Abstract
Endotelceller (ECS) foring blodkarvæggene in vivo er konstant udsat for strømme, men dyrkede EC'er dyrkes ofte under statiske betingelser og udviser en pro-inflammatorisk fænotype. Selv om udviklingen af mikrofluidenheder er blevet omfavnet af ingeniører over to årtier, deres biologiske anvendelser forbliver begrænset. En mere fysiologisk relevant in vitro mikrokar model valideret af biologiske anvendelser er vigtigt at fremme feltet og bro mellem in vivo og in vitro-undersøgelser. Her præsenteres detaljerede procedurer for udvikling af dyrkede mikrokar netværk ved hjælp af en mikrofluidanordning med en langsigtet perfusion kapacitet. Vi demonstrerer også anvendelse heraf på kvantitative målinger af agonist-inducerede ændringer i EF [Ca2 +] i og nitrogenoxid (NO) produktion i realtid ved hjælp konfokal og konventionel fluorescensmikroskopi. Det dannede mikrokar nettoarbejde med kontinuerlig perfusion viste veludviklede forbindelser mellem EC'er. VE-cadherin distributionen var tættere på, der blev observeret i intakte mikrokar end statisk dyrkede EF monolag. ATP-induceret forbigående stigninger i EF [Ca 2+] i og NO produktionen blev kvantitativt målt på individuelle celle niveauer, som er valideret funktionaliteten af dyrkede mikrokar. Denne mikrofluidapparat tillader EC'er til at vokse under en velkontrolleret, fysiologisk relevant flow, hvilket gør celledyrkningsmiljøet tættere på in vivo end i de konventionelle, statiske 2D kulturer. Den mikrokanalplade netværk design er meget alsidig, og fremstillingsprocessen er enkel og gentagelig. Enheden kan nemt integreres til konfokal eller konventionel mikroskopisk system, der gør det muligt i høj opløsning billeddannelse. Vigtigst er det, fordi den dyrkede mikrokar netværk kan dannes ved primære humane EC'er vil denne fremgangsmåde fungere som et nyttigt værktøj til at undersøge, hvordanpatologisk ændrede blodkomponenter fra patientprøver påvirker menneskelige EC'er og give indsigt i kliniske problemstillinger. Det kan også blive udviklet som en platform for screening stof.
Introduction
Endotelceller (ECS) foring blodkarvæggene in vivo er konstant udsat for strømme, men dyrkede EC'er dyrkes ofte under statiske betingelser og udviser en pro-inflammatorisk fænotype 1,2. Den mikrofluidik teknologi muliggør en præcist styret væske gennem et geometrisk hæmmet mikroskala (sub-millimeter) kanaler 3, som giver mulighed for dyrkede celler, især for vaskulær EC'er, til at vokse under de ønskede flow. Disse funktioner gør de celledyrkningsbetingelser tættere på in vivo end de konventionelle, statiske 2D cellekulturer. De er ekstremt vigtigt, når de mikrofluidenheder anvendes til at modellere forskellige typer vaskulaturerne og studere EF reaktioner på mekaniske og / eller kemiske stimulationer.
Til trods for fordelene viser sig ved en mikrokanalplade netværk via en statisk cellekultur, tilpasning og anvendelse af mikrofluidik i biomedicinske field forbliver begrænset. Rapporteret af en nylig gennemgang, de fleste af de publikationer dette område (85%) er stadig i tekniske tidsskrifter 4. Udførelsen af mikrofluidenheder har ikke været overbevisende nok for de fleste biologer at skifte fra nuværende teknikker såsom Transwell assay og makro-skala kultur fad / objektglas til dette miniaturiseret enhed. Microfluidics er et tværfagligt felt, der kræver tværfaglige samarbejder for at flytte dette felt fremad. Formålet med denne tekniske artikel er at mindske forskellene viden mellem discipliner og gøre fabrikation procedurer forståelig biologer, men samtidig give biologisk ansøgning og funktionel validering af mikrofluide mikrokar. De visualiseret forsøgsprotokoller omfatter fabrikation af både mikrofluidenheder og deres biologiske forsyningsselskaber, der repræsenterer et tæt samarbejde mellem ingeniører og biologer.
Vi har for nylig rapporteret noglebiologiske applikationer ved hjælp af in vitro-mikrokar netværk med mikrofluidapparat 5. For på passende designe dimensionerne af mikrokanalplade nettet og anvende den ønskede forskydningsspænding blev en numerisk model bygget med CFD software til nøje estimere strømningsprofil. Primære humane navleveneendotelceller (HUVEC'er), der blev podet i mikrokanalerne nåede konfluens, dvs. dækkede hele indre overflader af mikrokanal, i 3-4 dage med kontinuerlig perfusion. Den korrekte barriere-dannelse blev påvist ved VE-cadherin-farvning og sammenlignet med de, der dannes under statiske celle dyrkningsbetingelser og i intakte mikrokar. Ved at anvende de eksperimentelle protokoller udviklet i individuelt perfunderede intakte mikrokar 6-8, vi kvantitativt målt ændringerne i EF [Ca2 +] i og nitrogenoxid (NO) produktion til adenosintriphosphat (ATP) med fluorescerende inindikatorerne og konfokal og konventionel fluorescens mikroskopi. Agonist-inducerede stigninger i EF [Ca2 +] i og NO-produktion er blevet rapporteret som nødvendige intracellulære signaler for inflammatoriske mediator-inducerede stigninger i mikrokardannelse permeabilitet 6-15. Selv om nogle tidligere undersøgelser viste billeder af DAF-2 DA indlæst mikrofluidenheder 16,17, havde passende opløsning og dataanalyse endnu ikke opnået 18. Så vidt vi ved, denne undersøgelse viser de første kvantitative målinger af agonistinduceret dynamisk ændring i endothelial [Ca2 +] i og NO-produktion under anvendelse mikrofluidsystem baseret system.
Mikrofabrikation teknikker har fleksibilitet til at fabrikere mikrokanaler ned til nogle få mikrometer og muliggøre udviklingen af komplekse mønstre til at efterligne de geometrier af in vivo mikrovaskulatur. Her præsenterede vi et typisk mikrokanalplade netværk med tre niveauer af forgrening. Dennenetværk fremstilles ved kombinationen af fotolitografi, som udføres i en mikrofabrikation renrum og blød litografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrofluidapparat Fabrication
- Standard Fotolitografi Fabrication af en SU-8 50 Master Mold
- Rengør siliciumskiven før spin-coating. Skyl en bare 2 tommer siliciumwafer med acetone i 15 minutter efterfulgt af isopropylalkohol (IPA) i 15 min. Dehydrere wafer ved at placere den på en varmeplade ved 150 ° C i 1 time. Efter dehydrering, afkøles waferen ved stuetemperatur.
- Spin-coat siliciumskiven med SU-8 fotoresist. Tilsæt 2 ml SU-8 fotoresist på skiven. Rampe skiven til 500 rpm ved 100 rpm / sek acceleration i 10 sek, efterfulgt af 1.000 rpm ved 300 rpm / sek acceleration i 30 sek. (Se Supplemental Video 1)
- Pre-bage skiven på en varmeplade ved 65 ° C i 10 minutter, derefter blød bages ved 95 ° C i 30 minutter.
- Brug UV-eksponering til at transformere designet mønster fra en film maske til spin-coated fotoresist. Udskriv mønster på en tynd transparent film som en film maske. Placer filmen maske oven påspin-coated fotoresist og udsættes for UV med en dosis på 300 mJ / cm2. (Se Supplemental Video 2)
Bemærk: I denne protokol, mikrokanalplade netværk mønster (159 um brede mor kanaler forgrening i fire 100 um brede datter kanaler) er designet med CAD-software. Mønstret på filmen viser som en klar felt og resten af filmen er dækket af sort blæk. Fordi SU-8 er en negativ fotoresist, vil den del af fotoresist der udsættes for UV-tværbindes og bliver uopløselig til opløsningsmidlet under støber udvikling (trin 1.1.6). Efter udviklingen, vil dette uopløselige del replikere designet net mønster og tjener som en master støbeform. - Post-bage den blotlagte wafer på en varmeplade ved 65 ° C i 1 minut, derefter 95 ° C i 10 min.
- Udvikle master mug. Brug SU-8 developer som opløsningsmidlet for at fjerne det ikke-tværbundet fotoresist. Fordyb wafer i SU-8 developer i 3 min og skyl med IPAi 1 min.
- Gentag denne udvikling cyklus 2-3 gange, indtil der ikke er nogen hvide stribe formation (rest af ikke-hærdede fotoresist) efter IPA skylning. Forsigtigt tørre wafer med nitrogengas og undersøge de små elementer i mønsteret under et mikroskop. Gentag yderligere udvikle cykler, hvis nødvendigt.
- Hard bage skiven på en varmeplade ved 150 ° C i 15 min.
- Soft Litografi
- Manuelt blande de to dele (basis og hærder) af polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer på en vægt. forhold på 10: 1.
- De-gas PDMS blanding med en ekssikkator forbundet med en husvakuum i 15 minutter. Kast PDMS løsning på fotoresist mester skimmel. Tykkelsen af PDMS skal være flere end 3 mm for at tilvejebringe en stabil fastholdelse af indløb / udløb slange. De-gas PDMS igen i 15 min, og fjerne de resterende luftbobler med nitrogen gas, hvis nødvendigt. Helbrede de afgivne PDMS i en ovn ved 65 ° C i 3 timer.
- Rengør overfladen afden dækglas med en tape og et plasma renere (30 sek plasmabehandling). Spin-coat un-cured PDMS (0,5 ml) på dækglas ved ramping til 4.000 rpm ved 500 omdrejninger / sek acceleration i 30 sek. Hærde PDMS spin-coatede dækglas i en ovn ved 65 ° C i mindst 30 min.
- Klip og frigive de hærdede PDMS fra master mug. Derefter oprette et indløb og et udløb med en 1 mm diameter hul Puncher ved den distale ende af moderen kanaler.
- Obligation enheden til PDMS spin-belagt dækglas. Oxidere overfladerne af PDMS og dækglasset med et plasma renere for 1 min. Efter oxygenplasmabehandling, placere en dråbe deioniseret vand (DI vand) ved limning overflade, og placere de to dele sammen. Bag indretningen i en ovn ved 65 ° C i 30 minutter for at opnå en permanent binding.
Supplerende Video 1 (Højreklik for at downloade).
Supplerende Video 2 (Højreklik for at downloade).
2. Endothelial Cell Seedning og Kultur
- Device Sterilisation og fibronectincoating
- Bevare den hydrofobe egenskab af PDMS overfladen omkring indløb / udløb mod oxidation. Dæk PDMS overfladen omkring indløb og udløb med små striber af tape for at forhindre oxidation. Denne procedure kan forhindre DI vand i at sprede sig over hele den øvre overflade af indretningen under fyldningstrinnet (2.1.3).
- Behandl PDMS enhed med oxygenplasma for 5 min for at ændre overfladen at være hydrofil, således lette fluidstrømning gennem mikrokanalen og forhindre boblen indfangning i fyldet procedure (2.1.3).
- Brug enten en sprøjte med en nål eller en pipette til at fylde enheden med DI vand fra indløbet. Fortsæt fyldet, indtil der er en dråbe deioniseret vand (30-50 pi) akkumuleret ved udløbet. Undersøg enheden under et mikroskop for at kontrollere, om der bobler fanget inde i mikrokanalplade. Fjern den overdrevne vanddråbe ved ind- og udløb med en papirserviet.
- Sterilisere enheden i en petriskål med UV i minimum 3 timer i en laminar biosikkerhed hætte. For at forhindre fordampning, dække indløb / udløb med et tyndt stykke PDMS, sætte et vådt papir væv inde i fadet, og pak fadet med Parafilm.
- Coat enheden med fibronectin. Skyl enheden først med phosphatbufret saltvand (PBS), derpå belægge den med 100 ug / ml fibronectin natten over i køleskab (4 ° C). Placer en dråbe løsning ved indløbet, og derefter skaber undertryk ved udløbet med et hus vakuum, en sprøjte med en nål eller en pipette.
- Fyld enhed med cellekulturmedier. Skyl anordningen med PBS manuelt i 3 gange før ilægning cellekulturmediet. Varm op enheden i en inkubator ved 37 ° C.
- EC'er Seeding og Langsigtet Perfusion
Bemærk: Sammenligning med konventionel statisk 2D EF kultur, in vitro mikrokar netværksmodel med kontinuerlig perfusion gjort celledyrkningsmiljøet tættere på in vivo betingelser. In vitro mikrokar netværk demonstreret i denne protokol kan opretholdes i op til to uger. Den velkontrollerede perfusion vil løbende genopbygge næringsstoffer, fjerne affald og forhindre over-sammenløbet af EF monolag. Derfor kan det udvides til en længere sigt undersøgelser, efterligne den cellulære og hæmodynamisk miljø under forskellige Physiological og patologiske tilstande.- Bland primære HUVEC'er i HUVEC dyrkningsmedier (MCDB 131) med 8% dextran (molvægt 70.000). Dextranen anvendes til at forøge viskositeten af læsningen medier og opnå en bedre cellepodning resultat. Den anbefalede celletæthed er ca. 2-4 x 10 6 celler / ml.
- Frø cellerne i enheden. Placer en 10-20 pi dråbe af celler over fjorden. Indføre en blid strøm ved enten at vippe enheden eller kapillært handling ved hjælp et glas Pasteur pipette ved udløbet. Nøglen til en vellykket celle loading er at styre strømningshastigheden under 1 mm / sek inden de mindste kanaler.
- Kontroller cellepodning. Efter den indledende podning inkuberes anordningen for 15-20 min (befugtet atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C) før kontrol seeding status under mikroskopet. Hvis det er nødvendigt, udføre yderligere celle loading at opnå en ønsket celledensitet.
- skylles forsigtigt indretningen med celledyrkningsmedium (37° C) til fjernelse af dextran. Kultur indretningen i fravær af flow for de første 6 timer i en inkubator (5% CO2 ved 37 ° C).
- Opsætning af slangeforbindelse for langsigtet perfusion. Tape enheden i en petriskål for at forhindre bevægelse. Opret små huller på låget af petriskålen for ind- og udløb slanger indrykninger. Tilslut indløbsrøret til en sprøjte med en nål til celledyrkningsmediet perfusion. Tilslut slangen udløbet til en indsamler.
Bemærk: Placer enheden og indsamler i en cellekultur inkubator, mens placere en perfusion pumpe uden for inkubatoren og forbinde det med enheden af den lange fjord slange. Perfusionshastigheden er bestemt af det eksperimentelle design. I det foreliggende skal der anvendes perfusion på 0,35 pl / min og en forskydningsspænding på mellem 1-2 dyn / cm2. Under denne perfusion tilstand, HUVEC'er nå sammenløb i omkring 3-4 dage.
3. Immunofluorescent Farvning
- Fastgør EC'er i indretningen ved perfusion af 2% paraformaldehyd i 30 min ved 4 ° C efterfulgt af 1x PBS skylning ved stuetemperatur i 15 min, og 1% BSA blokering i 30 min. Brug en perfusion hastighed, som er den samme som den, der anvendes til celledyrkning.
- Permeabilisere faste EC'er for antistof farvning med 0,1% Triton X-100. Perfundere enheden med Triton for 5-7 min at etiketten VE-cadherin, og 3 min til label F-actin.
- Indlæse antistofferne i enheden. Perfundere enheden med 1x PBS i 15 minutter for at udvaske de tidligere løsninger. Manuelt indlæse det primære antistof mod VE-cadherin (anti-ged) i indretningen i en koncentration på 2 ug / ml (det samlede volumen er 20-50 pi). Hold enheden i et køleskab ved 4 ° C natten over. Perfundere det sekundære antistof (æsel-anti-ged) af en sprøjtepumpe i en koncentration på 7 mg / ml i 45-60 min.
- Label EF F-actin med phalloidin. Perfundere enheden med 1x PBS for 15 min før manuelt indlæser phalloidin (10 ug / ml) i 7-10 min.
- Label EF kerner (se Materialer List).
- Skyl anordningen med 1x PBS, og fastholde den ved 4 ° C indtil billeddannelse.
4. Fluorescens Imaging of endotel [Ca2 +] i
- Perfundere enheden med albumin (10 mg / ml) -Ringer opløsning i 15 minutter ved 37 ° C. Brug samme perfusionshastigheden som anvendt til celledyrkning. Koncentrationerne af alle komponenter af albumin-Ringers opløsning, er beskrevet i List Materials.
- Opsætning konfokal system til EF [Ca 2+] i billeddannelse med fluo-04:00. Brug et konfokalt mikroskopisk system til Ca2 + billeddannelse. Brug en argon laser (488 nm) for excitation og sætte udledningen bandet som 510-530 nm. Saml de billeder med en 25X objektiv (nedsænkning i vand, NA: 0,95) på 512 x 512 scan format. Brug en z-trin med 2 um og en scanning interval for hver stabel af imagikere på 20 sek.
- Perfundere indretningen med fluo-4 AM (5 uM) i 40 minutter ved 37 ° C, vask derefter ud lumen fluo-4 am med albumin-Ringers opløsning.
- Erhverve billeder af fluo-4 indlæst mikrokar. Saml de baseline billeder i 10 min. Perfundere enheden med ATP (10 uM) og registrere ændringerne i fluorescensintensitet (FI) i 20 min.
5. Fluorescens Imaging af nitrogenoxid Production
- Perfundere indretningen med albumin-Ringers opløsning i 15 minutter. Brug en perfusion hastighed, som er den samme som den, der anvendes til celledyrkning.
- Opsætte fluorescensimagografi system til at måle ATP-induceret nitrogenoxid produktion. Brug et mikroskop udstyret med en 12-bit digital CCD-kamera og en computer-kontrolleret lukker for nitrogenoxid måling. Brug en 75 W xenonlampe som lyskilde.
Bemærk: Vælg excitation og emission bølgelængde for DAF-2 DA af en interferens filter (480/40 nm) og et dikroisk spejl(505 nm) med et band-pass barriere (535/50 nm). Brug en 20X objektiv linse (NA: 0,75) for at opsamle billederne. For at minimere fotoblegning, placere et filter med neutral tæthed (0,5 N) foran interferens filter og begrænse eksponeringen tid til 0,12 sek. - Læg cellerne med DAF-2 DA (5 uM). Perfundere enheden med DAF-2 DA i ca. 35-40 minutter ved 37 ° C. Optag baseline af DAF-2 fluorescensintensitet (FI DAF) efter den første læsning.
Bemærk: DAF-2 DA er kontinuerligt til stede i perfusatet hele eksperimentet 7. - Saml DAF-2 billeder. Optag baseline af FI DAF i 5 min. Perfundere enheden med ATP (10 uM) og indsamle billeder i 30 min med 1 min intervaller. Saml alle billederne fra den samme gruppe af celler på samme brændplan.
6. Data Analysis
- Vælg manuelt regionen interesser (ROI'er) fra de indsamlede billeder på enkelte celle niveau. HverROI dækker arealet af en enkelt celle, som kan være angivet ved fluorescens omrids.
- Træk baggrund fluorescens og beregne middelværdien FI af hver ROI'er.
- Mål ATP-inducerede ændringer i EF [Ca2 +] i og NO-produktion. Kvantificere ATP-inducerede ændringer i EF [Ca2 +] i ved at beregne ændringer i Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, hvor FI 0 er den gennemsnitlige basislinie FI under albumin-Ringer perfusion før tilsætning ATP) minus den målte baggrund. Kvantificere NO produktionshastigheden ved at gennemføre den første forskellen konvertering af FI DAF over tid.
Bemærk: Tidsforløbet for FI DAF repræsenterer en kumulativ NO-produktion med tiden. Derfor er nogen produktion, der er beregnet på grundlag af profilen af FI DAF under både basal og ATP stimulerede betingelser. Detaljer for dataanalyse og eksperimentelle procedurer er blevet beskrevet i en tidligere publikation 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit viser nogle af de opnåede resultater med det dyrkede mikrokar netværk udviklet med denne protokol. Mikrokanalplade mønster er en tre-niveau forgrening netværk (figur 1A). I dette design, en 159 um brede mor kanal grene i to 126 um brede kanaler, og filialer igen i fire 100 um brede datter kanaler. En 3D numerisk simulering blev udført for at estimere forskydningsspændingen distributioner under strømningshastighed på 0,35 pl / min (figur 1B), som angiver tre forskellige niveauer af forskydningsspænding under denne mikrokanal netværk. Den laminare strømning inden mikrokanalerne forventes at være hydrodynamisk stabil uden tilstedeværelsen af forstyrret eller sekundær strømning. Efter en SU-8 mester Formen blev fremstillet med en standard fotolitografisk proces (figur 1C), blev en PDMS anordning fremstillet gennem blødt litografi at replikere mikrokanalplade network design i en gennemsigtig, luft gennemtrængelige stillads (Figur 1D - E). Efter EF podning (figur 1F - G) og 3-4 dages kontinuerlig perfusion, EC'er nåede konfluens og med succes dækket de indre overflader af mikrokanalerne.
EF F-actin og kerner blev fluorescens-mærket inden for netværket og illustreret med konfokal billeder. Under forskydningsspænding på 1,0 dyn / cm2, ca. 30% af HUVEC'er langstrakt langs strømningsretningen med øgede centrale stress fibre, mens resten 70% fastholdt sin brosten mønster med dominerede perifere F-actin 5. Det shear-induceret celle formændring synes mindre fremtrædende end almindeligt observeret i 2D statisk cellekulturer. Faktisk under in vivo betingelser, ECS har forskellige celle figurer i forskellige typer af fartøjer, men ikke nemt ændre celleform som reaktion på strømmen changes. Flere undersøgelser er nødvendige for at fastslå, om denne forskel var resultaterne af kanalens geometri og perfusion miljø, der er tættere på in vivo betingelser.
Vi har også med succes målt ATP-inducerede ændringer i EF [Ca 2+] i og ingen produktion (figur 4 og 5). ATP inducerede forbigående stigninger i EF [Ca 2+] i og ingen produktion. Den gennemsnitlige maksimale FI fluo-4 var 187 ± 22% af baseline, som fandt sted ved 35 ± 10 sek efter start af ATP perfusion. NO-produktionen blev forøget fra et basalt niveau på 0,15 ± 0,05 AU pr min til 1,18 ± 0,37 AU pr min inden for de første fem minutter af ATP-eksponering. Alle resultaterne blev rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse (SE). De er sammenlignelige med de resultater, der er afledt af individuelt perfunderet intakte venuler 6,9,14,19.
Figur 1: mikrofluidanordning Fabrikation og EF loading (A) skematisk billede af mikrokanalplade netværk.. Bredden og bifurkation vinkel mikrokanalerne er angivet ved hver forgrening niveauer. (B) Den numeriske simulering af forskydningsspænding distribution. Strømningshastigheden er 0,35 pl / min. Højden af mikrokanalplade efter udvikling er 80 um. Disse to tal er blevet ændret fra tidligere publikation med yderligere detaljer 5. (C) Udviklingen af master mug. Føreren støber af mikrokanalplade netværket er fremstillet med SU-8 photoresist på silicium wafer. (D) Processen med bløde litografi. PDMS blanding støbes på master mug og hærdes i en ovn. (E) Bonding PDMS kanal til substratet. Det anvendte substrat for denne enhed er et dækglas spin belagt med et tyndt lag af PDMS. Den ind- og udløb er skabt med et hul-puncher. (F og G), EF belastning. Ca. 10 pi celle opløsning anbringes ved indløbet. En blid strøm derefter fremkaldes ved at placere en Pasteur-pipette ved udløbet via kapillær flow. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Konfokal billeder af EF F-actin i dyrkede mikrokanal netværk (A) En skematisk afbildning af nettet design.. De udvalgte regioner er vist i B - D er angivet i grafen. (B - D) Konfokal billeder af EF F-actin (rød) og kerner (blå) af in vitro mikrokar netværk B 1. C 1 og D 1 er de projicerede billeder fra øverste halvdel af mikrokanalplade billedstakke, og B 2, C 2 og D 2 er billedet fremskrivninger fra nederste halvdel af billedet stakke. E. tværsnit angivet som 1-1 ', 2-2', og 3-3 'i B 1 - D 1, Scale bar = 100 um. Disse billeder er tilpasset fra tidligere publikation 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af VE-cadherin fordeling i dyrkede mikrokar netværk med statisk dyrket EF monolag og intakt rotte mesenteriske venulen (.
Figur 4: ATP-inducerede stigninger i EF [Ca2 + p>] i. Forsøg blev gennemført fra 4 enheder og 7 til 12 ROI'er (individuelle ECS) pr enhed blev udvalgt til analyse af data. (A) Tidsforløbet for ATP (10 uM) -induceret ændringer i EF [Ca2 +] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) fra et repræsentativt eksperiment. (B) Billederne af den repræsentativt forsøg (data er vist i A). Dette er en tidligere publiceret figur 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ATP-induceret NO produktion Eksperimenter blev udført i 3 enheder og 11 til 12 ROI'er (individuelle ECS) pr enhed blev udvalgt til analyse af data.. (A DAF ± SE, venstre Y-aksen) i EC'er under basale betingelser og efter udsættelse for ATP. NO-produktionshastighed (df / dt, stiplet linje), blev afledt fra den første forskellen omdannelse af akkumulerede FI DAF (højre Y-akse). (B) Repræsentative billeder fra et eksperiment. FI DAF forøges yderligere efter en NO-donor, natriumnitroprussid (SNP), blev tilsat til perfusatet, hvilket indikerer en tilstrækkelig mængde af intracellulær DAF-2 til at reagere med NO. Dette er en tidligere publiceret figur 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi detaljerede protokoller for udviklingen af dyrkede mikrokar netværk, karakterisering af EF kryds og cytoskelettet F-actin distribution og de kvantitative målinger af EF [Ca 2+] i og NO produktion ved hjælp af en mikrofluidapparat. Den perfunderede mikrofluidanordning angår en in vitro model, der tillader en tæt simulering af in vivo mikrovaskulære geometrier og forskydning strømningsforhold. Da den dyrkede mikrokar netværk kan dannes ved primære humane EC'er, kan denne tilgang tjene som et nyttigt redskab til at undersøge, hvor patologisk ændrede blodkomponenter fra patientprøver påvirker menneskelige EC'er ved direkte perfusion af patientens blodprøver til de dyrkede mikrokar og give indsigt i klinisk spørgsmål. De humane EC'er udviklede mikrokar kan også anvendes til lægemiddelscreening at undgå de potentielle uoverensstemmelser i drug reaktioner mellem humane og animalske væv.
ve_content "> Substratet af mikrofluidenheder vist i denne protokol er et glas dækglas (150-180 um) spin-belagt med et tyndt lag af PDMS. Dette tynde lag af PDMS er afgørende for høj opløsning og levende væv realtid billeddannelse, fordi de større numerisk åbning mål har sædvanligvis kort arbejdsafstand. den laminare strømning inden for mikrokanal (submillimeter interval) har en meget lav Reynolds tal, og trykforskellen er lineært relateret til strømningen, således forskydningsspændingen fordelingen er udelukkende afhænger på den kanal geometri. Derfor kan det godt kontrolleret af høj nøjagtighed perfusion pumpe 20. i vores foreliggende undersøgelse forskydningsspændingen påført på HUVEC dyrket mikrokar netværk var mellem 1 og 10 dyn / cm2, hvilket er inden for række forskydningsspænding målt i venøse system 21,22. de makro-strømningstekniske systemer såsom parallel strømningskammeret mangler komplekse strømningsmønstre. i større skala flow kamre (mm-cm range), ECS typisk kun dyrkes i den nederste overflade (2D monolag), mangler de geometriske ligheder til mikrokar in vivo. Når bredden af strømningskammeret er over 2 mm, er den homogene strømning indesluttet i en region, der er normalt flere millimeter væk fra udløbet / indløbet, og et par hundrede mikrometer væk fra sidevæggen 23. Når bredden af kammeret øges til den række af centimeter, vil strømningen differentiere til forskellige forenkler og de strømningshastigheder vil ændre sig over hele området 24. Derudover større målestok strømningskammeret forbruger mindst 100 gange mere perfusat for at opnå samme forskydningsspænding som i mikrokanaler. Forskydningsspændingen spredning i mikrokanalplade netværket kan simuleres ved hjælp af en numerisk modellering værktøj, og de stationære inkompressibel Navier-Stokes 'ligning kan løses ved de fleste finite element software.Den mikrovæskeanordning kan fremstilles med en enkee maske mikrofabrikation proces. Succesen med dyrkede mikrokar udvikling kræver imidlertid særlige opmærksomhed til detaljerne. Efter indlæsning opløsningen i mikrokanalerne, skal kontrolleres for boble fældefangst under mikroskop før EF såning hver enhed. Hvis der opstår en boble, er det stadig muligt at tvinge det ud i denne fase ved at påføre et hydraulisk tryk ved indløbet med et lukket udløb, som PDMS er et luftgennemtrængeligt materiale. At opretholde en ønsket perfusionshastigheden, er nødvendigt for alle af nålen / slangeforbindelser stramt uden en lækage. Den matchede hole-puncher og slanger størrelse er afgørende for at opnå en tætsluttende. For at sikre en præcis levering af strømningshastigheden, bør sprøjten på perfusion pumpen og indretningen placeres på samme niveau. For at ændre perfusatet, bør den indsatte slange forsigtigt afbrudt fra enheden for at undgå enhver strækning. For at øge forskydningsspænding, step stiger (såsom 10 trin af stigningen i 18 timer), er anbeded at undgå pludselige flow ændring forårsaget EF afskalning.
Tidligere undersøgelser udført på individuelt perfunderet intakte mikrokar indikerede, at agonist-induceret stigninger i EF [Ca2 +] i, og den efterfølgende endotel nitrogenoxidsyntase (eNOS) aktivering og NO-produktion er nødvendige signalering for øget mikrovaskulær permeabilitet under inflammatoriske tilstande 6,7 , 9-13,25. I denne protokol, vælger vi ATP som repræsentant agonist, da det er almindeligt udgivet af røde blodlegemer, aggregerede blodplader og tilskadekomne væv eller under inflammatoriske tilstande in vivo. En fluorescens calcium-indikator, Fluo-4 AM, blev anvendt til at måle ændringerne i endothelial [Ca2 +] i efter udsættelse for ATP. EF [Ca2 +] i responser i dyrkede mikrokar ligner dem fundet i intakte mikrokar 7,9. Måling EF NO produktion har været teknisk udfordrende for biologer.Til dato har der ikke været nogen fluorescerende indikator, der muliggør påvisning af dynamiske ændringer i NO-koncentration i en måde svarende til calcium indikatorer. DAF-2 DA har været meget anvendt til at vurdere NO-produktion. Men den korrekte brug, data fortolkning, og dataanalyse nødt til at trække brugernes opmærksomhed. Da den kemiske omdannelse af DAF-2 til DAF-2T i overværelse af NO er irreversibel (enkelt konvertering) 26, den påviste DAF fluorescensintensitet profil repræsenterer ikke ændringerne i NO-koncentration. I stedet indikerer det akkumulerede DAF-2T produktion med tiden. Baseret på dette kumulerede DAF-2-fluorescens (FI DAF) kurve, NO-produktionshastigheden (df / dt) kan afledes af den første differential omdannelse af FI DAF 7,11. Nemlig hældningen af FI kurven angiver NO produktionshastighed og plateaufasen angiver ingen yderligere forøget NO-produktion. Efter konverteringen, genererede data fra denne protokol presented både den basale NO produktionshastighed og ændringerne i NO produktionen i respons til ATP med tidsmæssig og rumlig opløsning på individuelle EF niveauer i mikrokar netværket.
Øjeblikket PDMS har været meget anvendt til mikrofluide applikationer, da det er en optisk transparent, ikke-toksiske, og gaspermeabelt blød elastomer 27-30. Men da PDMS ikke vandgennemtrængelig, kunne vi ikke direkte at måle permeabiliteten af EF monolag. For at overvinde denne begrænsning, nogle programmer ændret kanal væg strukturer såsom integrere en permeabel membran ind i kanalen 31, eller skabe en gennemtrængelige "vinduesåbninger" med mikro-stolperne eller mikroorganismer huller 32,33, mens andre er blevet fokuseret på ændring af enhedens materialer såsom hjælp af hydrogel enheder eller hydrogel / PDMS hybrid enheder 17,34-36. Ulemperne ved sådanne anordninger er deres sårbare natur at dehydrering og deres relativt svage mekaniske egenskaber til at stå stress eller tryk. Fremtidig udvikling af permeabelt materiale med mekanisk styrke vil yderligere forbedre enheden og dens potentiale for bredere biologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser eller modstridende interesser til at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute giver HL56237, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1.227.359 og EPS-1003907).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E.
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G.
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
![Udvikling og karakterisering af<em> In vitro</em> Mikrokar Netværk og kvantitative målinger af endothelial [Ca<sup> 2+</sup>]<sub> jeg</sub> Og nitrogenoxid Produktion](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/54014.jpg)
