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Bioengineering

बूंद Microfluidics के लिए बहुरंगा प्रतिदीप्ति पता लगाने ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग

Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/54010
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

Introduction

छोटी बूंद microfluidics एक वाहक तेल 1 में निलंबित कर दिया जलीय बूंदों की एक बड़ी संख्या में प्रयोगों compartmentalizing द्वारा उच्च throughput जीव विज्ञान के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। के रूप में एकल कक्ष विश्लेषण 2, डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 3 के रूप में विविध बूंदों अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, और विकास 4 एंजाइम। के रूप में उनके उज्ज्वल संकेतों और तेजी से समय प्रतिक्रिया किलोहर्ट्ज दरों पर उप nanoliter छोटी बूंद की मात्रा का पता लगाने के साथ संगत कर रहे हैं फ्लोरोसेंट assays, छोटी बूंद microfluidics के लिए पता लगाने के मानक मोड रहे हैं। कई अनुप्रयोगों के साथ-साथ कम से कम दो रंग के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला में आमतौर पर प्रदर्शन करती पीसीआर सक्रिय छोटी बूंद छँटाई प्रयोगों है कि एक परख के परिणाम के लिए एक का पता लगाने के चैनल का उपयोग, और परख नकारात्मक छोटी बूंद गणनीय 5 बनाने के लिए एक उच्च माध्यमिक पृष्ठभूमि डाई का उपयोग करता है।

छोटी बूंद microfluidics के लिए विशिष्ट पता लगाने स्टेशनों बा रहे हैंepifluorescence सूक्ष्मदर्शी पर sed, और जटिल की आवश्यकता प्रकाश जोड़तोड़ योजनाओं माइक्रोस्कोप में मुक्त अंतरिक्ष लेज़र से उत्तेजना प्रकाश में पेश करने का नमूना पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा। प्रतिदीप्ति एक छोटी बूंद से उत्सर्जित होने के बाद, उत्सर्जित fluoresced प्रकाश फ़िल्टर ताकि प्रत्येक का पता लगाने के एक चैनल photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) एक तरंग दैर्ध्य बैंड पर केन्द्रित का इस्तेमाल करता है। Epifluorescence खुर्दबीन आधारित ऑप्टिकल पता लगाने प्रणालियों अपने खर्च, जटिलता के कारण प्रवेश के लिए एक बाधा प्रदान करते हैं और रखरखाव की आवश्यकता है। ऑप्टिकल फाइबर का मतलब है, एक सरल और मजबूत पता लगाने योजना का निर्माण करने के बाद से फाइबर मैन्युअल microfluidic उपकरणों में डाला जा सकता है, दर्पण आधारित प्रकाश मार्ग के लिए की जरूरत को हटाने, और अनुमति प्रकाश पथ ऑप्टिकल फाइबर connectors का उपयोग interfaced के लिए प्रदान करते हैं।

इस पत्र में, हम एक ऑप्टिकल फाइबर की एक सरणी का उपयोग करके बहुरंगा प्रतिदीप्ति का पता लगाने के प्रदर्शन करने के लिए विधानसभा और एक कॉम्पैक्ट और मॉड्यूलर योजना के सत्यापन का वर्णनडा एकल photodetector 6। ऑप्टिकल फाइबर अलग-अलग लेज़रों के लिए मिलकर कर रहे हैं और नियमित रूप से स्थानिक ऑफसेट पर एक एल आकार का प्रवाह चैनल के लिए सामान्य डाला जाता है। एक प्रतिदीप्ति संग्रह फाइबर उत्तेजना क्षेत्रों के लिए समानांतर उन्मुख है और एक भी पीएमटी से जुड़ा है। क्योंकि एक छोटी बूंद अलग अलग समय पर लेजर बीम के माध्यम से गुजरता है, पीएमटी द्वारा दर्ज आंकड़ों एक अस्थायी ऑफसेट कि उपयोगकर्ता प्रतिदीप्ति उत्सर्जित होने के बाद छोटी बूंद प्रत्येक विशिष्ट लेजर बीम से उत्साहित है के बीच अंतर करने की अनुमति देता है पता चलता है। यह अस्थायी पारी dichroic दर्पण और bandpass फिल्टर की एक श्रृंखला का उपयोग कर अलग PMTs को उत्सर्जित प्रकाश को अलग करने की आवश्यकता समाप्त। डिटेक्टर की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए, हम अलग अलग रंग और एकाग्रता के रंगों encapsulating छोटी बूंद आबादी में प्रतिदीप्ति quantitate। प्रणाली की संवेदनशीलता ही रंग fluorescein का पता लगाने के लिए जांच की जाती है, और सांद्रता के साथ बूंदों 0.1 एनएम, एक 200x संवेदनशीलता छापें नीचे पता लगाने की क्षमता से पता चलता हैके रूप में हाल ही में फाइबर आधारित दृष्टिकोण साहित्य 7 में रिपोर्ट की तुलना में ovement।

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Protocol

1. SU8 मास्टर निर्माण

  1. डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तीन परत निर्माण के लिए microfluidic संरचनाओं डिजाइन और डिजाइन 10 माइक्रोन संकल्प के साथ सर्किट बोर्ड फिल्म पर एक विक्रेता द्वारा मुद्रित है। डिवाइस डिजाइन का ब्यौरा एक संलग्न संदर्भ 6 में दिए गए हैं और चैनल geometries चित्र 1 में दिखाया गया है। परतों प्रत्येक निर्माण परत 8 से सुविधाओं लगाना मदद करने के लिए संरेखण के निशान को शामिल करना चाहिए।
  2. एक स्पिन coater पर एक पूर्व साफ 3 इंच व्यास की जगह सिलिकॉन वेफर और चक के लिए यह प्रत्यय करने के लिए वैक्यूम पर बारी। SU8-3050 के 1 मिलीलीटर 1750 rpm पर 500 rpm पर 20 सेकंड के लिए वेफर और स्पिन के केंद्र में लागू करें, तो 30 सेकंड, 80 माइक्रोन मोटाई की एक परत प्रदान करते हैं।
  3. वेफर निकालें और 30 मिनट के लिए एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर सेंकना। वेफर अगले कदम पर जाने से पहले आरटी को शांत करने की अनुमति दें।
  4. एक collimated 190 मीटर के तहत 1 सेंट परत मुखौटा करने के लिए लेपित वेफर बेनकाबडब्ल्यू, 365 एनएम 3 मिनट के लिए नेतृत्व किया। प्रदर्शन के बाद, एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर वेफर 1 मिनट के लिए, तो आरटी शांत अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले जगह है।
  5. स्पिन coater पर वेफर की जगह और चक के लिए यह प्रत्यय करने के लिए वैक्यूम पर बारी। SU8-3050 के 1 मिलीलीटर 5000 rpm पर 500 rpm पर 20 सेकंड के लिए वेफर और स्पिन के केंद्र में लागू करें, तो 30 सेकंड, एक परत है कि 40 माइक्रोन मोटाई के एक अतिरिक्त प्रदान करता है, जिसके परिणामस्वरूप।
  6. वेफर और सेंकना एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर 30 मिनट के लिए अगले कदम के लिए जाने से पहले तो आरटी शांत निकालें,।
  7. ज्यामिति 1.3 में नमूनों पर 2 एन डी परत मुखौटा संरेखित करें और एक collimated 190 मेगावाट, 365 एनएम 3 मिनट के लिए एलईडी के लिए लेपित वेफर बेनकाब। प्रदर्शन के बाद, एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर 4 मिनट 30 सेकंड के लिए, तो आरटी शांत अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले जगह है।
  8. स्पिन coater पर वेफर की जगह और चक के लिए यह प्रत्यय करने के लिए वैक्यूम पर बारी। 500 rpm पर 20 सेकंड के लिए वेफर और स्पिन के केंद्र में SU8-3050 के 1 मिलीलीटर लागू करें, तो 30सेकंड 1000 rpm पर, एक परत है कि 100 माइक्रोन मोटाई के एक अतिरिक्त प्रदान करता है, जिसके परिणामस्वरूप।
  9. वेफर और सेंकना एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर 30 मिनट के लिए अगले कदम के लिए जाने से पहले तो आरटी शांत निकालें,।
  10. ज्यामिति 1.3 में नमूनों पर 3 परत मुखौटा संरेखित करें और एक collimated 190 मेगावाट, 365 एनएम 3 मिनट के लिए एलईडी के लिए लेपित वेफर बेनकाब। प्रदर्शन के बाद, एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर 9 मिनट के लिए, तो आरटी शांत अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले जगह है।
  11. 30 मिनट के लिए प्रोपलीन ग्लाइकोल monomethyl ईथर एसीटेट की एक उभारा स्नान में डुबो कर मास्क का विकास करना। 1 मिनट के लिए एक 135 डिग्री सेल्सियस hotplate पर isopropanol और सेंकना में वेफर धो लें। polydimethylsiloxane (PDMS) ढलाई के लिए एक 100 मिमी पेट्री डिश में विकसित मास्टर रखें।

2. PDMS उपकरण निर्माण

  1. एक प्लास्टिक के कप में इलाज के एजेंट के 5 ग्राम के साथ सिलिकॉन आधार की 50 ग्राम के संयोजन से 1 PDMS: 10 तैयार करें। एक हलचल छड़ी के साथ लगे एक रोटरी उपकरण के साथ सामग्री मिश्रण। डिग्री30 मिनट के लिए एक desiccator अंदर मिश्रण के रूप में, या जब तक सभी हवाई बुलबुले को हटा रहे हैं।
  2. मास्टर पर 3 मिमी की मोटाई देने के लिए और आगे degassing के लिए desiccator में वापस जगह के लिए PDMS डालो। एक बार जब सभी बुलबुले को हटा रहे हैं, 80 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस सेंकना।
  3. एक छुरी और जगह का उपयोग मोल्ड से डिवाइस को कट नमूनों की ओर से एक स्वच्छ सतह पर और एक 0.75 मिमी बायोप्सी पंच के साथ fluidic inlets और दुकानों पंच। डिवाइस इतना है कि 120 माइक्रोन और 220 माइक्रोन लंबा geometries डिवाइस की ओर से सुलभ हैं कटौती की जानी चाहिए।
  4. प्लाज्मा एक 300 W प्लाज्मा क्लीनर में 20 सेकंड के लिए 1 मिलीबार हे 2 प्लाज्मा पर डिवाइस का इलाज, फीचर पक्ष के साथ, 3 इंच गिलास स्लाइड द्वारा एक पूर्व साफ 2 इंच के साथ। गिलास स्लाइड के प्लाज्मा इलाज पक्ष पर PDMS डिवाइस के नमूनों की ओर रखकर PDMS डिवाइस बांड। इस उपकरण में एक 80 डिग्री सेल्सियस ओवन में जगह और 40 मिनट के लिए इकट्ठे डिवाइस सेंकना।
  5. चैनलों प्रस्तुत करनाएक fluorinated सतह के उपचार के तरल पदार्थ के साथ डिवाइस फ्लश करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करके हाइड्रोफोबिक। इसके तत्काल बाद 80 डिग्री सेल्सियस पर डिवाइस सेंकना 10 मिनट विलायक लुप्त हो जाना करने के लिए।

3. ऑप्टिकल उपकरणों की तैयारी

  1. एक 105 माइक्रोन कोर, 125 माइक्रोन आवरण के अंतिम 5 मिमी से इन्सुलेशन हटाने के द्वारा लेजर उत्तेजना फाइबर तैयार करें, एनए = 0.22 ऑप्टिकल फाइबर।
  2. एक 2 एन डी समान फाइबर के लिए 3.1 दोहरा द्वारा 2 एन डी रंग लेजर उत्तेजना फाइबर तैयार करें।
  3. एक 200 माइक्रोन कोर, 225 माइक्रोन आवरण के लिए 3.1 दोहरा द्वारा प्रतिदीप्ति संकेत इकट्ठा करने के लिए फाइबर तैयार करें, एनए = 0.39 ऑप्टिकल फाइबर।
  4. सभी तंतुओं के सुझावों का निरीक्षण - अगर सुझावों के लिए एक फ्लैट सतह में अंत नहीं है, एक फाइबर मुंशी के साथ समाप्त होता है फिर से फोड़ना।
  5. एक 50 मेगावाट, 405 एनएम लेजर करने के लिए एक लेजर फाइबर युग्मक देते हैं और लेजर करने के लिए 105 माइक्रोन कोर फाइबर की एक देते हैं। लेजर शक्ति के संवेदक पर छीन अंत प्रत्यक्षमीटर है, और लेजर युग्मक के ठीक समायोजन का उपयोग लेजर शक्ति को अधिकतम करने के लिए।
  6. एक 50 मेगावाट, 473 एनएम लेजर के लिए 3.5 दोहराएँ।
  7. पीएमटी लेजर प्रकाश ब्लॉक और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संचारित करने के लिए लेंस ट्यूब का उपयोग पर एक 446/510/581/703 एनएम ट्रैक्टर bandpass फिल्टर माउंट। इतना है कि प्रकाश पीएमटी से टकराने से पहले फिल्टर के माध्यम से यात्रा फाइबर युग्मक संलग्न।
  8. यूनिट 3.7 में इकट्ठा करने के लिए 3.3 से फाइबर संलग्न।

4. ऑफलाइन मिश्रित पायस जनरेशन

  1. एक 60 माइक्रोन x 60 माइक्रोन छिद्र के साथ एक प्रवाह फोकस microfluidics dropmaker डिवाइस प्राप्त करते हैं।
  2. 2% आयनिक fluorosurfactant 9 के साथ HFE 7500 तेलों के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें।
  3. 1 एनएम FITC / 10 एनएम सीबी, 10 एनएम FITC / 10 एनएम सीबी, 1 एनएम FITC / 100 एनएम: fluorescein के निम्नलिखित संयोजन (FITC) और dextran संयुग्मित नीले रंगों पीबीएस में (सीबी) के साथ 1 मिलीलीटर सीरिंज की एक श्रृंखला भरें सीबी, और 10 एनएम FITC / 100 एनएम सीबी।
  4. एक औंधा माइक्रो के मंच पर dropmaker डिवाइस माउंटनिपटने के लिए और सिरिंज पंप पर जलीय और तेल सीरिंज। जोड़ी का उपयोग पीई -2 ट्यूबिंग उपकरणों के लिए सीरिंज।
  5. 500 μl / तेल और जलीय समाधान के लिए 250 μl / घंटा के लिए मानव संसाधन में सिरिंज पंप चल रहा है, 80 माइक्रोन 4.3 से समाधान युक्त बूंदों का एक मिश्रण बनाने के लिए। जलीय नमूने के प्रत्येक प्रकार के लिए, पार प्रदूषण को खत्म करने के लिए एक ताजा dropmaker डिवाइस का उपयोग करें। एक खाली सिरिंज में हर रंग संयोजन से पायस के ~ 200 μl लीजिए।
  6. बाद 4 बूंदों प्रकार एक एकल संग्रह सिरिंज में एकत्र किया गया है, बार बार सिरिंज घूर्णन द्वारा पायस मिश्रण।
  7. दोहराएँ जलीय समाधान पीबीएस में युक्त 0.1, 1, 10, और 100 एनएम FITC साथ 4.2-4.6 कदम।

5. ऑप्टिकल फाइबर निवेशन

  1. microfluidic चिप एक डिजिटल <100 μsec शटर गति में सक्षम कैमरा के साथ मिलकर एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर चरण 2 में गढ़े रखें।
  2. पक्ष, INSE से सावधानी से काम करनासब से अधिक दूर नदी के ऊपर 120 माइक्रोन चैनल में फाइबर 473 एनएम लेजर करने के लिए मिलकर आरटी, ख्याल रख रही मुख्य प्रवाह चैनल के माध्यम से पंचर करने के लिए नहीं।
  3. , सब से अधिक दूर नीचे की ओर 120 माइक्रोन उच्च पक्ष चैनल में फाइबर 405 एनएम लेजर करने के लिए मिलकर डालें 300 माइक्रोन के फाइबर रिक्ति प्रदान करते हैं।
  4. 220 माइक्रोन लंबा दो लेजर उत्तेजना तंतुओं को सामान्य चैनल में पीएमटी मिलकर फाइबर डालें।

6. मिश्रित emulsions के प्रतिदीप्ति पता लगाने

  1. एक 5 मिलीलीटर पीई -2 टयूबिंग के साथ पता लगाने डिवाइस की स्पेसर तेल प्रवेश करने के लिए 2% आयनिक fluorosurfactant साथ HFE 7500 के साथ भरा सिरिंज माउंट।
  2. एक खड़ी उन्मुख सिरिंज पंप और डिवाइस की छोटी बूंद reinjection प्रवेश करने के लिए जोड़ी का उपयोग पीई -2 ट्यूबिंग पर मिश्रित FITC / सीबी पायस युक्त सिरिंज माउंट। बर्बादी कंटेनर के लिए इस उपकरण बाहर से पीई -2 ट्यूबिंग की लंबाई कनेक्ट करें।
  3. दोनों जब तक 1,000 μl / घंटा पर पंप के प्रत्येक चलाने के द्वारा प्रधानमंत्री डिवाइसतेल और बूंदों नियमित रूप से डिवाइस में संयोजन और नीचे की ओर बहने करते हुए देखा गया।
  4. , प्रवाह दरों ऐसी है कि स्पेसर तेल 6,000 μl / घंटा पर चलाता है और 100 μl / घंटा पर बूंदों को समायोजित पता लगाने के क्षेत्र के माध्यम से यात्रा की बूंदों के बीच महत्वपूर्ण अंतर रखने प्रदान करते हैं।
  5. लेज़रों चालू करें, डाटा अधिग्रहण कार्यक्रम शुरू, और संकेत है कि आधारभूत शोर मंजिल 100x से अधिक कर रहे हैं प्रदान करने के लिए पीएमटी लाभ को समायोजित। लेजर बिजली समायोजित इतना है कि नक़ल चोटियों के सभी स्पष्ट रूप से एक एकल, रैखिक पहुंचा timetrace पर दिखाई दे रहे हैं।
  6. कम से कम 20 kHz पर पीएमटी वोल्टेज timetrace के 60 सेकंड के मोल। ऐसे मैटलैब के रूप में कंप्यूटिंग कार्यक्रम में डेटा आयात और कस्टम कंप्यूटिंग कार्यक्रम स्क्रिप्ट का उपयोग कर दर्ज दोहरी की चोटियों की ऊंचाई मापने।
    नोट: इस अनुपूरक जानकारी के रूप में प्रदान की जाती है।
  7. दोहराएँ 4.7 में बनाया FITC केवल मिश्रित पायस का उपयोग कर, 405 एनएम लेजर के साथ बंद कर दिया 6.2-6.7 कदम।

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Representative Results

एक PDMS डिवाइस है कि ऑप्टिकल फाइबर की प्रविष्टि के लिए अनुमति देता है का निर्माण अलग-अलग ऊंचाई (चित्रा 1) के चैनलों बनाने के लिए एक multistep फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया की आवश्यकता है। सबसे पहले, एक 80 माइक्रोन SU-8 का लंबा परत एक सिलिकॉन वेफर पर घूमती है और तरल पदार्थ से निपटने ज्यामिति बनाने के लिए एक मुखौटा का उपयोग नमूनों है। अगले, SU-8 के एक अतिरिक्त 40 माइक्रोन परत वेफर पर घूमती है, और विशेषताएं है कि 120 माइक्रोन लंबा लेजर फाइबर प्रविष्टि चैनलों बनेगी बनाने के लिए एक दूसरे मुखौटा का उपयोग नमूनों है। अंतिम, 100 माइक्रोन अधिक SU-8 वेफर पर घूमती है, और 220 माइक्रोन लंबा पता लगाने फाइबर प्रविष्टि चैनलों देने के लिए नमूनों है। मास्टर विकसित की है और एक PDMS डिवाइस है, जो बारी में एक गिलास स्लाइड को बंधुआ है मोल्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अंतिम निर्माण, 80 माइक्रोन लंबा प्रवाह ज्यामिति में शामिल है के पक्ष के माध्यम से पहुँचा डिवाइस और 120 माइक्रोन और 220 माइक्रोन लंबा ऑप्टिकल फाइबर चैनलों के शीर्ष में छिद्रित छेद के माध्यम से पहुँचाडिवाइस।

पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया उपकरण की ज्यामिति चित्रा 2 में दिखाया गया है। बाह्य उत्पन्न 80 माइक्रोन इमल्शन एक बूंद reinjection पोर्ट में फिर से इंजेक्शन और स्पेसर तेल से स्थान दिया गया है इससे पहले कि वे एक एल आकार का पता लगाने के चैनल में प्रवाह कर रहे हैं। दो लेजर मिलकर फाइबर डाला में 120 माइक्रोन लंबा चैनलों प्रवाह चैनल में असतत स्थानिक स्थानों पर उत्तेजना प्रदान कर रहे हैं। क्योंकि बहुपद्वति इन चैनलों में डाला फाइबर एक 125 माइक्रोन बाहरी व्यास और एक 105 माइक्रोन कोर व्यास है, प्रवाह चैनल के पूरे पार अनुभाग लेजर प्रकाश से प्रकाशित किया जाता है। हमारे डिवाइस में पता लगाने के प्रवाह चैनल एक 225 माइक्रोन आयुध डिपो उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया फाइबर के लिए बंद ऑप्टिकल पहुँच बनाने के लिए पिछले लेजर उत्तेजना क्षेत्र के बाद एक अचानक 90 डिग्री के मोड़ देता है। बड़ा फाइबर इसकी उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए = 0.39), जो एक मानक खुर्दबीन उद्देश्य के लिए इसी तरह की है की वजह से किया जाता है।

एक छोटी बूंद का पता लगाने के चैनल के माध्यम से बह लेजर-युग्मित ऑप्टिकल फाइबर (चित्रा 3 ए) में से प्रत्येक के सामने असतत उत्तेजना क्षेत्रों का सामना करना पड़ता। एकल पीएमटी का पता लगाने फाइबर रिकॉर्ड एक अस्थायी पारी उत्तेजना स्रोत के लिए नक्शे के साथ उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के लिए युग्मित। एक छोटी बूंद कि रंगों कि 473 एनएम (क्षेत्र "1" चित्रा 3 ए में) और 405 एनएम (क्षेत्र "2" चित्रा 3 बी में) पर उत्तेजित होता है के लिए है, जिसके परिणामस्वरूप पीएमटी संकेत एक चोटी जुदाई उस के साथ संबद्ध के साथ एक संकेत नक़ल शामिल समय के लिए यह एक उत्तेजना क्षेत्र से अगले करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक छोटी बूंद लेता है। अस्थायी इस तरीके से वर्णक्रमीय डेटा एन्कोडिंग द्वारा, आगे प्रकाश छानने और प्रत्येक fluorophore रंग के लिए अलग PMTs के लिए की आवश्यकता समाप्त हो रहा है। चित्रा 3 बी विभिन्न डाई संयोजन के साथ 4 बूंदों की एक ट्रेन के लिए संकेत दोहरी पता चलता है। डबल अनुरूप में पहली शिखरप्रतिदीप्ति क्षेत्र में "1" 473 एनएम लेजर और दूसरा शिखर से उत्तेजना के बाद उत्सर्जित एस क्षेत्र में "2" 405 एनएम लेजर द्वारा उत्तेजना के बाद उत्सर्जित प्रतिदीप्ति से मेल खाती है।

पता लगाने योजना की प्रभावकारिता रंगों कि 405 एनएम (dextran संयुग्मित नीले, सीबी) पर उत्तेजित और 473 एनएम (fluorescein, FITC) पर युक्त बूंदों के एक मिश्रित पायस पता लगाने के द्वारा परीक्षण किया गया था। बूंदों लगभग 50 हर्ट्ज पर पता लगाने के क्षेत्रों के माध्यम से प्रवाहित कर रहे थे और डेटा 60 सेकंड है, तो एक कंप्यूटिंग कार्यक्रम स्क्रिप्ट के साथ बाद संसाधित के लिए दर्ज किया गया था। डेटा चित्रा 4 में साजिश रची और चार पुन इंजेक्शन छोटी बूंद प्रकार के बीच स्पष्ट विभाजन से पता चलता है। क्योंकि पता लगाने प्रणाली उत्सर्जित प्रकाश के विभिन्न रंगों के बीच अंतर नहीं है, हर छोटी बूंद क्षेत्र "1" में उत्साहित किया जा रहा (पीक 1) के बाद और इस क्षेत्र में 2 (पीक 2) इसकी अधिकतम कुल प्रतिदीप्ति द्वारा वर्णित है।

(चित्रा 5) एक पायस fluorescein केवल बूंदों से युक्त के प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा जांच की है। डेटा डाई एकाग्रता है कि एक ही पता लगाने सेटिंग्स के साथ एक एकल डिटेक्टर पर 0.1 से 100 एनएम FITC के लिए सीमा का पता लगाने के लिए क्षमता को दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1. बहु परत photolithography। microfluidic युक्ति तीन अलग-अलग ऊंचाइयों की सुविधा के साथ एक मास्टर बनाने के द्वारा निर्मित है। सबसे पहले, एक 80 माइक्रोन SU-8 का लंबा परत पर घूमती है और तरल पदार्थ चैनलों के लिए एक मुखौटा का उपयोग नमूनों है। इसके बाद, 40 माइक्रोन अधिक SU-8 पर घूमती है और 120 माइक्रोन लंबा सुविधाओं ज्यामिति उपज के लिए 125 माइक्रोन लंबा ऑप्टिकल फाइबर को समायोजित करने के लिए एक 2 के साथ नमूनों एन डी SU-8 परतों के माध्यम से दोनों मुखौटा हैं। इस के बाद, 100 माइक्रोन अधिक SU-8 पर घूमती है और 225 माइक्रोन लंबा सुविधाओं उपज के लिए एक 3 मुखौटा के साथ नमूनों है। विकास, PDMS मोल्डिंग, कांच के लिए और प्लाज्मा संबंध के बाद, उसके एवज में डिवाइस बड़े चैनलों मानक संलग्न तरल पदार्थ चैनलों के अलावा, फाइबर प्रविष्टि के लिए की ओर से सुलभ होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. डिवाइस डिजाइन और ऑप्टिकल लेआउट। डिवाइस का fluidic अंश एक छोटी बूंद reinjector और एक तेल स्पेसर, एक एल के आकार चैनल के लिए युग्मित के शामिल हैं। अलग-अलग लेज़रों के लिए मिलकर फाइबर प्रवाह की दिशा को सामान्य डाला जाता है। एक का पता लगाने के लिए फाइबर आदेश फ्लोरोसेंट प्रकाश इकट्ठा करने के लिए लेजर फाइबर सीधा करने के लिए डाला जाता है। यह प्रकाश एबी के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता हैandpass फिल्टर, एक भी पीएमटी के द्वारा पता लगाया जा रहा से पहले। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. बहुरंगा जानकारी के टेम्पोरल एन्कोडिंग। (ए) बूंदों अलग अलग समय पर उत्तेजना क्षेत्र "1" और "2" के माध्यम से प्रवाह, समय बदलाव है कि प्रकाश उत्सर्जित की पहचान के लिए अनुमति देता है प्रदान करते हैं। (बी) के 4 अलग पहचान चैनल के माध्यम से बह बूंदों की एक ट्रेन से डेटा। प्रत्येक नक़ल की पहली शिखर प्रतिदीप्ति क्षेत्र में "1" उत्तेजना और प्रतिदीप्ति क्षेत्र में "2" उत्तेजना के बाद उत्सर्जित करने के लिए प्रत्येक डबल मेल खाती में दूसरी चोटी के बाद उत्सर्जित से मेल खाती है। छोटी बूंद चोटियों की ऊंचाई पर डाई उत्साहित की राशि आनुपातिक हैंतरंग दैर्ध्य दिया, जब वर्णक्रम खून उत्तेजना स्पेक्ट्रा ओवरलैपिंग के साथ रंगों के उपयोग के कारण होता है छोड़कर। चोटियों की चौड़ाई समय है कि यह एक छोटी बूंद लेता है एक उत्तेजना क्षेत्र पार करने के लिए की राशि से निर्धारित होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक मिश्रित छोटी बूंद आबादी का बहुरंगा पता लगाने। तितर बितर एक 473 एनएम लेजर (पीक 1) द्वारा उत्तेजना और उत्सर्जन के बाद एक मिश्रित आबादी छोटी बूंद के लिए अधिकतम छोटी बूंद तीव्रता दिखा साजिश और 405 एनएम लेजर (पीक 2)। बूंदों एनएम सांद्रता में fluorescein (FITC) और झरना ब्लू (सीबी) के संयोजन के होते हैं। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।

चित्रा 5
चित्रा अत्यधिक विविध छोटी बूंद आबादी पर 5. एकल रंग का पता लगाने। एक 473 एनएम लेजर द्वारा उत्तेजना के बाद fluorescein के 0.1-100 एनएम युक्त एक मिश्रित आबादी छोटी बूंद से उत्सर्जन के हिस्टोग्राम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

फाइबर ऑप्टिक का पता लगाने के तरल पदार्थ चैनलों के लिए सम्मान के साथ ऑप्टिकल फाइबर के संरेखण की आवश्यकता है। क्योंकि हमारे डिवाइस गाइड चैनलों बहुपरत photolithography के साथ गढ़े का इस्तेमाल करता है, एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ मास्क की नियुक्ति को बहुत महत्व का है। फाइबर गाइड चैनलों को भी तरल पदार्थ चैनल को बंद कर रहे हैं, वहाँ तरल पदार्थ के रिसाव के लिए एक संभावित है; यदि गाइड चैनलों बहुत दूर स्थित या misaligned हैं, प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने फाइबर द्वारा एकत्र हुए काफी कम किया जा सकता है। उचित संरेखण मास्क तस्वीर patterning के दौरान सह-स्थित होना में इस तरह गाढ़ा हलकों के रूप में संरेखण के निशान, डिजाइन द्वारा सहायता प्राप्त की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, इस उपकरण में फाइबर ऑप्टिक्स के मैनुअल प्रविष्टि क्षमता, डिवाइस के भीतर फाइबर के सुझावों को तोड़ने के लिए उन्हें व्यर्थ प्रतिपादन के साथ एक नाजुक प्रक्रिया है। माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन करते हुए कुंजियों गिलास स्लाइड PDMS डिवाइस को बंधुआ खिलाफ फाइबर निरोधक और धीरे धीरे फाइबर डालने हैं succ के लिएessful फाइबर प्रविष्टि। पिछले है, पूर्व गठित emulsions के reinjection से निपटने का एक न्यूनतम के साथ हो जाना चाहिए। आदर्श रूप में, एक बार पायस बना दिया है और एक खाली सिरिंज में सीधे जमा किया जाता है, यह जब तक यह छोटी बूंद reinjection के लिए प्रयोग किया जाता है स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए।

बहुरंगा का पता लगाने के लिए एक संकेत है कि नक़ल में चोटियों को एक दूसरे से और कहा कि लगातार बूंदों से संकेत ओवरलैप नहीं है अलग होने की आवश्यकता है। पता लगाने सेटअप है कि हम यहाँ का उपयोग उत्तेजना क्षेत्रों के बीच ~ 175 माइक्रोन के एक गैर प्रबुद्ध क्षेत्र उपलब्ध कराने, 125 माइक्रोन ऑप्टिकल फाइबर 300 माइक्रोन के एक केंद्र के लिए केंद्र की दूरी पर अलग की एक जोड़ी का उपयोग करता है। यह एक 80 माइक्रोन छोटी बूंद एक समय में केवल एक प्रकाश स्रोत से उत्साहित किया जा करने के लिए अनुमति देता है और यह सुनिश्चित करता है कि एक नक़ल में चोटियों में से प्रत्येक के लिए पूरी तरह लेजर उत्तेजना का एक प्रकार का एक परिणाम है। डिजाइन जहां उत्तेजना क्षेत्रों के बीच अलगाव छोटी बूंद व्यास के समान है उत्सर्जन चोटी दोहरी ओवरलैपिंग के साथ समस्याग्रस्त संकेत दे। टीवह एक संकेत नक़ल समय है कि यह एक छोटी बूंद के अग्रणी धार के लिए लेता अंतिम उत्तेजना क्षेत्र में ~ 500 माइक्रोन की दूरी छोड़ने के लिए छोटी बूंद के अनुगामी किनारे समय के लिए पहली उत्तेजना क्षेत्रों में प्रवेश करने के लिए इसे संबद्ध की चौड़ाई डिवाइस हम वर्णन है। आदेश आसन्न पता लगाया बूंदों की स्पष्टता बनाए रखने के लिए, संकेत दोहरी संकेत नक़ल के रूप में कम से कम के रूप में व्यापक एक कम संकेत क्षेत्र के अंतराल पर होना करने के लिए की जरूरत है। विन्यास यहाँ वर्णित के लिए, 80 माइक्रोन बूंदों के अलावा कम से कम 1 मिमी स्थान दिया गया है।

हालांकि एक भी photodetector के साथ बहु रंग का पता लगाने लागत और जटिलता मानक तकनीक की तुलना के संदर्भ में महत्वपूर्ण बचत के लिए अनुमति देता है, वहाँ मजबूती के कुछ नुकसान है, क्योंकि उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य द्वारा फ़िल्टर नहीं है। इस समस्याग्रस्त जब बूंदों कि कई fluorophores है कि एक ही तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजित होते हैं, का पता लगाने, क्योंकि प्रतिदीप्ति स्रोत अप्रभेद्य है हो सकता है। इन सीमाओं overc हो सकता हैome nonoverlapping उत्तेजना प्रोफाइल के साथ प्रयोगों प्रदर्शन करके, या प्रयोगों जहां पर खून बहाना स्पेक्ट्रल एक "चैनल" जहां एक संवेदनशील परख प्रदर्शन किया जा रहा है में उत्पन्न नहीं होती डिजाइन द्वारा। यह कई छोटी बूंद microfluidic आवेदनों का पता लगाने, जहां एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि डाई एक छोटी बूंद की उपस्थिति का संकेत करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है के साथ संगत है, और एक दूसरे fluorophore एक आणविक जीव विज्ञान परख 10,11 का नतीजा रिपोर्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

1) स्थानिक पंजीकृत उत्तेजना क्षेत्रों जटिल प्रकाश छानने के लिए समाप्त करने की जरूरत है, और 2) फाइबर ऑप्टिक्स का उपयोग एक माइक्रोस्कोप और प्रत्यक्ष प्रकाश के लिए ऑप्टिकल हार्डवेयर के लिए की जरूरत है निकालता है: मानक तकनीक की तुलना में हमारे दृष्टिकोण के दो मुख्य फायदे हैं। क्योंकि हम microfluidic का पता लगाने प्रणालियों के साथ आम तकनीकी चिंताओं को दूर, पिछले जांचकर्ताओं इसी तरह की चिंताओं का समाधान करने के तरीके विकसित किया है। उदाहरण के लिए, मार्टिनी एट अल। आवृत्ति सांकेतिक शब्दों में बदलना बहुरंगा प्रतिदीप्ति दर्ज कीविशिष्ट रूप से नमूनों "बार कोड" के माध्यम से एक उत्तेजना स्रोत पेश द्वारा एक भी डिटेक्टर से 12 फिल्टर। एक ऑप्टिकल फाइबर सरणी के हमारे इस्तेमाल मानक का उपयोग कर एक समान अस्थायी एन्कोडिंग योजना के उपयोग, बंद शेल्फ घटकों की अनुमति देता है। साहित्य ऑप्टिकल कई ऑप्टिकल युग्मन तकनीक है कि साधारण फाइबर प्रविष्टि कि हम वर्णन अधिक नियंत्रित कर रहे हैं कि पता चलता है। परमानंद एट अल। विशिष्ट microchannel स्थानों 13, मार्टिनेज Vasquez एट अल से सावधानी से नियंत्रित वितरण और प्रकाश के संग्रह के लिए तरल भरा ऑप्टिकल लहर गाइड का उपयोग करें। का उपयोग waveguides लेजर उत्तेजना प्रकाश 14, और Vishnubhatla एट अल वितरित करने के लिए सिलिका substrates जुड़े हुए में etched। रहे हैं ठीक फाइबर प्रविष्टि लेजर विकिरण और रासायनिक नक़्क़ाशी 15 के संयोजन का उपयोग चैनलों निर्माण करने में सक्षम। इन तकनीकों में से प्रत्येक एक microfl के आधार fluidic वास्तुकला के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों से परे अतिरिक्त चरणों की आवश्यकताuidic चिप। इन निर्माण प्रक्रियाओं अत्यधिक संवेदनशील आवेदनों का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है, हमने पाया है कि एक ढाला PDMS चैनल में फाइबर प्रविष्टि हमारी प्रयोगशाला में हर रोज अनुप्रयोगों के अधिकांश के लिए पर्याप्त है। पहचान प्रणाली 80 माइक्रोन बूंदों में 100 बजे तक नीचे FITC सांद्रता का पता लगाने के, मोटे तौर पर 17,000 ~ fluorophore अणुओं का पता लगाने के बराबर में सक्षम था। इस संवेदनशीलता हमारी प्रयोगशाला में सबसे अधिक आवेदनों का पता लगाने वर्तमान में एक epifluorescence आधारित प्रणाली, पीसीआर सक्रिय परख सकारात्मक 10 6 fluorophore अणुओं 11 के बराबर युक्त बूंदों के सेल छँटाई की जा रही है जिसमें से सबसे आम उपयोग करने के लिए पर्याप्त है। संवेदनशीलता का पता लगाने में भी तुलना हाल ही में अन्य ऑप्टिकल फाइबर आधारित सिस्टम की संवेदनशीलता की सूचना दी कृपापूर्वक के लिए - उदाहरण के लिए, यह एलेक्सा स्त्राव 488 में से 20 एनएम का पता लगाने सीमा> 100 माइक्रोन बूंदों 7 में रिपोर्ट से 200x अधिक संवेदनशील है।

डब्ल्यूई, और अधिक महंगा जटिल है, और भारी epifluorescence माइक्रोस्कोप आधारित प्रणाली के लिए एक विकल्प के रूप में एक कॉम्पैक्ट और मॉड्यूलर छोटी बूंद microfluidic बहु रंग का पता लगाने योजना पेश की है। यहां इस्तेमाल आवश्यक पता लगाने के घटकों (लेजर, फाइबर, फाइबर एडेप्टर, फिल्टर, और पीएमटी) <10,000 $ के लिए खरीदा जा सकता है, कई स्टेशनों का पता लगाने वहन करने में बहु रंग छोटी बूंद का पता लगाने के जांचकर्ताओं की एक बड़ी संख्या के लिए सुलभ बना रही है, और अनुमति व्यक्ति जांचकर्ताओं एक प्रयोगशाला में। प्रणाली के रूप में भी अपनेपन का एक डिग्री एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन के रूप में मुक्त अंतरिक्ष ऑप्टिकल प्रणालियों के लिए पंक्ति में आवश्यक है, प्रवेश के लिए कुछ विशेषज्ञता के आधार पर बाधाओं को दूर। इसके अतिरिक्त पता लगाने की स्थापना के छोटे पदचिह्न यह आदर्श पोर्टेबल और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 111 छोटी बूंद microfluidics प्रतिदीप्ति का पता लगाने फाइबर ऑप्टिक्स बहुरंगा प्रवाह cytometry बहुपरत लिथोग्राफी
बूंद Microfluidics के लिए बहुरंगा प्रतिदीप्ति पता लगाने ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग
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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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