia do tumor, comportamento e resposta à terapia. No entanto, a duração da cultura e o volume de modelos 3D é limitado pela disponibilidade de nutrientes e de oxigénio dentro da cultura. Aqui, demonstramos um método em que as células de carcinoma da mama epiteliais e de fibroblastos do estroma são incorporados ECM para gerar um substituto do cancro da mama em 3D que inclui estroma e podem ser cultivadas como umestrutura 3D sólido ou utilizando um sistema de bioreactor de perfusão para fornecer oxigénio e nutrientes. Seguinte configuração e um período de crescimento inicial, substitutos podem ser usados para testes de drogas pré-clínicos. Alternativamente, os componentes celulares e da matriz de o substituto pode ser modificado para abordar uma variedade de questões biológicas. Após cultura, substitutos são fixadas e processadas de parafina, de uma maneira semelhante ao tratamento dos espécimes de carcinoma da mama clínica, para a avaliação dos parâmetros de interesse. A avaliação de um tal parâmetro, a densidade de células presentes, é explicada, em que os sistemas de software de análise de imagem e ImageJ CellProfiler são aplicados a fotomicrografias de secções histológicas de substitutos para quantificar o número de células nucleadas por área. Isto pode ser utilizado como um indicador da mudança no número de células ao longo do tempo ou a mudança no número de células, resultante de condições de crescimento diferentes e tratamentos.
Introduction
Três modelos tridimensionais de cultura (3D) que simulam de forma mais precisa a arquitectura do tumor e microambiente in vivo são importantes para estudos destinados a dissecar as interacções complexas entre as células e o seu microambiente e para testar a eficácia de terapias candidatos. Tumor impactos dimensionalidade oxigênio e gradientes de nutrientes, a uniformidade da exposição à droga, fluxo de pressão / sangue intersticial, e arquitetura 3D 1-4. A presença de um micro-ambiente apropriado estromal contribui para dimensionalidade do tumor e influências de sinalização célula-ECM e sinalização parácrina entre as células do estroma e as células epiteliais malignas. Os efeitos da dimensionalidade do tumor e do microambiente em função celular estão bem estabelecidos, com ambos os fatores que alteram a resposta à droga 1,3,5-8. Além disso, cinética celular de crescimento, as taxas metabólicas e sinalização celular diferem entre duas culturas e da cultura dimensões (2D) em 3D, com esses fatores affecting resposta celular 1,3,8-10.
In vitro, o microambiente tumoral substituto pode ser modulada através da inclusão de componentes ECM representativos e populações de células do estroma. Células epiteliais malignas são influenciados pela ECM e as células do estroma associadas a cancro, quer de uma forma sinergética / protector para promover a progressão do tumor ou de uma forma supressiva para inibir ainda mais 5,6,10 propagação do tumor. Em qualquer contexto, o estroma podem afectar a resposta terapêutica e a entrega de drogas através da sinalização parácrina e / ou pelo aumento da pressão intersticial no tumor, resultando em diminuição de administração de fármaco de 1,6. Portanto, a adição de ECM e células estromais em modelos pré-clínicos irão ajudar recapitular aspectos do tumor que não pode ser modelado bem em cultura 2D.
Aqui um método para estabelecer substitutos de cancro da mama que incorporam um microambiente recapitulativo, incluindo os constituintes da MEC e stromal células, num volume 3D é descrito. No carcinoma da mama, a população de células de estroma é predominantemente composta de cancro associado fibroblastos (CAF) e a ECM de estroma é em grande medida constituído por colagénio do tipo I com uma proporção menor de componentes de matriz que são encontrados na membrana basal, incluindo laminina e colagénio de tipo IV 1,4,11-13. Portanto, estes componentes do microambiente do carcinoma da mama (isto é, CAF, colagénio I, e membrana basal) foram incorporados nos substitutos. Este método pode ser usado para gerar sólido, un substitutos 3D-perfundido (Figura 1A) ou pode ser adaptado para incluir a perfusão do meio através do substituto através de um sistema de bioreactor (Figura 1B). Ambas as abordagens são descritos aqui. Este método também pode ser modificada para incluir outros elementos estromais, tais como macrófagos associados a tumores, ou para modelar outros tumores sólidos, ajustando os componentes celulares e de ECM, como apropriado.
análise adequada dos substitutos é crucial para obter informações pertinentes sobre a função celular em resposta ao tratamento ou outras manipulações. Substitutos pode ser analisado por diversos métodos, incluindo a imagiologia directa de substitutos intactas através de microscopia confocal ou outros meios de imagem não invasiva, a análise celular indirecta por análise do meio condicionado, ou perfusato, para produtos segregados, ou a análise de secções histológicas após a sua fixação e de processamento paraparafina. Um tal parâmetro que pode ser avaliada em secções histológicas é a densidade celular. Apresenta-se uma abordagem para medir a densidade celular (isto é, o número de células nucleadas por área de secção), utilizando técnicas de processamento de imagem semi-automatizados aplicados a fotomicrografias de secções histológicas coradas substitutos com hematoxilina e eosina (H & E). A densidade celular pode ser usada como um indicador da mudança relativa no número de células ao longo do tempo ou que resulta de condições de crescimento diferentes e tratamentos.
Figura 1. de volume 3D e sistema de biorreactor. A) Representação esquemática do processo para gerar substitutos 3D sólidos. Top: desenhos animados de volume 3D sólida contendo ECM (rosa), células de carcinoma epitelial (amarelo) e CAF (laranja); Resumindo:. Vista superior de 8 poços de slides câmara contendo substitutos B) Esquema do processo para gerar perfusão substitutos 3D. Top: cartoon de volume 3D com canais para permitir a perfusão médio e contendo ECM (rosa), células de carcinoma epitelial (amarelo) e CAF (laranja); Meio: imagem do canal de fluxo de PDMS contendo PDMS espuma (seta preta) a ser injectado com células + ECM e penetrada por fios de aço inoxidável revestidos com polímero (seta rosa) de medição de 400 um de diâmetro; Parte inferior:. Imagem do canal de fluxo de PDMS contendo um substituto e ligados ao sistema de bioreactor de perfusão para permitir o meio contínuo (bomba peristáltica e reservatório de meios não mostrados) C) Imagens de passos de processamento para ambos os substitutos sólidos e perfusados após cultura. À esquerda: imagem do cryomold contendo amostra de processamento de gel e surrogate; Médio: imagem de um bloco de parafina contendo um substituto fixo e processados; Direita:. Imagem de uma lâmina de vidro com uma secção histológica H & E-manchado de um substituto Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.
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Protocol
Cultura 1. celular
- Descongelar componente BM durante a noite a 4 ° C, em gelo.
- Quente meio a 37 ° C. Para suportar o crescimento de ambas as células 231 e CAF, utilizar de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) mais soro fetal bovino a 10% (FBS).
Nota: Os meios utilizados irá depender do tipo de célula e os objectivos experimentais. - Remova o meio da placa de cultura (10 cm) de células confluentes próximos 231 e adicionar 1,5 ml de tripsina / EDTA. Incubar durante 1 a 3 minutos a 37 ° C, a monitorização de separação celular. Uma vez que as células começam a arredondar e saem da placa, parar a reacção por adição de 3 ml de soro meio contendo. Pipetar o meio e as células para um tubo cónico de 15 ml.
- Centrifuga-se o meio e as células a 150 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento celular em 2 ml de meio.
- Contar o número de células por volume usando azul de tripano e um hemocitómetro. A viabilidade das células deve ser superior a 90%.
- Repita oprocesso com outros tipos de células a ser incluído no sucedâneo. Para o substituto descrito aqui, o processo é repetido com o CAF.
- Determinar o volume apropriado de cada suspensão de células para obter o número desejado de células.
Nota: Para o substituto descrito aqui, uma densidade celular de 2,1 x 10 6 células por 100 ul de ECM, com uma proporção de 2: 1 de células epiteliais de fibroblastos (1,4 x 10 6 231 e 7 x 10 5 CAF por 100 ul ECM), é utilizada. Esta densidade celular é um bom ponto de partida; No entanto, a densidade celular óptima vai depender do tipo de célula, a duração da cultura, e os objectivos da experiência. - Colocar o volume apropriado de cada suspensão de células para um tubo de 15 ml (um tubo para cada tipo de célula). Centrifuga-se o meio e as células a 150 xg durante 5 min.
- Após a centrifugação, remover o sobrenadante, re-suspender um tipo de célula em célulaA água de grau de cultura (178,8 ul, ver Tabela 1) e o outro tipo de células em DMEM 10x (100 jil, ver Tabela 1, contendo vermelho de fenol para monitorar o pH). Colocar os tubos contendo as células em gelo e proceder rapidamente a preparação de ECM abaixo. Limitar o tempo que as células permanecem na água para preservar a viabilidade.
Nota: Ambos os componentes 10x DMEM e água cultura grau de célula são necessárias do ECM; por isso, optámos por voltar a suspender as células em ambos. Aqui nós escolhemos arbitrariamente para re-suspender as células 231 em água de grau de cultura de células e a CAF em 10x DMEM, embora qualquer tipo de célula pode ser re-suspenso em qualquer um destes dois componentes.
2. Preparação de células em ECM (6 mg / mL de colagénio de bovino do tipo I + 10% BM)
Nota: Um composto de ECM de colagénio de 90% I + 10% BM foi escolhido como modelo de carcinoma da mama invasivo pois o estroma tumoral neste malignidade é composto principalmente de colagénioI com componentes da BM, tais como laminina, colagénio IV, entactina e, compreendendo uma porção menor da ECM 12,13,18,19.
- Em gelo, adicionar os componentes listados na Tabela 1, a fim de, para um tubo de microcentrifugação de 2 ml.
Nota: Esta quantidade é suficiente para 8 ou substitutos sólidas, utilizando o sistema de biorreactor descrito aqui, 4 substitutos perfundidos.
| Preparação de células em ECM (6 mg / mL de colagénio de bovino do tipo I + 10% BM) | |
| 178,8 μeu | A água de grau de cultura de células contendo o número desejado de células 231 (determinado acima) |
| 606 ul | O colagénio I (10 mg / ml de bovino), adicionar gota a gota |
| 100 ul | membrana basal, descongelados |
| 100 ul | 10x DMEM (contendo vermelho de fenol) com o número desejado de CAF (determinado acima) |
| 15,2 ul | 7,5% (v / v) de bicarbonato de sódio, adicionar gota a gota |
Tabela 1. Preparação de células em ECM.
- Misture delicadamente por pipetagem, evitando a formação de bolhas. Monitorar o nível de pH utilizando o vermelho de fenol na 10x DMEM. Verificar que a mistura é uma laranja / cor-de-rosa indicando um pH de ~ 7. Se o pH é demasiado baixo (muito amarela), adiciona-se lentamente adicional de 7,5% de bicarbonato de sódio a uma gota de cada vez (~ 5 mL) até que a cor adequada seja atingida.
- Mantenha mistura sobre gelo e trabalhar rapidamente para evitar a polimerização prematura ECM.
3. Preparação Surrogate
- Para culturas em 3D sólidos (Figura 1A):
- Trabalhando em um capuz de cultura de células utilizando uma técnica estéril, rotular a tampa de uma lâmina de câmara de 8 poços estéril para indicar qualquer variação experimental em substitutos.
- Mantendo a corrediça câmara em gelo para evitar a polimerização prematura ECM, lentamente pipeta 100 uL da mistura de células + ECM em cada cavidade da lâmina câmara de 8 poços.
Nota: pipetagem a mistura de células + ECM em torno das bordas do primeiro poço ajuda a distribuir melhor a mistura de células + ECM no poço. - Incubar substitutos a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 45 min para permitir que a polimerização do ECM.
- Após polimerização ECM, adicionar 100 ul de meio de cultura a cada poço e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante a duração da experiência,mudando o meio de cultura de dois em dois dias.
- Para culturas em 3D perfundidos em um sistema de bioreactor (Figura 1B):
- Esterilizar todos os componentes do bioreactor para a configuração cultura 3D (isto é, de biorreactor, tubos, uma pinça, e os acessórios necessários para a configuração do bioreactor) utilizando o processo específico para o bio-reactor para ser utilizado.
- Por exemplo o sistema de bioreactor utilizado aqui, utilizar uma combinação de tratamento em autoclave (por exemplo, 12 min de exposição a 121,1 ° C com 15 minutos de secagem) e incubação em etanol a 70% durante 1 h.
- Preparar e montar a parte do sistema de bioreactor que vai abrigar o substituto.
- Para o sistema de exemplo biorreator usada aqui, inserir um backbone de espuma PDMS para o canal de fluxo PDMS tubulação usando uma pinça. Empurrar quatro fios de aço inoxidável revestidos com polímero (400 uM) na espuma PDMS para gerar microcanais paralelos.
- Num capuz de cultura de células, utilizando Sterile técnica e uma agulha de calibre 26 com uma seringa, injectar a mistura de células + ECM para a área do bioreactor de perfusão destinado a conter células. Avançar rapidamente para a próxima etapa.
- A fim de assegurar uma distribuição mais uniforme de células dentro dos substitutos, colocar o componente biorreactor abrigando os substitutos para um tubo de 50 ml (sob o capuz de cultura de células) e rodar continuamente em ~ 18 rpm enquanto a incubação a 37 ° C durante 45 min para permitir ECM polimerização.
Nota: A rotação pode ser efectuada usando um rotor na incubadora ou num forno com um construído no rotador, tais como hibridação forno regulado para 37 ° C. - Conecte o conjunto do biorreator contendo o substituto para a bomba de perfusão utilizando as instruções do fabricante.
Nota: Os detalhes deste processo pode variar dependendo do bioreactor e da bomba está sendo usado.- Por exemplo o sistema de bioreactor utilizado aqui, remover os fios de aço inoxidável antes de conectar o bioreactor de montagem para a bomba.
- Iniciar perfusão médio (taxa de fluxo de massa de 167,1 ul / min; microcanal parede de tensão de cisalhamento de 1 dine / cm2) em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
Nota: A taxa de perfusão de meio pode ser ajustado, dependendo da configuração do bioreactor e os objectivos e a concepção da experiência. - Continue perfusão meio para a duração da experiência, mudando o meio de cultura a cada sete dias.
- Esterilizar todos os componentes do bioreactor para a configuração cultura 3D (isto é, de biorreactor, tubos, uma pinça, e os acessórios necessários para a configuração do bioreactor) utilizando o processo específico para o bio-reactor para ser utilizado.
4. Surrogate Fixação e Processamento (Figura 1C)
- cryomolds de etiquetas e fitas de tecido de plástico para fixação e processamento de substitutos.
- Em seguida, substitutos encerram em gel de processamento do espécime, o qual é um material aquoso que é líquido a temperaturas quentes, mas solidifica à temperatura ambiente. As assistências processamento das amostras de gel em manter os substitutos intacta durante o processamento e facilita histológico seccionamento 14,20-22.
- Derreter processamento do espécime de gel num banho de água a 60 ° C para liquefazer o que, mantendo-se a esta temperatura até estar pronto para usar. Mova o biorreator com o substituto para uma cabine de segurança biológica.
- Pipeta de aproximadamente 300 ul de amostra de gel de processamento na parte inferior da cryomold marcado (Figura 1C, painel esquerdo).
- Usando uma lâmina de bisturi (No. 10 de preferência) e uma pinça retire cuidadosamente o substituto do biorreator ou do poço de um slide de câmara de 8 poços e colocá-lo no cryomold contendo amostra de processamento de gel.
Nota: marcação de tecidos corantes (ver Materiais / lista de equipamentos para um exemplo específico) de cores diferentes podem ser usados para marcar substitutos, permitindo assim que vários exemplos para ser incluído em uma cassete de tecido de uma maneira distinguíveis. - Pipeta de aproximadamente 300 ul de amostra de gel de processamento para cobrir o substituto na cryomold e incubar a 4 ° C durante 30 min para solidify.
- Uma vez que o gel de processamento de espécimes tem solidificado, remova o gel processamento das amostras contendo o substituto do cryomold, e colocá-lo em uma cassete de tecido.
- Coloque a cassete de tecido contendo o substituto em 10% de formalina tamponada neutra para 10 a 12 horas à temperatura ambiente para permitir a fixação completa.
- Após a fixação, mover a cassete de tecido contendo o substituto de etanol a 70% até ser processada a parafina.
Nota: Transferir o substituto de formalina em etanol evita a fixação com formalina, que pode causar a perda de imunorreactividade de cerca de 23 epitopos. O período de tempo em etanol não é crítica. Esta mudança de fixador é importante se o substituto será utilizado para imuno-histoquímica ou imunofluorescência. O substituto fixo está agora pronto para o processamento de parafina (Figura 1C, painel do meio). Esta transformação é tipicamente realizada num processador de tecido localizado numa aproxopriately laboratório equipado histologia. Um programa mais curto é recomendado devido ao tamanho e delicada natureza dos substitutos 24.
5. Seccionamento e H & E coloração (Figura 1C, painel da direita)
- Na sequência de processamento dos substitutos para um bloco de parafina, secção-los usando um micrótomo padrão para o corte de, tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina 24,25.
Nota: Isto pode ser realizado em um laboratório de histologia qualificada, ou em um laboratório de pesquisa, se devidamente equipado e experiente. A espessura das secções histológicas pode variar dependendo do uso pretendido das secções; no entanto, que normalmente usam seções que são 5 mm de espessura. A espuma PDMS usados aqui nos substitutos perfundidos é facilmente seccionado em micrótomo. - Coloque secções em lâminas histológicas de vidro simples.
- Após a secção, assar os cortes histológicos a 58 ° C durante 10-12 horas para se preparar para a coloraçãocom hematoxilina e eosina (H & E). Baking derrete a parafina e também permite uma melhor aderência de seções para a lâmina de vidro.
- H & E coloração:
- Configurar as estações descritos na Tabela 2 em frascos Coplin ou pratos de vidro para coloração, dependendo do número de lâminas para corar. Uma vez que os reagentes são criados, mover as seções através de cada estação, a fim, incubando durante o tempo indicado abaixo de 24.
- Montar uma lamela a cada slide usando a mídia de montagem.
- Permitir meios de montagem para secar antes de imagem.
| H & E coloração | ||
| Estação | Solução | Tempo |
| 1 | xileno | 5 min |
| 2 | xileno | <td> 5 min|
| 3 | xileno | 5 min |
| 4 | Etanol a 100% | 5 min |
| 5 | Etanol a 100% | 5 min |
| 6 | 95% Etanol | 5 min |
| 7 | 95% Etanol | 5 min |
| 8 | Agua de torneira | 5 min |
| 9 | Água desionizada | 5 min |
| 10 | hematoxilina 7211 | 5 min |
| 11 | Agua de torneira | 5 min |
| 12 | clarificador * | 10 mergulhos |
| * Richard Allan # 7401 ou 70% de etanol + 0,5% de HCl | ||
| 13 | Agua de torneira | 5 min |
| 14 | bluing Reagente | 30 seg |
| 15 | Agua de torneira | 5 min |
| 16 | 95% Etanol | 10 mergulhos |
| 17 | Eosina Y- | 1 minuto |
| 18 | 95% Etanol | 10 mergulhos |
| 19 | 95% Etanol | 10 mergulhos |
| 20 | Etanol a 100% | 10 mergulhos |
| 21 | Etanol a 100% | 10 mergulhos |
| 22 | Etanol a 100% | 5 min |
| 23 | xileno | 10 mergulhos |
| 24 | 5 min | |
Tabela 2. Coloração com H & E.
6. Medindo a densidade celular
- pelo menos um inteiro corte histológico imagem H & E manchada do substituto usando microscopia de campo claro no aumento de 400X, salvar as imagens como arquivos .tif.
Nota: O processamento de imagem descrita apenas foi concluída usando imagens coloridas. Embora não testado, acreditamos que o mesmo processamento também deve ser aplicável a imagens em tons de cinza. - Baixar CellProfiler do Instituto Broad 26 (http://cellprofiler.org/download.shtml) e ImageJ dos Institutos Nacionais de Saúde (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), ambos que são publicamente disponíveis sem nenhum custo.
- Para medir a área do substituto em cada imagem, ImageJ aberta, selecione "Definir Medidas" (na guia "Analisar"), selecione "Área" e selecione "Ok & #34 ;.
- Abra uma imagem (arquivo .tif) do substituto. Usando a ferramenta de polígono em ImageJ (ver Figura 2), delinear a área do substituto na imagem arrastando o mouse e clicar para fazer pontos de ancoragem. Use as bordas da ECM como um guia. Uma vez delineado, selecione "Measure" sob a guia "Analisar".
Figura 2. Análise ImageJ. Captura de tela de processamento de ImageJ. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Repita o procedimento para cada imagem do substituto do tecido. Salve medições e identificadores de imagem correspondentes a um programa de planilha.
- Fazer upload de arquivos de imagem usados para medir a área em ImageJ em CellProfiler arrastando arquivos de imagem para a "Lista de arquivos". Atribuir um nome para as imagens importadas emo "NamesAndTypes" módulo de entrada e selecione o tipo de imagem (ie, "color image").
Figura 3. CellProfiler exemplo pipeline. Screenshot do gasoduto projetado para medir o número de células nucleadas em CellProfiler. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Criar um gasoduto análise que inclui os seguintes módulos para calcular o número de células por imagem, clicando no sinal "+" ao lado de "Ajuste Module" (Figura 3, na parte inferior do painel da esquerda). Adicionar a cada um dos módulos abaixo.
- Seleccionar "ColorToGray" (Figura 4).
- Selecione o nome da imagem de entrada a partir do menu drop-down, o nome da imagem de saída, e selecione o tipo de imagem original (<em> ou seja, RGB se a entrada de imagem a cores).
Nota: Este módulo não seria necessária se o uso de imagens em tons de cinza
- Selecione o nome da imagem de entrada a partir do menu drop-down, o nome da imagem de saída, e selecione o tipo de imagem original (<em> ou seja, RGB se a entrada de imagem a cores).
- Seleccionar "ImageMath" (Figura 5).
- Selecione a operação "Invert", o nome da imagem de saída, e selecione a imagem em escala de cinza na guia "select primeira imagem".
- Seleccionar "IdentifyPrimaryObjects" (Figura 6).
- Selecionar imagem de entrada (imagem após a correção de matemática), o nome do objecto principal a ser identificado (núcleos) e digite a faixa de diâmetro para os objetos a serem medidos em unidades de pixel (cerca de 25 a 65). Selecione estratégia de limiar "adaptativa" com o método de limiar "Otsu", com "três classes". Não altere quaisquer outros parâmetros das configurações padrão.
Nota: O alcance máximo de diâmetros deverá ser determinada através da abertura de uma imagem na imagem de entrada do módulo e da medição do diâmetro de núcleo (isto é,o objecto principal) utilizando a ferramenta de medida de comprimento.
- Selecionar imagem de entrada (imagem após a correção de matemática), o nome do objecto principal a ser identificado (núcleos) e digite a faixa de diâmetro para os objetos a serem medidos em unidades de pixel (cerca de 25 a 65). Selecione estratégia de limiar "adaptativa" com o método de limiar "Otsu", com "três classes". Não altere quaisquer outros parâmetros das configurações padrão.
- Selecione "IdentifySecondaryObjects" (Figura 7).
- Selecione a imagem de entrada (imagem após a correção de matemática), selecione os objetos de entrada (núcleos), e nomear os objetos a serem identificados (células). Escolha o método de "propagação" para identificar objetos secundários, usar a estratégia limiar "adaptativa" e o método "Otsu" com "duas classes" minimização "variância ponderada". Selecione "sem suavização" e um fator de correção limiar de 1, o limite inferior e superior de 0 e 1, e um fator de regularização de 0,05. Não altere quaisquer outros parâmetros das configurações padrão.
- Seleccionar "MeasureObjectSizeShape" (Figura 8).
- células Seleccione (objeto secundário) e núcleos (objeto primário) como os objetos a serem medidos.
- Selecione "FilterObjects" (Figura 9
- Nomear os objetos de saída e selecionar os núcleos (objeto primário) como o objeto para filtrar.
- Mantenha os próximos dois parâmetros conforme as configurações padrão. Seleccionar "AreaShape", como o de medição para filtrar por categoria, e "FormFactor" como a medição.
- Selecione "Sim" para filtrar usando um valor mínimo de medição e adicionar um valor mínimo de 0,52.
- Selecione "Não" para filtrar utilizando uma medição máxima.
- Selecione "Sim" para reter os contornos de objetos filtrados e nomear a imagem delineada.
- Seleccionar "ColorToGray" (Figura 4).
- Seleccionar "ExportToSpreadsheet" (Figura 10)
- Selecione onde deseja salvar o arquivo eo nome "Arquivos de saída".
- Depois de a conduta análise é gerado (Passos 6.7.1 a 6.7.7.1), inicie o "Modo de teste" no CellProfiler e avaliar cada etapa, incluindo que os núcleos na imagem de teste são devidamente filtrada, para garantir aa idealtros foram escolhidos para identificar as células. A Figura 11 mostra uma imagem de saída a partir CellProfiler seguinte filtragem, em que os núcleos estão correctamente identificados (circulado em verde), eo fundo é filtrado.
- Uma vez que os parâmetros são avaliados e determinado a ser suficiente, salve o projeto e clique em "Analisar Imagens". Este projeto pode ser usado repetidamente para análise futura.
Nota: Uma vez que os parâmetros foram estabelecidos, o programa está configurado para analisar todas as imagens na "Lista de arquivos", sequencialmente. Isto irá resultar em várias janelas que abrem para cada imagem analisada, o que faz com que um maior tempo de processamento.- Para evitar um tempo de processamento mais longo, clique no ícone de olho em todos os módulos, exceto "ExportToSpreadsheet" sob a seção "módulos de análise".
- Uma vez que todas as imagens substitutos foram processados por CellProfiler, abra a planilha que contém os dados de imagem gerada por celular Profiler e a planilha que contém a área medida com ImageJ. Copiar os dados filtrados núcleos (coluna D na planilha CellProfiler) e os identificadores de imagem (coluna P) e colá-los na planilha que contém os dados da área medidos.
- Calcular a soma de todas as medições obtidas para o número de núcleos por imagem do substituto.
- Calcular a soma das medidas obtidas para a área de substituição a partir de cada imagem do substituto. Dividir a área total medido pelo 1x10 6.
- Dividir o número total de núcleos pela medição da área total do passo acima para se obter um valor para o número de células por 1x10 6 2 pixels.
Figura 4. gasoduto CellProfiler: mudar a imagem em escala de cinza Captura de tela do módulo "ColortoGray"..s: //www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig4highres.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. gasoduto CellProfiler:.. Image invertendo Captura de tela do módulo "ImageMath" Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. gasoduto CellProfiler:.. Identificando núcleos Captura de tela do módulo "IdentifyPrimaryObjects" Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. gasoduto CellProfiler:.. Células de identificação Captura de tela do módulo "IdentifySecondaryObjects" Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. gasoduto CellProfiler:.. Objetos de medição Captura de tela do módulo "MeasureObjectSizeShape" Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. gasoduto CellProfiler:. Filtrando objetos Screenshot de "FilterObjects "módulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. gasoduto CellProfiler:.. Exportação de dados Captura de tela do módulo "ExportToSpreadsheet" Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11. saída CellProfiler seguinte filtragem. Captura de tela da tela de saída no profiler celular após filtragem objeto. Por favor clique aqui para ver uma versi maioresem dessa figura.
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Representative Results
Ambos substitutos do cancro da mama 3D sólidos e perfundidos foram preparados como descrito acima e cultivados durante 7 dias. Subsequentemente, substitutos foram fixadas, processadas a parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina, como descrito acima. O número de células nucleadas por área (231 células e a CAF) de cada substituto foi medida. Como pode ser visto na Figura 12, as fotomicrografias representativas das secções de H @ E-coradas demonstrar uma concentração mais elevada de células presentes nos substitutos perfundidos (Figura 12A) em comparação com os substitutos de sólidos (Figura 12B), mesmo que a densidade de células inicialmente incorporada os substitutos foi o mesmo em ambas as condições de sólidos e perfundidos. Esta representação visual do crescimento celular é suportado por um número médio mais alto de células por área (densidade) nas substitutos perfundidos (n = 3) em comparação com os substitutos de sólidos (n = 3), como determinado por Tele CellProfiler análise (figura 12C). Para obter os dados da Figura 12C, uma vista em corte histológico completa de cada substituto foi representada por imagem, sendo necessárias múltiplas imagens para cada substituto, e as imagens foram analisadas como descrito acima. Em seguida, o número total de núcleos para cada substituto foi dividida pela área total do substituto (expresso como o número de núcleos / 1 x 10 6 2 pixels), proporcionando uma densidade celular para cada substituto. Para validar o uso de CellProfiler para a quantificação de células nucleadas, os resultados obtidos utilizando o programa CellProfiler foram comparados com os obtidos por simples contagem manual o número de células presentes por área em cada uma das 6 substitutos (Tabela 3). A densidade de células de cada substituto foi calculada como descrito acima. Nenhuma diferença significativa foi encontrada nas densidades celulares obtidos por contagem manual e análise CellProfiler tanto para substitutos perfundidos (p = 0,855) ou substitutos sólidos ( p = 0,553). Para apoiar que a diferença na densidade de células entre os substitutos sólidos e perfundidos correlaciona-se com uma diferença no crescimento celular, proliferação de células de cada substituto foi avaliada através de análise imuno-histoquímica de Ki-67 rotulagem (Figura 12D) 27. A mesma tendência foi encontrada, com uma percentagem significativamente mais elevada de células de proliferação nas substitutos perfundidos (n = 3) em comparação com os substitutos de sólidos (n = 3), o que indica uma taxa de crescimento mais elevada nos substitutos perfundidos e correlacionando-se com o aumento da densidade celular destes substitutos. Enquanto o tipo de célula (isto é, cancro da mama epitelial ou CAF) não foi avaliada no estas medições, a imunocoloração para os marcadores específicos do tipo de célula pode ser utilizada para compreender melhor o crescimento ou a distribuição de uma população de células específico. Protocolos detalhando este processo foram previamente publicados 25,28.
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Figura 12. Os resultados representativos. A) Imagem representativa de uma secção H @ E-coradas a partir de um substituto perfundido cultivadas durante 7 dias (400X ampliação original). B) Imagem representativa de uma secção H @ E-coradas a partir de um substituto sólido cultivados durante 7 dias com meio mudado a cada 2 dias (400X ampliação original). C) a comparação do número médio de células nucleadas por área, ou a densidade de células, após 7 dias de crescimento substitutos perfundidos (sem mudança de meio) e sólidos (meio mudado a cada 2 dias). D) Comparação de Ki 67 o índice de marcação (ou seja, a percentagem de células numa população que expresse Ki-67), uma medida da proliferação de células, após 7 dias de crescimento substitutos perfundidos e sólidos. Os dados representam a média ± SEM, n = 3 para cada condição, ** indica p≤0.01 e *** indica p≤0.001 (teste t de Student).tp_upload / 54004 / 54004fig12highres.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experimentar | CellProfiler: nucleadas células por área | Manuais: nucleadas células por área | CellProfiler média | manual de média | Valor P (t não pareado Test) |
| Perfusão Surrogate 1 | 88,178 | 75,532 | 97,225 | 99,901 | 0,855 |
| Perfusão Surrogate 2 | 107,528 | 117,812 | |||
| Perfusão Surrogate 3 | 95,967 | 106,359 | |||
| SOlid Surrogate 1 | 19,797 | 17,480 | 16,491 | 12,991 | 0,553 |
| Surrogate Solid 2 | 8,612 | 5.650 | |||
| Surrogate Solid 3 | 21,065 | 15,844 |
Tabela 3. As densidades celulares obtidos pela análise manual ou CellProfiler por 3 sólida e 3 substitutos perfundido.
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Discussion
Nisto, um processo de cultura 3D tem sido descrito que incorpora componentes do microambiente do tecido, incluindo a matriz extracelular (ECM) e fibroblastos de estroma humano, em um volume que mais de perto modelos de cancro da mama humano para permitir o desenvolvimento de uma morfologia 3D recapitulativo . O método de cultura 3D descrito é mais representativo das doenças humanas de cultura celular tradicional 2D em que vários tipos de células são incorporados em um volume 3D de ECM. Tem-se observado que esses parâmetros (isto é, vários tipos de células, ECM, e volume 3D) proporcionar um contexto mais apropriado para o estudo de processos biológicos porque a arquitectura dos tecidos, os sinais do microambiente, e dimensionalidade estão a ser tomadas em consideração 1,8. Outros métodos de cultura 3D foram previamente descritos incluindo, a cultura de células no topo de uma matriz 3D 29, a geração de esferóides 30, pendurado gota cutlures 31, umaND a utilização de dispositivos de microfluidos 32. Embora cada um desses sistemas tem vantagens únicas, em geral eles não incluem tanto componentes da matriz, populações de células do estroma, ou uma dimensionalidade representativa. O método de cultura 3D aqui descrito inclui cada um destes parâmetros e pode ser estabelecida utilizando um sistema de bioreactor para permitir períodos mais longos de crescimento que são difíceis de conseguir utilizando cultura 3D sólido. Além disso, a perfusão de substitutos proporciona um maior grau de crescimento comparado com substitutos sólidos.
Outra característica desta abordagem para a cultura in vitro é a flexibilidade nos tipos de análises que podem ser realizadas usando os substitutos "tecidos". Uma variedade de pontos de extremidade pode ser monitorizado durante a cultura indirectamente através da avaliação do meio condicionado, ou perfusato, para produtos solúveis (por exemplo, LDH como um indicador da morte celular, as proteínas secretadas ou metabolitos específicos como um indicadou da função fenotípica apropriado) ou através da utilização de imagem não invasivo de células fluorescentes ou luminescently marcadas para avaliar o crescimento e surrogate arquitetura horas extras. Após o crescimento, a ECM pode ser digerido utilizando uma protease de ECM e as células podem ser isoladas e utilizadas para análise ou mais experiências adicionais, tais como citometria de fluxo de quantificação 33. Os lisados das células removidas do ECM também pode ser avaliada genomicamente, ao nível do transcrito de ARNm, ou para a expressão da proteína. Alternativamente, os terminais pode ser medido diretamente dos substitutos "tecidos" fixo e processados após o experimento concluiu. Estes incluem uma variedade de parâmetros morfológicos (por exemplo, a morfologia nuclear / célula e o grau de agregação de células) em secções de H @ E-coradas histológicos e outras análises moleculares realizados em secções histológicas utilizando imuno-histoquímica (por exemplo, expressão de Ki-67 como indicador de célula proliferação) ou emhibridação in situ (por exemplo., a expressão de ARN de produtos de genes específicos). É também possível executar análises moleculares adicionais, tais como em tempo real, PCR quantitativo ou próxima geração de sequenciação, sobre estas, substitutos embebidos em parafina fixados com formalina; No entanto, devido à ligação cruzada molecular induzida por fixação e processamento, substitutos snap-congelados são preferidos para estes tipos de análises. Tais avaliações moleculares e morfológicas podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento celular, a morte ou a resposta ao tratamento farmacológico durante todo o crescimento, bem como seguir cultura.
A principal vantagem da utilização do programa CellProfiler para quantificação semi-automatizado de a densidade de células nucleadas presentes em cortes histológicos de substitutos é a economia de tempo que ela oferece. Embora a quantidade total de tempo necessário por substituto é variável e depende em grande parte do tamanho dos substitutos e o número de imagens adquiridas, é Estiacasaladas que chegam a uma densidade de células a partir das imagens de substituição requer 4-5 horas de mãos no tempo por substituto ao contar manualmente contra meia hora por substituto quando se utiliza o programa CellProfiler. A maioria das análises CellProfiler hands-on-time usando é atribuída à medição da área substituto no ImageJ. O programa CellProfiler requer tempo para processar automaticamente as imagens, mas não exige hands-on tempo do investigador e não importando as imagens.
Há limitações dos métodos e das culturas substitutas 3D descritos aqui. Como mostrado na Figura 12, a utilização do sistema de bioreactor de perfusão proporcionado um maior grau de crescimento de culturas sólidas, em que a acumulação de células e a taxa de proliferação é consideravelmente mais lenta. Embora o sistema de bioreactor de perfusão utilizado aqui fornecida uma vantagem de crescimento, sistemas de perfusão também pode ter as suas próprias limitações. Por exemplo, é PDMSmuitas vezes utilizado no fabrico de biorreactores, devido à sua facilidade de utilização, propriedades inertes, e reprodutibilidade. No entanto, este material é conhecido para absorver moléculas hidrofóbicas a partir de meios de cultura de células e pode levar até fármacos lipofílicos 34-36. Enquanto que outros materiais podem ser usados em vez de PDMS se essas limitações são uma preocupação, outros materiais disponíveis Também têm as suas próprias desvantagens que devem ser considerados. Porque a análise CellProfiler está dependente da entrada de parâmetros para o diâmetro e circularidade dos núcleos, a optimização destas entradas para cada tipo de substituto / célula pode ser necessária. É também digno de nota que a medida de densidade de celular aqui apresentada não é uma medida direta da viabilidade celular é. Foi previamente observado que uma medição directa da viabilidade celular é difícil em sistemas de cultura de 37 em 3D. No entanto, a degradação nuclear é uma parte de ambos apoptose e necrose, as duas predominam formas de morte celular. Na apoptose, os fragmentos de núcleo, umaprocesso chamado cariorrexe, após a condensação da cromatina, ou picnose 38,39. Isto difere da necrose, onde as ondas de células moribundas causando a ruptura da membrana celular e para libertar os conteúdos do seu citoplasma. Histologicamente, a necrose é caracterizada por cariólise (isto é, a dissolução de um núcleo), seguido por picnose e cariorrexe 40. Os núcleos que foram submetidos a estas alterações podem ser vistas em secções histológicas de H & E-coradas mas não irá ser reconhecido como núcleos intactos por o programa CellProfiler. Estas alterações nucleares ocorrem relativamente tarde no processo de morte celular no entanto. Portanto, a quantificação do número de células nucleadas por área podem incluir células que estão nos estádios iniciais de morte celular, mas, no entanto, irá fornecer informação útil sobre a viabilidade das células no momento da fixação substituto. Outros métodos que poderiam ser utilizados para indicar a viabilidade ou crescimento incluem análises de perfusatos (por exemplo, azul de Alamar ou ensaios de LDH) OR avaliação da proliferação nas "tecidos" substitutos (por exemplo, através de Ki-67 rotulagem por imuno-histoquímica).
etapas críticas do protocolo para a instalação substituto incluem ECM polimerização, onde a temperatura, pH, e de todos os tempos devem ser monitorados para garantir a polimerização completa antes de banhar o substituto no meio. Além disso, mantendo-se a mistura de células + ECM em gelo antes da cultura em placas com uma câmara de corrediça 8 poços de injecção ou num sistema de biorreactor é fundamental para prevenir a polimerização prematura. Além disso para evitar a polimerização durante a configuração de substituição, o bicarbonato de sódio usado para aumentar o pH a 7, deve ser adicionado à mistura anterior. Finalmente, deve ser dado tempo de incubação adequado, a 37 ° C para assegurar a polimerização completa do ECM; 45 minutos revelou-se suficiente. Outro factor importante na preparação de substituto é evitar a formação de bolhas. Em ambos os sistemas sólidos e perfundidos, o melhor é evitar a formação de bubbles na mistura de células + ECM a não criar um bloco para o fluxo de nutrientes durante a cultura. É também importante para evitar bolhas de ar durante a introdução do meio no sistema de perfusão onde uma bolha pode funcionar como uma embolia de ar, bloqueando o fluxo de meio.
fixação adequada é importante para a análise a jusante; por conseguinte, a atenção para fixação padronizada e consistente (incluindo o tipo de fixação e a quantidade de tempo em fixador) e o processamento é necessário obter resultados replicativas. A duração eo tipo de fixação é menos de um problema para a coloração H & E descrito aqui, mas esses parâmetros podem afetar outros tipos de análise molecular dos substitutos. Isto é porque a fixação da formalina, em particular, faz com que a ligação cruzada de moléculas, incluindo proteínas, ADN, ARN e de uma maneira um tanto dependente do tempo e específica molécula-41,42. Isto é de particular importância na análise imuno-histoquímica, quando o reconhecimento do anticorpo pode ser hinrado pelo cross-linking.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM) | Corning CellGro | 10-014-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| Tissue Culture plates, 100 mm | CellTreat Scientific Products | 229620 | Sterile |
| Tissue Culture plates, 35 mm | CellTreat Scientific Products | 229638 | For PDMS foam formation |
| 9" Glass pipette | Fisher | 13-678-20D | Sterile |
| 10 ml pipette | CellTreat Scientific Products | 229210B | Sterile |
| 1,000 µl piptette tips | FisherBrand | 02-717-166 | Sterile Filtered |
| 200 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-141 | Sterile Filtered |
| 10 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-158 | Sterile Filtered |
| 15 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229410 | Sterile |
| 50 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229422 | Sterile |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | FisherBrand | 05-408-129 | Sterile |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | Sterile |
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor. |
| PDMS Foam | Made in-house for use in our in-house bioreactor. | ||
| High Concentration Bovine Collagen Type I | Advanced Biomatrix | 5133-A | FibriCol ~10 mg/ml |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane) | Corning | 354230 | Basement membrane material |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S8761 | |
| Molecular Biology Grade Water | Fisher | BP2819-1 | |
| DMEM 10x | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| Nunc Lab-Tek Chamber Slide System | Thermo Scientific | 177402 | 8-well |
| Bioreactor | Made in-house. | ||
| Spring-Back 304 Stainless Steel—Coated with PTFE polymer | McMaster-Carr | 1749T19 | Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house bioreactor system. 0.016" Diameter |
| BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14 | Masterflex | EW-96440-14 | For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in. |
| 2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52 mm ID | Cole-Parmer | EW-74906-36 | For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump). |
| Six Channel precision micro peristaltic pump | Cole-Parmer | EW-74906-04 | For use with our in-house bioreactor system |
| Tuberculin Syringes | BD Medical | 309625 | 26 gauge 3/8 in. needle; Sterile |
| Dissecting Tissue Forceps | FisherBrand | 13-812-36 | 5.5 inch |
| Mini Tube Rotator | Boekel Scientific | 260750 | Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753) |
| 50 ml tube carousel | Boekel Scientific | 260753 | Used with mini tube rotator |
| Bambino Hybridization Oven | Boekel Scientific | 230301 | Equipment option for surrogate rotation |
| HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Specimen Processing Gel described in Step 5.2 |
| Cryomold | Andwin Scientific | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Tissue Marking Dye | Cancer Diagnostics, inc. | 03000P | Can be used to mark surrogates, allowing multiple samples to be included in one tissue cassette |
| Hinged tissue cassettes | FisherBrand | 22-272-416 | |
| Formalin | Fisher | 23-245-685 | |
| GoldSeal Plain Glass Slides | Thermo Scientific | 3048-002 | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Decon Laboratories, Inc. | 2805M | |
| Hematoxylin | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Clarifier | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7401 | |
| Bluing Solution | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | |
| Cytoseal XYL mounting media | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 83124 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5G |
References
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