זיהוי פלואורסצנטי רב צבעוני במיקרופלואידיקה טיפתית כולל בדרך כלל מערכות גילוי מבוססות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי מגושמות ומורכבות. כאן אנו מתארים ערכת זיהוי רב-צבעונית קומפקטית ומודולרית המשתמשת במערך של סיבים אופטיים כדי לקודד זמנית נתונים רב-צבעוניים שנאספו על ידי גלאי פוטו יחיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בדיקות פלואורסצנטיות הן הקריאות הנפוצות ביותר המשמשות במיקרופלואידיקה טיפתית בשל האותות הבהירים ותגובת הזמן המהירה שלהן. יישומים כגון מבחני מולטיפלקס, אבולוציה של אנזימים ומיון תאים משופר של ביולוגיה מולקולרית דורשים זיהוי של שני צבעים או יותר של פלואורסצנטיות. מערכות זיהוי צבעוניות סטנדרטיות המצמדות לייזרים בחלל פנוי למיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים הן מגושמות, יקרות וקשות לתחזוקה. במאמר זה, אנו מתארים סכימה לביצוע זיהוי רב-צבעוני על ידי אזורים בדידים מרגשים של תעלה מיקרופלואידית עם לייזרים המחוברים לסיבים אופטיים. האור הנפלט נאסף על ידי סיב אופטי המחובר לגלאי פוטו יחיד. מכיוון שהעירור מתרחש במיקומים מרחביים שונים, ניתן לקודד את זהות האור הנפלט כשינוי זמני, מה שמבטל את הצורך בתוכניות סינון אור מסובכות יותר. המערכת שימשה לאיתור אוכלוסיות טיפות המכילות ארבעה שילובים ייחודיים של צבעים ולזיהוי ריכוזים תת-ננו-מולאריים של פלואורסצאין.
מבוא
מיקרופלואידיקה אגל לתת במה ביולוגית קצב העברת נתונים גבוהה על ידי מידור ניסויים במספר רב של טיפות מימיות מרחפים מוביל שמן 1. טיפות שימשו עבור יישומים שונים כמו תא בודד ניתוח 2, תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (PCR) 3, ואת האנזים האבולוציה 4. מבחני פלורסנט הם במצב הרגיל של גילוי מיקרופלואידיקה רביב, כאותות הבהירים שלהם ועל זמן תגובה מהירה תואמים גילוי כרכי אגל משנה nanoliter בשיעורי kilohertz. יישומים רבים דורשים גילוי קרינה עבור זמנית בשני צבעים לפחות. למשל, במעבדה שלנו בדרך כלל מבצעת PCR המופעל ניסויי מיון אגל המשתמשים ערוץ זיהוי אחד על התוצאה של assay, ומשתמשת לצבוע רקע משני לעשות אגל ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור מאסטר SU8
- עיצוב מבני microfluidic עבור ייצור שכבה שלוש באמצעות תוכנת עיצוב יש את העיצובים מודפס על ידי ספק על סרט המעגלים עם 10 מיקרומטר ברזולוציה. הפרטים של עיצוב מכשיר ניתן הפניה מצורפת 6 ואת גיאומטריות הערוץ מוצגות באיור 1. השכבות צריכות לכלול סימני יישור כדי לעזור במתחמים בין תכונות שכבת ייצור 8.
- מניחים פרוסות סיליקון בקוטר מראש לנקות 3 אינץ 'על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מ"ל של SU8-3050 במרכז רקיק ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המצאה של מכשיר PDMS המאפשר ההחדרה של סיבים אופטיים דורשת פרוצדורת photolithography רב שלבים ליצור ערוצי גובה שונה (איור 1). ראשית, 80 מיקרומטר שכבה גבוהה של SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בדוגמת באמצעות מסכה כדי ליצור את גיאומטרית טיפול נוזל. הבא, שכבה נוספת 40 מיקרומטר של SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון, בדוגמת באמצעות מסכה השני כדי ליצור תכונות שיהוו 120 מיקרומטר ערוצי ההכנסה סיבים גבוה לייזר. לאחרונה, 100 מיקרומטר י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זיהוי סיבים אופטיים דורש יישור של סיבים אופטיים ביחס לאפיקי נוזל. מאחר שהמכשיר שלנו מנצל ערוצי מדריך מפוברקים עם photolithography multilayer, שמה של מסכות ביחס לזה היא בעלת חשיבות רבה. אם ערוצי מדריך סיבים קרובים מדי לערוץ הנוזל, קיים פוטנציאל לדליפת נוזל; אם ערוצי המדריך ממוקמים רחוק מדי או לא מיושר, אות הקרינה שנאספה על ידי סיבי זיהוי עשויה להצטמצם באופן משמעותי. יישור נכון יכול להסתייע בעיצוב סימני יישור, כגון מעגלים קונצנטריים לתוך מסכות כדי להיות שותף הממוקם במהלך דפוסי תמונה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק DARPA מספר 84389.01.44908, פרס NSF CAREER (DBI-1253293), מענק מחקר גישוש/פיתוח של NIH (CA195709), ופרסי NIH New Innovator (HD080351, DP2-AR068129-01), ומענק כיוונים חדשים מתוכנית הקצאת המשאבים של UCSF.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מסכות פוטו | CadArt Servcies | ||
| 3 אינץ' פרוסות סיליקון, סוג P, דרגת בדיקה בתולית | פרוסות אוניברסיטה | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון | Krayden | 4019862 | |
| מזרקים 1 מ"ל | BD | ||
| מזרקים 10 מ"ל | BD | 309604 | |
| 27 מחטי מד | BD | 305109 | |
| PE 2 צינורות פוליאתילן | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | ידוע בכינויו HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis הוראות בהפניה #10 | ||
| צבע כחול מפל מצומד Dextran | Life Technologies | D-1976 | |
| פלואורסצאין מלח נתרן | סיגמא | 28803 | |
| מסנן | פס מרובעSemrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| יציאת סיבים | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| צינור עדשה | Thorlabs | SM1L05 | |
| כבל תיקון עם 200 & #956; M ליבה / 225 & # 956; m חיפוי סיבים אופטיים עם קצה מופשט אחד ומחבר FC/PC אחד | מותאם אישית | של Thorlabs | |
| עם 105 & # 956; M ליבה / 125 & # 956; m חיפוי סיבים אופטיים עם קצה מופשט אחד ומחבר FC/PC אחד | Thorlabs | Custom | |
| 125 & # 956; כלי הפשטת סיבים m | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 & # 956; כלי הפשטת סיבים m | Thorlabs | T10S13 | |
| מתאם סיבים לייזר | OptoEngine | FC / PC מתאם | |
| 405 ננומטר CW לייזר ב 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | מפיץ לייזרים CNI |
| 473 ננומטר לייזר CW ב 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
מקורות
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
