Introduction
מיקרופלואידיקה אגל לתת במה ביולוגית קצב העברת נתונים גבוהה על ידי מידור ניסויים במספר רב של טיפות מימיות מרחפים מוביל שמן 1. טיפות שימשו עבור יישומים שונים כמו תא בודד ניתוח 2, תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (PCR) 3, ואת האנזים האבולוציה 4. מבחני פלורסנט הם במצב הרגיל של גילוי מיקרופלואידיקה רביב, כאותות הבהירים שלהם ועל זמן תגובה מהירה תואמים גילוי כרכי אגל משנה nanoliter בשיעורי kilohertz. יישומים רבים דורשים גילוי קרינה עבור זמנית בשני צבעים לפחות. למשל, במעבדה שלנו בדרך כלל מבצעת PCR המופעל ניסויי מיון אגל המשתמשים ערוץ זיהוי אחד על התוצאה של assay, ומשתמשת לצבוע רקע משני לעשות אגל assay שלילי 5 ספיר.
תחנות גילוי אופיינית עבור מיקרופלואידיקה אגל הם based על מיקרוסקופים epifluorescence, ודורשים מסובך תוכניות מניפולציות אור להציג אור עירור לייזרים מקום פנוי לתוך מיקרוסקופ להיות ממוקד על המדגם. לאחר הקרינה נפלטת מן אגל, האור לא זרח הנפלטים מסונן כך שכל ערוץ זיהוי מנצל צינור מכפיל אחד (PMT) התרכז להקה גל. מערכות epifluorescence זיהוי אופטי מבוסס מיקרוסקופ לספק חסם הכניסה בשל ההוצאה, מורכבותם, ונזקקו תחזוקה. סיבים אופטיים לספק את האמצעים לבנות ערכת זיהוי פשוטה וחזקה, מאז סיביים יכול להיות מוכנסים באופן ידני לתוך מכשירי microfluidic, יבטל את צורך ניתוב מבוסס אור במראה, ומאפשר נתיבי אור להתממשק באמצעות מחברי סיב אופטיים.
במאמר זה נתאר את ההרכבה והבדיקה של ערכה קומפקטית ומודולרי לבצע גילוי קרינה ססגוני ידי ניצול מערך של סיבים אופטייםדה היחיד photodetector 6. סיבים אופטיים הם מצמידים את לייזרי פרט המוכנסים נורמלים ערוץ זרימה בצורת L ב קיזוז מרחבית רגיל. סיב אוסף קרינה מכוון במקביל באזורי העירור מחובר PMT יחיד. בגלל אגל עובר דרך קרן הליזר בזמנים שונים, נתונים שרשמו PMT מראים זמני לקזז המאפשר למשתמש להבחין בין הקרינה הנפלטת לאחר האגל שמתלהב כל קרן ליזר ברורה. משמרת זמנית זו מבטלת את הצורך להפריד אור נפלט אל PMTs הנפרד באמצעות סדרה של מראות dichroic ומסנן bandpass. כדי לאמת את היעילות של הגלאי, אנו לכמת קרינה באוכלוסיות אגל encapsulating צבעים של צבע ריכוז שונה. הרגישות של המערכת הוא נחקר לגילוי והעמסת צבע אחד, ומראה את היכולת לזהות טיפות עם ריכוזים עד 0.1 ננומטר, הופעות רגישות 200xovement לעומת גישות סיבים מבוסס האחרונות מהמדווח בספרות 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור מאסטר SU8
- עיצוב מבני microfluidic עבור ייצור שכבה שלוש באמצעות תוכנת עיצוב יש את העיצובים מודפס על ידי ספק על סרט המעגלים עם 10 מיקרומטר ברזולוציה. הפרטים של עיצוב מכשיר ניתן הפניה מצורפת 6 ואת גיאומטריות הערוץ מוצגות באיור 1. השכבות צריכות לכלול סימני יישור כדי לעזור במתחמים בין תכונות שכבת ייצור 8.
- מניחים פרוסות סיליקון בקוטר מראש לנקות 3 אינץ 'על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מ"ל של SU8-3050 במרכז רקיק ועל ספין במשך 20 שניות ב 500 סל"ד, אז 30 שניות 1,750 סל"ד, מתן עובי שכבה של 80 מיקרומטר.
- הסר את רקיק ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 30 דקות. אפשר רקיק להתקרר RT לפני המעבר לשלב הבא.
- לחשוף את הפרוסות המצופות אל מסיכת שכבת 1 st תחת מטר collimated 190W, 365 ננומטר LED במשך 3 דקות. לאחר החשיפה, מניחים את פרוסות על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 1 דקות, אז מגניב RT לפני שתמשיך לשלב הבא.
- מניחים את פרוסות על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מיליליטר של SU8-3050 במרכז הרקיק ועל הספין במשך 20 שניות ב 500 סל"ד, אז 30 שניות ב 5000 סל"ד, וכתוצאה מכך שכבה המספקת עובי נוסף של 40 מיקרומטר.
- הסר את רקיק ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 30 דקות, ולאחר מכן מגניב RT לפני המעבר לשלב הבא.
- יישר את מסיכת שכבה 2 nd על הגיאומטריה בדוגמת 1.3 ולחשוף את רקיק מצופה על 190 mW collimated, 365 ננומטר LED במשך 3 דקות. לאחר החשיפה, מניחים על פלטה חשמלית C 135 מעלות במשך 4 דקות 30 שניות, אז מגניב RT לפני שתמשיך לשלב הבא.
- מניחים את פרוסות על coater ספין ולהדליק את אבק כדי להדביק אותה על צ'אק. החל 1 מ"ל של SU8-3050 במרכז רקיק ועל ספין במשך 20 שניות ב 500 סל"ד, אז 30שניות ב 1000 סל"ד, וכתוצאה מכך שכבה המספקת עובי נוסף של 100 מיקרומטר.
- הסר את רקיק ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 30 דקות, ולאחר מכן מגניב RT לפני המעבר לשלב הבא.
- יישר את מסיכת שכבה 3 rd על הגיאומטריה בדוגמת 1.3 ולחשוף את רקיק מצופה על 190 mW collimated, 365 ננומטר LED במשך 3 דקות. לאחר החשיפה, מניחים על פלטה חשמלית C 135 מעלות במשך 9 דקות, אז מגניב RT לפני שתמשיך לשלב הבא.
- לפתח את המסכות ידי טבילה באמבט בחש של אצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול למשך 30 דקות. שטפו את רקיק ב isopropanol ואופים על פלטה חמה C 135 מעלות במשך 1 דקות. מניחים את המאסטר שפותחה בצלחת פטרי 100 מ"מ עבור polydimethylsiloxane דפוס (PDMS).
2. PDMS ייצור המכשיר
- הכן 10: 1 PDMS על ידי שילוב של 50 גרם בסיס סיליקון עם 5 גרם של סוכן ריפוי בתוך כוס פלסטיק. מערבבים את התוכן עם כלי רוטרי מצויד במקל ומערבבים. מעלותכמו התערובת בתוך תא ייבוש למשך 30 דקות, או עד שכל בועות האוויר יוסרו.
- יוצקים את PDMS לתת עובי של 3 מ"מ כלפי מאמן ומקום בחזרה לתוך תא ייבוש עבור degassing נוספת. לאחר כל הבועות מוסרות, לאפות את המכשיר ב -80 מעלות צלזיוס במשך 80 דקות.
- חותכים את המכשיר מהתבנית באמצעות אזמל ומניחים על משטח נקי עם הצד בדוגמת מעלה אגרוף פתחי הכניסה fluidic שקעים עם ביופסיה 0.75 מ"מ. המכשיר חייב להיות לחתוך כך 120 מיקרומטר ו -220 מיקרומטר הגיאומטריות גבוהות נגישות מהצד של המכשיר.
- פלזמה לטפל במכשיר, עם צד תכונה כלפי מעלה, יחד עם טרום ניקה 2 אינץ 'על זכוכית שקופית 3 אינץ' ב 1 mbar O 2 פלזמה למשך 20 שניות בתוך שואב פלזמה 300 W. איגרות החוב המכשיר PDMS ידי הצבת בצד בדוגמת של המכשיר PDMS על הצד שטופלו פלזמה של שקופיות הזכוכית. מניח את המכשיר בתנור C 80 ° ואופי המכשיר התאסף במשך 40 דקות.
- לדקלם הערוציםהידרופובי באמצעות מזרק כדי לשטוף את המכשיר עם נוזל טיפול פני פלואור. מיד לאפות את המכשיר ב -80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להתאדות ממס.
3. הכנת הרכיבים האופטיים
- הכן את סיבי עירור הליזר ידי הסרת הבידוד בין 5 המ"מ האחרון של חיפוי 105 מיקרומטר ליבה, 125 מיקרומטר, NA = 0.22 סיבים אופטיים.
- הכן את סיבי עירור ליזר צבע 2 nd על ידי חזרה על 3.1 עבור סיב 2 nd זהה.
- הכן את הסיב לאיסוף אותות הקרינה על ידי חזרה על 3.1 עבור חיפוי 200 מיקרומטר ליבה, 225 מיקרומטר, NA = 0.39 סיבים אופטיים.
- בדוק את קצות כל הסיבים - אם את הטיפים אינם מסתיימים משטח שטוח, מחדש לבקע את הקצוות עם סופר סת"ם סיבים.
- צרף מצמד סיבים לייזר לייזר 50 mW, 405 ננומטר ולצרף אחד הסיבים הליבה 105 מיקרומטר הלייזר. כוון את הסוף הפשיט לחיישן של כוח הליזרמטר, ולהשתמש התאמות קנס של מצמד לייזר על מנת למקסם את כוח לייזר.
- חזור על 3.5 עבור לייזר ננומטר 50 mW, 473.
- הר 446/510/581/703 מסננים bandpass quad ננומטר על PMT באמצעות צינורות העדשה כדי לחסום אור לייזר ולהעביר הקרינה הנפלטת. צרף מצמד סיבים כך שהאור עובר דרך מסננים לפני שפגע PMT.
- צרף הסיב מ -3.3 ליחידה התכנסה 3.7.
4. מנותק מעורב דור אמולסיה
- השג מכשיר מיקרופלואידיקה זרימת מוקד dropmaker עם פתח מיקרומטר 60 מיקרומטר x 60.
- ממלאים מזרק 1 מ"ל עם שמנים HFE 7500 עם 2% יוניים fluorosurfactant 9.
- מלאו סדרה של 1 מ"ל מזרקים עם השילובים הבאים של והעמסת (FITC) וצבעים כחול מצומדות dextran (CB) ב- PBS: 1 ננומטר FITC / 10 ננומטר CB, 10 ננומטר FITC / 10 ננומטר CB, 1 ננומטר FITC / 100 ננומטר CB, ו -10 ננומטר FITC / 100 ננומטר CB.
- הר מכשיר dropmaker על הבמה של מייקרו הפוךלהתמודד ואת המזרקים המימיים ושמן על משאבות מזרק. זוג את המזרקים המכשירים באמצעות צינורות PE-2.
- הפעלת משאבות מזרק ב 500 μl / hr עבור נפט 250 μl / hr עבור תמיסות מימיות, ליצור תערובת של 80 מיקרומטר טיפות המכילות הפתרונות מ -4.3. עבור כל סוג של מדגם מימי, השתמש בהתקן dropmaker טרי לחסל זיהום צולב. אסוף ~ 200 μl של אמולסיה מכל שילוב צבע לתוך מזרק ריק.
- לאחר 4 סוגי טיפות נאספו בתוך מזרק אוסף יחיד, לערבב את תחליב על ידי החלפה של מזרק שוב ושוב.
- חזור על שלבים 4.2-4.6 עם תמיסות מימיות המכילות 0.1, 1, 10, ו 100 ננומטר FITC ב PBS.
5. הכנסת סיב אופטי
- מניחים את שבב microfluidic מפוברק בשלב 2 על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה יחד עם מצלמה דיגיטלית מסוגל <100 μsec במהירויות תריס.
- עבודה בזהירות מהצד, inseרט הסיב מצמיד את ליזר 473 ננומטר לתוך תעלה הרחוק זרם 120 מיקרומטר, נזהר שלא לנקב דרך לערוץ הנביעה העיקרי.
- הכנס את הסיבים מצמידים את ליזר 405 ננומטר לתוך תעלה הרחוק במורד זרם 120 מיקרומטר גבוה בצד, מתן מרווח סיבים של 300 מיקרומטר.
- הכנס את הסיב PMT מצמיד לתוך תעלה גבוה 220 מיקרומטר נורמלי סיבי עירור הליזר השני.
6. גילוי הקרינה של אמולסיות מעורבת
- הר מזרק 5 מ"ל מלא HFE 7500 עם 2% fluorosurfactant יוניים כניסת שמן spacer של מכשיר איתור עם צינורות PE-2.
- הר מזרק המכיל תחליב FITC / CB מעורבת על משאבת מזרק בכיוון אנכי ואת בני הזוג כניסת reinjection אגל של המכשיר באמצעות צינורות PE-2. חבר באורך של צינורות PE-2 מיציאת המכשיר מיכל פסולת.
- התקן הראש על ידי הפעלת כל אחד המשאבות ב 1000 μl / hr עד ששנישמן טיפות נראים להיות שילוב קבוע במכשיר וזורם במורד הזרם.
- התאם את ספיקות כך שמן spacer פועל ב -6,000 μl / hr ואת טיפות ב 100 μl / hr, מתן מרווח משמעותי בין טיפות ארוכים באזור זיהוי.
- הפעל לייזרים, להפעיל את תוכנית רכישת נתונים, ולהתאים את הרווח PMT לספק אותות כי הם יותר 100x הרצפה רעש הבסיס. התאם את כוח הליזר כך שכל פסגות הכפיל גלויים לעין על timetrace מדורג יחיד, באופן ליניארי.
- רוכשת 60 שניות של timetrace מתח PMT ב kHz 20 לפחות. לייבא את הנתונים לתוכנה מחשוב כגון Matlab ולמדוד למרומי הפסגות של כפילויות רשמה באמצעות סקריפט תוכנית מחשוב מותאמים אישית.
הערה: זה מסופק כמידע משלים. - חזור על שלבי 6.2-6.7 באמצעות התחליב המעורב FITC בלבד שנוצר 4.7, עם הליזר 405 ננומטר כבוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המצאה של מכשיר PDMS המאפשר ההחדרה של סיבים אופטיים דורשת פרוצדורת photolithography רב שלבים ליצור ערוצי גובה שונה (איור 1). ראשית, 80 מיקרומטר שכבה גבוהה של SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בדוגמת באמצעות מסכה כדי ליצור את גיאומטרית טיפול נוזל. הבא, שכבה נוספת 40 מיקרומטר של SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון, בדוגמת באמצעות מסכה השני כדי ליצור תכונות שיהוו 120 מיקרומטר ערוצי ההכנסה סיבים גבוה לייזר. לאחרונה, 100 מיקרומטר יותר SU-8 הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון, בדוגמת לתת 220 מיקרומטר ערוצי ההכנסה סיבים גבוה זיהוי. האדון מפותח והשתמש לעצב מכשיר PDMS, אשר בתורו קשור זכוכית שקופית. הייצור הסופי מכיל 80 מיקרומטר גיאומטרית זרימה גבוהה, לגשת דרך חורי אגרוף העליון של המכשיר ו -120 מיקרומטר ו -220 מיקרומטר ערוצי סיב אופטיים גבוהים לגשת דרך הצד שלהֶתקֵן.
הגיאומטריה של המכשיר משמש לגילוי מוצגת באיור 2. שנוצרו חיצוני 80 מיקרומטר תחליבים מחדש מוזרק ליציאת reinjection טיפה במרווחים על ידי שמן spacer לפני שהם לזרום לתוך ערוץ זיהוי בצורת L. שני סיבים מצמיד ליזר מוכנסים לתוך 120 מיקרומטר ערוצים גבוהים מספקים עירור במקומות מרחבית בדידים באפיק הזרימה. בגלל הסיבים multimode מוכנס לתוך הערוצים הללו יש 125 מיקרומטר קוטר חיצוני ו בקוטר הליבה 105 מיקרומטר, חתך שלם של ערוץ הזרימה הוא מואר על ידי אור לייזר. במכשיר שלנו ערוץ זרימת האיתור עושה תפנית של 90 מעלות בבת אחת כעבור באזור עירור הליזר האחרון ליצור גישה אופטית קרובה עבור סיב OD 225 מיקרומטר המשמש לאיתור קרינה נפלטת. הסיבים הגדולים משמש בגלל הצמצם המספרי הגבוה שלה (NA = 0.39), אשר דומה מטרת מיקרוסקופ רגילה.
אגל זורם דרך ערוץ זיהוי נתקל באזורי עירור דיסקרטיים מול כל אחת הסיבים האופטיים מצמיד ליזר (איור 3 א). PMT היחיד מצמיד את רשומות סיבי זיהוי נפלטי קרינה עם תזוזה זמנית המפות למקור העירור. במשך אגל המכיל צבעים שמרגשים ב 473 ננומטר (אזור "1" באיור 3 א) ו ב 405 ננומטר (אזור "2" באיור 3 ב), אות PMT וכתוצאה מכילה כפיל אות עם פרדת שיא כי בקורלציה עם הזמן שלוקח טיפה לנוע מאזור עירור אחד למשנהו. על ידי קידוד נתונים ספקטרליים זמנית באופן זה, את צורך סינון אור נוסף PMTs הנפרד לכל צבע fluorophore מתבטל. איור 3 ב מציג כפילויות אות לרכבת של 4 טיפות עם שילובי צבע שונים. השיא הראשון להתכתב הכפול ים אל הקרינה הנפלטת לאחר עירור על ידי לייזר 473 ננומטר באזור "1" ואת השיא השני מתאים הקרינה הנפלטת לאחר עירור על ידי לייזר 405 ננומטר באזור "2".
יעילותה של תכנית זיהוי נבדקה על ידי איתור תחליב מעורב של טיפות המכילות צבעים שהמרגשים ב 405 ננומטר (dextran מצומדות הכחול, CB) ו ב 473 ננומטר (והעמסה, FITC). טיפות היו זרמו אזורי זיהוי בערך 50 הרץ ונתונים נרשמים למשך 60 שניות, ואז פוסט-מעובד עם תסריט תכנית מחשוב. הנתונים להתוות איור 4 מראה הפרדה ברורה בין ארבעת סוגי אגל-מוזרק מחדש. מכיוון שמערכת זיהוי אינה מבחינה בין צבעים שונים של האור הנפלט, כל אגל מתואר על ידי הקרינה הכולל המרבי שלו לאחר להתרגש באזור "1" (שיא 1) ובאזור 2 (שיא 2).
p-together.within-page = "1"> את הטווח הדינמי ורגישות המוחלטת של הגלאי נחקרה על-ידי כיבוי ליזר 405 ננומטר ומדידת הקרינה של תחליב המכיל טיפות והעמסה בלבד (איור 5). הנתונים מראים את היכולת לזהות ריכוז לצבוע נע בין 0.1 ל 100 ננומטר FITC על גלאי יחיד עם אותן הגדרות זיהוי.
איור 1. photolithography רב שכבתי. מכשיר microfluidic הוא מפוברק על ידי יצירת הורים עם שלושה גבה תכונה שונים. ראשית, 80 מיקרומטר שכבה גבוהה של SU-8 הוא הסתובב על בדוגמת באמצעות מסיכה עבור ערוצי הנוזל. בשלב הבא, 40 מיקרומטר יותר SU-8 מסובב ו -120 מיקרומטר תכונות גבוהות הן בדוגמת עם 2 nd להסוות דרך הן של שכבות SU-8 להניב גיאומטריה כדי להכיל 125 מיקרומטר סיבים אופטיים גבוהים. אחרי זה, 100 מיקרומטר יותר SU-8 הוא הסתובב על בדוגמת עם מסכת 3 rd להניב 225 מיקרומטר תכונות גבוהות. לאחר הפיתוח, דפוס PDMS, מליט פלזמת הזכוכית, המכשיר כתוצאה מכיל תעלות גדולות נגישות מהצד להכנסת סיבים, בנוסף לערוצי נוזל סטנדרטיים סגורים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עיצוב התקני איור 2. ופריסה אופטית. המנות fluidic של המכשיר מורכב ות reinjector אגל ו spacer שמן, מצמידים את ערוץ בצורת רי"ש. סיבים מצמידים לייזרי פרט מוכנסים נורמלים כיוון הזרימה. סיב זיהוי מוכנס בניצב סיבי הליזר כדי לאסוף אור הניאון. האור הזה הוא הסתנן דרך abandpass מסנן, לפני שיראה על ידי מנה בודדת PMT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. קידוד Temporal מידע ססגוני. (א) טיפות לזרום דרך אזורי עירור "1" ו- "2" בזמנים שונים, מתן שינוי הזמן המאפשר זיהוי של האור הנפלט. (ב) נתוני מרכבה של 4 טיפות שונות זורמות דרך ערוץ זיהוי. השיא הראשון של כל כפיל תואם את הקרינה הנפלטת לאחר עירור באזור "1" ואת השיא השני בכל מקבילה כפולה על הקרינה הנפלטת לאחר העירור באזור "2". גובה פסגות אגל הם יחסים בסך של צבע מתרגש בכלגל נתון, למעט כאשר לדמם ספקטרלי מתרחש עקב השימוש בצבעים עם ספקטרום עירור חופף. רוחבו של פסגות נקבעים על פי כמות הזמן שלוקח טיפה לחצות אזור עירור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. זיהוי ססגוניות של אוכלוסיית אגל מעורבת. פיזור עלילה מראה עוצמות אגל מרביות עבור אוכלוסיית אגל מעורבת לאחר עירור ופליטה ידי ליזר 473 ננומטר (שיא 1) ו ליזר 405 ננומטר (שיא 2). הטיפין מכילות שילובים של והעמסה (FITC) וכחול אשד (CB) בריכוזים ננומטר. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.
איור 5. זיהוי צבע יחיד על אוכלוסיית אגל מגוונת מאוד. היסטוגרמה של פליטה על ידי אוכלוסיית אגל מעורבת המכילה 0.1-100 ננומטר של והעמסה לאחר עירור על ידי קרן ליזר 473 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי סיבים אופטיים דורש יישור של סיבים אופטיים ביחס לאפיקי נוזל. מאחר שהמכשיר שלנו מנצל ערוצי מדריך מפוברקים עם photolithography multilayer, שמה של מסכות ביחס לזה היא בעלת חשיבות רבה. אם ערוצי מדריך סיבים קרובים מדי לערוץ הנוזל, קיים פוטנציאל לדליפת נוזל; אם ערוצי המדריך ממוקמים רחוק מדי או לא מיושר, אות הקרינה שנאספה על ידי סיבי זיהוי עשויה להצטמצם באופן משמעותי. יישור נכון יכול להסתייע בעיצוב סימני יישור, כגון מעגלים קונצנטריים לתוך מסכות כדי להיות שותף הממוקם במהלך דפוסי תמונה. בנוסף, הוספה ידנית של סיבים אופטיים לתוך המכשיר הוא תהליך עדין עם פוטנציאל לשבור את קצות הסיבים בתוך המכשיר, טיוח אותם שמיש. הרחקת סיבים נגד שקופיות הזכוכית מלוכדות למכשיר PDMS והחדרת הסיבים לאט תוך כדי התבוננות עם מיקרוסקופ הם מפתחות succהחדרת סיב essful. לאחרונה, reinjection אמולסיות מראש יצרו אמור להתרחש עם מינימום של טיפול. באופן אידיאלי, פעם האמולסיה הוא עשה מופקד ישירות לתוך מזרק ריק, זה לא אמור להיות מועבר עד שהוא משמש reinjection רביב.
זיהוי ססגוני דורש כי פסגות כפיל אות להיות מובחנות זו מזו וכי איתותים מ- טיפות רצופות אינן חופפות. התקנת זיהוי שאנו משתמשים בו כאן משתמשת זוג 125 מיקרומטר סיבים אופטיים מופרדים ממרחק מרכז אל המרכז של 300 מיקרומטר, מתן אזור הלא מואר של ~ 175 מיקרומטר בין אזורי עירור. זה מאפשר אגל 80 מיקרומטר להתרגש רק אחד מקור אור בכל פעם ומבטיח שכל אחד פסגות כפיל הוא אך ורק תוצאה של סוג אחד של עירור ליזר. עיצובים שבו ההפרדה בין אזורי העירור דומה לקוטר האגל לתת אותות בעייתיים עם כפילויות שיא פליטת חופפים. Tהוא הרוחב של אות כפיל וקושרת הזמן שלוקח את הקצה המוביל של אגל להיכנס אזורי העירור הראשונים הזמן נגרר לקצה של רביב לעזוב את אזור העירור הסופי, מרחק של ~ 500 מיקרומטר המכשיר אנו מתארים. על מנת לשמור על ייחוד של טיפות זוהו סמוכות, כפילויות אות צריכות להיות מחולקות על ידי אזור אות נמוך לפחות רחב ככל כפיל האות. עבור התצורה המתוארת כאן, 80 מיקרומטר טיפות מחולקות לפחות 1 מ"מ זה מזה.
למרות זיהוי צבע רב עם photodetector יחיד המאפשר חיסכון משמעותי במונחים של עלויות ומורכבות לעומת טכניקות סטנדרטיות, יש איזה הפסד של עמידות מפני האור הנפלט אינו מסונן על ידי אורך הגל. זה יכול להיות בעייתי כאשר גילוי טיפות המכילות fluorophores המרובה שמרגשים באותו האורכים הגל, כי מקור הקרינה הוא נבדל. מגבלות אלה יכולים להיות overcשת על ידי ביצוע ניסויים עם פרופילים עירור nonoverlapping, או על ידי עיצוב בניסויים שבהם ספקטרלי לדמם מעל אינה מתרחשת לתוך "ערוץ" שבו assay רגיש מתבצע. זה תואם עם יישומי זיהוי microfluidic רב אגל, שבו צבע רקע בהיר משמש כדי לציין את נוכחותו של אגל, וכן fluorophore שני משמש לדווח התוצאה של assay ביולוגיה מולקולרי 10,11.
לעומת טכניקות סטנדרטיות, הגישה שלנו יש שני יתרונות עיקריים: 1) אזורי עירור רשומים מרחבית לבטל את צורך סינון אור מסובך, ו -2) שימוש סיבים אופטיים מסיר את הצרכים עבור מיקרוסקופ וחומרה אופטית לאור ישיר. מכיוון שאנו לענות על חששות טכניים משותפים עם מערכות גילוי microfluidic, חוקרים קודמים פתחו שיטות כדי לענות על חששות דומים. למשל, מרטיני et al. קרינה ססגונית תדיר לקודד רשמהעל ידי גלאי יחיד על ידי הקרנת מקור עירור באמצעות "ברקוד" בדוגמת ייחודית מסנני 12. השימוש שלנו מערך סיבים אופטיים מאפשר ניצול של שיטת קידוד הזמני דומה באמצעות תקן, את רכיבי מדף. הספרות מראה טכניקות צימוד אופטיות רבות אופטיות הנשלטות יותר כי החדרת הסיב הפשוטה שאנחנו מתארים. בליס et al. להשתמש מדריכי גל אופטי מלאים בנוזל עבור משלוח ואיסוף של אור מבוקר בקפידה ממקומות microchannel ספציפי 13, מרטינז ואסקז et לייזר בגלבו al. להשתמש הצרובות מצעים סיליקה התמזגו לספק עירור אור 14, ו Vishnubhatla et al. הם מסוגל להמציא ערוצי הכנסת סיבים דווקא באמצעות שילוב של קרינה כימית ליזר תחריט 15. כל הטכניקות האלה דורשים צעדים נוספים מעבר לאלו נהגו לפברק ארכיטקטורת בסיס fluidic של microflשבב uidic. בעוד הליכי ייצור אלה ייתכן שיהיו צורך עבור יישומי זיהוי רגישים מאוד, מצאנו כי החדרת סיב לתוך ערוץ PDMS יצוק היא נאותה עבור רוב היישומים היומיום במעבדה שלנו. מערכת זיהוי הצליחה לזהות ריכוזי FITC עד 100 PM ב 80 מיקרומטר טיפות, שווה בערך זיהוי של מולקולות fluorophore 17,000 ~. רגישות זו היא נאותה עבור יישומי זיהוי ביותר במעבדה שלנו משתמשים מערכת מבוססת-epifluorescence, הנפוץ ביותר מהם להיות מיון תא PCR מופעלת של טיפות חיוב assay המכילות הסכום השווה ל -10 מולקולות 6 fluorophore 11. את רגישות הזיהוי גם משווה בחיוב דיווח רגישויות לאחרונה של מערכות מבוססות סיבים אופטיים אחרים - למשל, זה 200x רגיש יותר את גבול הגילוי של 20 ננומטר של אלקסה פלואוריד 488 שדווח> 100 מיקרומטר טיפות 7.
Wדואר הציג אגל קומפקטי ומודולרי ערכת זיהוי צבע רב microfluidic כחלופת מערכות יקרות יותר, מורכבות, ומגושמות מבוססות מיקרוסקופ epifluorescence. רכיבי זיהוי הצורך בשימוש כאן (לייזרים, סיבים, מתאמי סיבים, לסנן PMT) ניתן לרכוש עבור <10,000 $, מה שהופך את איתור האגל רב צבע נגיש מספר רב של חוקרים, ומאפשרים לחוקרים פרטיים כדי להרשות תחנות זיהוי מספר במעבדה. המערכת גם להסיר כמה מכשולים מבוססי מומחיות כניסה, כמו מידת ההיכרות נדרשת ליישר מערכות אופטיות מקום פנוי בשילוב עם מיקרוסקופ epifluorescence. בנוסף טביעת הרגל הקטנה של ההתקנה לתגליות עושה אותו אידיאלי עבור יישומים ניידים אבחון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran-conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 μm fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 μm fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
References
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
