Abstract
Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и проявляют провоспалительного фенотипа. Хотя развитие микрожидкостных устройств было охвачено инженерами в течение двух десятилетий, их биологические приложения остаются ограниченными. Более физиологически актуально в пробирке микрососудов модель подтверждено биологических применений имеет важное значение для продвижения поля и преодоления разрыва между в естественных условиях и в пробирке исследования. Здесь мы приводим подробные процедуры для развития культурной сети микрососудов с использованием микрожидкостных устройств с долгосрочной возможности перфузионной. Мы также продемонстрировать свои приложения для количественных измерений изменений агонист-индуцированного в ЕС я и оксид азота (NO) производства [2+] Ca в режиме реального времени с помощью конфокальной и обычной флуоресцентной микроскопии. Образовавшийся микрососудов нетторабота с непрерывной перфузии показали хорошо развитые перекрестки между КЧС. VE-кадгерина распределение был ближе к тому, что наблюдалось в интактных микрососудов, чем статически культивированных монослоев ЕС. АТФ-индуцированное кратковременное повышение в ЕС [Са 2+] и NO производства были количественно измерены на отдельных уровнях клеток, которые валидированных функциональность культивируемых микрососудов. Это устройство позволяет Микрожидкостных КЭ расти под хорошо контролируемым, физиологически соответствующего потока, что делает среда для культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем в обычных статичных 2D культур. Конструкция Микроканал сеть очень универсальна, а процесс изготовления прост и повторяемой. Устройство может быть легко интегрирован в конфокальной или обычной микроскопической системы, позволяющей с высоким разрешением изображения. Самое главное, потому что культивируют сеть микрососудов могут быть образованы первичными человеческими КЧС, этот подход будет служить полезным инструментом для исследования, какпатологически измененные компоненты крови из образцов пациентов влияют на человека ЭКС и обеспечить понимание клинических проблем. Она также может быть разработана в качестве платформы для скрининга лекарственных средств.
Introduction
Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и обладают провоспалительных фенотип 1,2. Технология микрофлюидики позволяет точно контролировать жидкость через геометрически ограниченных микромасштабная (суб-миллиметровом) каналов 3, что обеспечивает возможность для культивируемых клеток, особенно для сосудов КЧС, чтобы расти в желаемых условиях потока. Эти особенности делают условия культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем обычные статические 2D культур клеток. Они чрезвычайно важны, когда микрофлюидальные устройства используются для моделирования различных типов vasculatures и изучения реакции ЕС на механических и / или химических раздражений.
Несмотря на преимущества, которые показала сеть микроканалов над статической клеточной культуре, адаптации и применения микрофлюидики в биомедицинской FIELD остаются ограниченными. Об этом сообщает в недавнем обзоре, большинство публикаций этой области (85%) все еще находятся в инженерных журналах 4. Производительность микрофлюидальных устройств не было достаточно убедительным для большинства биологи, чтобы перейти от современных методов, таких как анализ Transwell и макромасштабной блюдо культуры / предметное стекло в этом миниатюрном устройстве. Микрофлюидикс представляет собой многопрофильную поля, которое требует междисциплинарного сотрудничества, чтобы переместить это поле вперед. Цель этой технической статьи состоит в том, чтобы уменьшить пробелы в знаниях между дисциплинами и сделать процедуры изготовления понятны биологи, обеспечивая при этом биологические приложения и функциональные проверки микрожидкостных микрососудов. Визуализированных экспериментальные протоколы включают изготовление обоих микрофлюидальных устройств и их биологических коммунальных услуг, что представляет собой тесное сотрудничество между инженерами и биологами.
Недавно мы сообщали некоторыебиологические приложения , использующие сети микрососудов в пробирке с микрожидком устройством 5. Для того, чтобы соответствующим образом спроектировать размеры сети микроканалов и вносящее желаемое напряжение сдвига, численная модель была построена с динамического переноса текучей среды программного обеспечения, чтобы внимательно оценить профиль потока. Первичные Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) , которые были посеяны в микроканалов достижения слияния, т.е. охватывает всю внутреннюю поверхности микроканала, в течение 3-4 дней с непрерывной перфузии. Правильное формирование барьера была продемонстрирована VE-кадгерина окрашивания и по сравнению с теми, образуются в статических условиях культивирования клеток и в интактных микрососудов. Применяя экспериментальные протоколы , разработанные в индивидуальном порядке увлажненную неповрежденных микрососудов 6-8, мы количественно измеряли изменения в EC [Ca 2+] и оксид азота (NO) производства в ответ на аденозинтрифосфата (АТФ) с люминесцентными вdicators и конфокальной и обычные флуоресцентной микроскопии. Агонист-индуцированный рост EC [Ca 2+] и NO производства были представлены как необходимые внутриклеточные сигналы при воспалительных медиаторов , вызванной увеличением проницаемости микрососудов 6-15. Хотя некоторые предыдущие исследования показали изображения DAF-2 DA нагруженных микрофлюидальных устройств 16,17, соответствующее разрешение и анализ данных еще не достиг 18. Насколько нам известно, это исследование демонстрирует первые количественные измерения агонист-индуцированного динамического изменения в эндотелиальной я и NO производства с использованием Микрожидкостных системы на основе [2+ Ca].
Методы микротехнологий гибкость изготовить микроканалы до нескольких микрон и позволяют разрабатывать сложные схемы , чтобы имитировать геометрии микрососудов в естественных условиях. Здесь мы представили типичную сеть микроканальных с тремя уровнями ветвления. ЭтаСеть изготавливается с помощью комбинации фотолитографии, которая выполняется в микроструктур и чистом помещении мягкой литографии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Микрожидкостных Изготовление устройств
- Стандартный фотолитографии фабрикации SU-8 50 Master Mold
- Очистите кремниевой пластины перед спин-покрытием. Промыть голую 2 дюйма кремниевой пластины с ацетоном в течение 15 мин, после чего изопропилового спирта (IPA) в течение 15 мин. Обезвоживают пластины, поместив ее на плитке при 150 ° С в течение 1 часа. После обезвоживания, охлаждения пластины при комнатной температуре.
- Спин-пальто кремниевой пластины с СУ-8 фоторезиста. Добавить 2 мл SU-8 фоторезиста на пластину. Рампа пластины до 500 оборотов в минуту при 100 оборотов в минуту / с ускорением в течение 10 сек, с последующим 1000 оборотов в минуту при 300 оборотов в минуту / с ускорением в течение 30 сек. (См Справочная видео 1)
- Предварительно выпекать пластины на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 10 мин, затем мягкой выпекать при температуре 95 ° С в течение 30 мин.
- Использование УФ-облучения, чтобы преобразовать разработанный образец от маски пленки к фоторезиста спин-покрытием. Печать рисунка на тонкой прозрачной пленки в качестве маски пленки. Поместите маску пленку поверхспин-покрытием фоторезиста и подвергать воздействию УФ - дозой 300 мДж / см 2. (См Дополнительный видео 2)
Примечание: В этом протоколе, шаблон Микроканал сети (159 мкм широкие маточные каналы разветвления на четыре 100 мкм шириной дочерних каналов) разработан с программным обеспечением CAD. Узор на пленке показан в виде прозрачного поля и остальная часть пленки покрыта черными чернилами. Поскольку СУ-8 является отрицательным фоторезиста, часть фоторезиста, который подвергается воздействию ультрафиолетового излучения будет сшитым и становятся нерастворимыми в растворителе в процессе разработки пресс-формы (этап 1.1.6). После разработки, эта нерастворима часть будет реплицировать разработанный шаблон сети и служит в качестве мастер-форму. - Пост-испечь открытой пластины на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 1 мин, затем 95 ° С в течение 10 мин.
- Разработка мастер-формы. Использование СУ-8 разработчик в качестве растворителя для удаления неразделанный сшиты фоторезиста. Погрузить вафельные в СУ-8 разработчика в течение 3 мин и смыть IPAв течение 1 мин.
- Повторите этот цикл 2-3 развивающихся раза до тех пор, пока нет белого образования полоса (остаток незатвердевший фоторезиста) после того, как полоскании МПА. Осторожно высушить облатку газообразным азотом и исследовать небольшие черты картины под микроскопом. Повторите дополнительные циклы развивающиеся при необходимости.
- Жесткий выпекать пластины на горячей плите при температуре 150 ° С в течение 15 мин.
- Мягкая литография
- Вручную смешать две части (основы и отвердителя) полидиметилсилоксана (PDMS) эластомера на вес. соотношении 10: 1.
- Де-газ смесь ПДМС с эксикаторе, связанной с вакуумом в течение 15 мин. В ролях решение PDMS на мастер фоторезиста формы. Толщина PDMS должна быть более 3 мм, чтобы обеспечить стабильное проведение впускные / выпускные трубки. Де-газ в PDMS снова в течение 15 мин, и удалить оставшиеся пузырьки воздуха с газообразным азотом при необходимости. Вылечить PDMS отлиты в печи при температуре 65 ° С в течение 3 ч.
- Очистите поверхностьстекло покровное с скотча и очистителя плазмы (30 сек для плазменной обработки). Спин-пальто не-вылечены PDMS (0,5 мл) на покровного стекла по наращивают до 4000 оборотов в минуту при скорости ускорения / сек 500 оборотов в минуту в течение 30 сек. Отверждение PDMS спин покрытием покровное в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение не менее 30 мин.
- Вырежьте и освободить вылеченные PDMS от мастера формы. Затем создают отверстие и выходное отверстие с отверстием диаметром перфоратор 1 мм на дистальном конце маточных каналов.
- Бонду устройство к PDMS спин-покрытием покровного стекла. Окислять поверхностей PDMS и покровное с очистителем плазмы в течение 1 мин. После плазменной обработки кислородом, поместите каплю деионизированной воды (ДИ воды) на поверхности склеивания, и поместить эти две части вместе. Выпекать устройство в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 30 мин для достижения постоянного соединения.
Справочная Видео 1 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Справочная Видео 2 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
2. эндотелиальные клетки Посевная и культуры
- Стерилизация устройства и фибронектина покрытие
- Сохранение гидрофобные свойства поверхности PDMS вокруг впускного / выпускного от окисления. Покройте поверхность PDMS вокруг входного и выходного с небольшими полосками скотча для предотвращения окисления. Эта процедура может предотвратить ДИ воды распространение по всей верхней поверхности устройства во время стадии наполнения (2.1.3).
- Рассматривать устройство PDMS с кислородом плазмы FoR 5 мин, чтобы изменить поверхность, чтобы быть гидрофильной, таким образом, облегчают поток текучей среды через микроканалов и предотвратить пузырь захвата в процессе наполнения (2.1.3).
- Используйте или шприц с иглой или пипетку, чтобы заполнить устройство с деионизированной водой из впускного канала. Продолжить заполнение до тех пор, пока не будет капелька дистиллированной воды (30-50 мкл), накопленных на выходе. Осмотрите устройство под микроскопом, чтобы проверить, есть ли пузырьки содержащихся внутри микроканала. Удалите излишнюю капли воды на входе и на выходе с бумажной салфеткой.
- Стерилизацию устройства в чашке Петри с УФ в течение минимум 3 часов в ламинарным укрытием биологической безопасности. Для предотвращения испарения, закрывайте входное / выходное отверстие с тонким куском PDMS, положить влажную бумажную салфетку в тарелку, и обернуть блюдо с парафильмом.
- Покройте устройство с фибронектина. Ополосните устройство сначала с фосфатным буфером (PBS), а затем покрыть его с 100 мкг / мл фибронектина в течение ночи в холодильнике (4 ° С). Поместите каплю раствора на входе, а затем создать отрицательное давление на выходе с вакуумом, шприц с иглой или пипеткой.
- Заполните устройство для культивирования клеток. Ополосните устройство с PBS вручную в течение 3-х раз перед загрузкой среды для культивирования клеток. Прогреть прибор в термостате при 37 ° С.
- КЭ Посевная и долгосрочный Перфузия
Примечание: По сравнению с обычной статической культурой 2D EC, в пробирке микрососудов сетевая модель с непрерывной перфузией из среды клеточной культуры ближе к условиям , в естественных условиях. В пробирке микрососудов сети продемонстрировали в этом протоколе может сохраняться до двух недель. Хорошо контролируется перфузия будет постоянно пополнять питательные вещества, удалять отходы, а также предотвращения чрезмерного слияния монослоя EC. Таким образом, он может быть продлен на более длительный срок исследований, имитируя клеточный и гемодинамического среды при различных physiologicaл и патологические состояния.- Смешайте первичные HUVECs в HUVEC культуральной среде (MCDB 131) с 8% декстран (мол вес 70 000). Декстран, используется для повышения вязкости загрузки носителя и достижения лучшего результата посева клеток. Рекомендуемая плотность клеток составляет около 2-4 × 10 6 клеток / мл.
- Семенной клеток в устройство. Поместите 10-20 мкл капельку клеток над входом в. Представьте нежный поток либо наклоняя устройство, или капиллярное действие с помощью стеклянной пипетки Пастера на выходе. Ключ для успешной загрузки ячейки, чтобы контролировать скорость потока менее 1 мм / сек в самых маленьких каналов.
- Проверьте высев клеток. После первоначального посева, инкубировать устройство в течение 15-20 мин (увлажненной атмосфере 5% СО 2 при 37 ° С) перед проверкой состояния высева под микроскопом. При необходимости выполнить дополнительные нагрузки сотовой ячейки для достижения желаемой плотности клеток.
- Осторожно промыть устройство с клеточной культуральной среды (37° С), чтобы удалить декстран. Культура устройство при отсутствии потока в течение первых 6 ч в инкубаторе (5% СО 2 при 37 ° С).
- Настройка соединения труб для долгосрочного перфузией. Лента устройство в чашку Петри, чтобы предотвратить движение. Создание небольших отверстий на крышке чашки Петри для подачи и отвода труб вставок. Подсоедините впускной трубки к шприцу с иглой для культивирования клеток перфузией. Подключите выпускной трубы к коллектору отходов.
Примечание: Поместите устройство и коллектор отходов в культуре клеток инкубатора, при размещении перфузионного насоса вне инкубатора и соединить его с устройством с помощью длинного впускного трубопровода. Скорость перфузии определяется экспериментальной конструкции. В данном устройстве используется скорость перфузии 0,35 мкл / мин и сдвига диапазона напряжений между 1-2 дин / см 2. В соответствии с этим перфузионной состоянии, HUVECs достигают впадения в 3-4 дней.
3. Яmmunofluorescent Окрашивание
- Закрепить КЧС в устройстве путем перфузии 2% параформальдегидом в течение 30 мин при 4 ° С с последующим полосканием 1x PBS при комнатной температуре в течение 15 мин и 1% БСА блокирующего в течение 30 мин. Используйте скорость перфузии, которая является такой же, как используемый для культивирования клеток.
- Проницаемыми неподвижную ECs для меченых антител с 0,1% тритона Х-100. Заливать устройство с Triton в течение 5-7 мин до этикетке VE-кадгерина, и 3 мин до этикеточной F-актина.
- Загрузка антител в устройство. Заливать устройство с 1x PBS в течение 15 минут, чтобы смыть предыдущие решения. Вручную загрузить первичное антитело против VE-кадгерина (анти-коза) в устройство при концентрации 2 мкг / мл (общий объем составляет 20-50 мкл). Храните прибор в холодильнике при температуре 4 ° С в течение ночи. Заливать вторичное антитело (осел анти-коза) с помощью шприца насоса при концентрации 7 мкг / мл в течение 45-60 мин.
- Этикетка EC F-актин с фаллоидином. Заливать устройство с 1x PBS фоR 15 мин до ручной загрузки фаллоидина (10 мкг / мл) в течение 7-10 мин.
- Этикетка ядра EC (см список материалов).
- Ополосните устройство с 1x PBS, и поддерживать его при температуре 4 ° С до обработки изображений.
4. флуоресцентных изображений эндотелиальной [Ca 2+]
- Заливать устройство с альбумином (10 мг / мл) раствора -Ringer в течение 15 мин при 37 ° С. Используйте ту же скорость перфузии, которая используется для культивирования клеток. Концентрации всех компонентов раствора альбумина Рингера описаны в список материалов.
- Настройка конфокальной системы EC [Ca 2+] визуализации с Fluo-4 утра. С помощью конфокальной микроскопической системы для Ca 2+ визуализации. С помощью аргонового лазера (488 нм) для возбуждения и установить полосу излучения в 510-530 нм. Сбор изображений с целью 25X (погружение в воду, NA: 0,95) на 512 х 512 формат сканирования. С помощью Z-шагом 2 мкм и интервал сканирования для каждого блока Iмаги 20 сек.
- Заливать устройство с Fluo-4 AM (5 мкМ) в течение 40 мин при температуре 37 ° С, затем промыть просвете Fluo-4 утра с раствором альбумина Рингера.
- Приобретать изображения Fluo-4 загружен микрососудов. Сбор исходных изображений в течение 10 мин. Заливать устройство с АТФ (10 мкМ) и записывать изменения интенсивности флуоресценции (FI) в течение 20 мин.
5. флуоресцентной томографии оксида азота производства
- Заливать устройство с раствором альбумина Рингера в течение 15 мин. Используйте скорость перфузии, которая является такой же, как используемый для культивирования клеток.
- Настройка системы флуоресцентной томографии для измерения АТФ-индуцированного оксида азота. С помощью микроскопа, оборудованного с 12-битной цифровой ПЗС-камерой и компьютерным управлением затвором для измерения оксида азота в. Используйте 75 Вт ксеноновой лампы в качестве источника света.
Примечание: Выбор возбуждения и излучения длиной волны для DAF-2 DA интерференционным фильтром (480/40 нм) и дихроичным зеркалом(505 нм) с полосовым барьера (535/50 нм). Используйте 20X объектива (NA: 0,75) для сбора изображений. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания, установите фильтр нейтральной плотности (0,5 N) перед интерференционным фильтром и ограничить время экспозиции до 0,12 сек. - Нагрузка клеток с ДАФ-2 DA (5 мкМ). Заливать устройство с DAF-2 DA в течение примерно 35-40 мин при температуре 37 ° С. Запишите базовую DAF-2 интенсивности флуоресценции (FI DAF) после первоначальной загрузки.
Примечание: DAF-2 DA непрерывно присутствует в перфузату в течение всего эксперимента 7. - Собирают DAF-2 изображения. Запишите базовую FI DAF в течение 5 мин. Заливать устройство с АТФ (10 мкМ) и собирают изображения в течение 30 мин с интервалом 1 мин. Соберите все изображения из той же группы клеток в то же фокальной плоскости.
Анализ 6. Данные
- Вручную выберите регион интересов (Rois) из собранных изображений на уровне отдельных клеток. каждыйROI занимает площадь одной отдельной клетки, которые могут быть указаны в общих чертах флуоресценции.
- Вычтите фоновой флуоресценции и вычислить среднее FI каждого трансформирования.
- Мера АТФ-индуцированные изменения в EC [Ca 2+] и NO производства. Количественно АТФ-индуцированные изменения в EC [Ca 2+] путем расчета изменения в Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, где 0 FI является средним базовым ФП во время альбумин-Ringer перфузии перед добавлением АТФ) минус измеренное задний план. Не Количественно NO скорость производства путем проведения первого дифференциального преобразование FI DAF с течением времени.
Примечание: Временной ход FI DAF представляет собой кумулятивный производство NO со временем. Таким образом, NO скорость производства не рассчитывается на основе профиля FI DAF под базальную и АТФ стимулируются условия. Детали анализа данных и экспериментальных процедур, были описаны в предыдущей публикации 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе представлены некоторые результаты, полученные с культивированной сети микрососудов, разработанной с этим протоколом. Шаблон Микроканал представляет собой разветвленную сеть три уровня (Рис . 1А) В этой конструкции, а 159 мкм в ширину ветви мать канала на два 126 мкм шириной каналов и ветвей снова в четыре 100 мкм шириной дочерних каналов. 3D - численное моделирование было выполнено для оценки распределения сдвиговых напряжений при скорости потока 0,35 мкл / мин (рис 1б), что указывает на три различных уровней напряжения сдвига в пределах этой микроканальной сети. Ламинарный поток внутри микроканалов, по прогнозам, будет гидродинамической устойчивостью без присутствия нарушенного или вторичного потока. После того, как СУ-8 мастер - форма была изготовлена с помощью стандартного процесса фотолитографии (рис 1C), A PDMS был изготовлен прибор с помощью мягкой литографии повторить Микроканал педизайн twork в прозрачную, воздухопроницаемой эшафоте (рис 1D - E). После того, как ЕС посеве (рис 1F - G) и 3-4 дня непрерывной перфузии, КЭ достигли слияния и успешно покрываются внутренние поверхности микроканалов.
EC F-актин и ядра были флуоресцентно меченных в сети и проиллюстрированы с конфокальных изображений. Под напряжении сдвига 1,0 дин / см 2, около 30% от HUVECs вытянуты вдоль направления потока с повышенными центральным стрессовые волокна, в то время как остальные 70% сохранили свою булыжником шаблон с доминированными периферической F-актина 5. Изменение формы клеток сдвига индуцированных оказывается менее заметным, чем обычно наблюдается в культурах 2D статической клеток. На самом деле в условиях , в естественных условиях, КЧС имеют различные формы клеток различных типов судов, но не так легко изменить форму клеток в ответ на CHA потокаНГРЭС. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить , была ли эта разница результатов геометрии канала и перфузионной среды , которые находятся ближе к условиям в естественных условиях.
Мы также успешно измерены АТФ-индуцированные изменения в EC [Ca 2+] и NO производства (4 и 5). АТФ , индуцированные кратковременное повышение EC [Ca 2+] и NO производства. Средняя пик FI Fluo-4 было 187 ± 22% от исходного уровня, которое произошло при 35 ± 10 сек после начала ATP перфузии. Уровень NO производства был увеличен с базального уровня 0,15 ± 0,05 а.е. в минуту до 1,18 ± 0,37 а.е. в минуту в течение первых пяти минут воздействия АТФ. Все результаты были представлены как стандартная ошибка среднего значения ± (SE). Они сравнимы с результатами , полученными из индивидуально перфузией интактных венул 6,9,14,19.
Рисунок 1: Микрожидкостных Изготовление устройств и EC загрузки (A) схематическое изображение сети микроканалов.. Ширина и бифуркация угол микроканалов указаны на каждом ветвлении уровнях. (B) Численное моделирование распределения напряжений сдвига. Скорость потока составляет 0,35 мкл / мин. Высота микроканала после разработки составляет 80 мкм. Эти две цифры были изменены из предыдущей публикации с дополнительными деталями 5. (C) Разработка мастер - формы. Мастер формы сети микроканалов изготавливается с СУ-8 фоторезиста на кремниевой пластине. (D) Процесс мягкой литографии. PDMS смесь отливают на мастер-форму и отверждают в печи. (Е) Склеивание PDMS канала к подложке. Субстрат, используемый для данного устройства является покровное СПИп покрывают тонким слоем PDMS. На входе и выходе создается с отверстием-нокаутер. (F и G) EC загрузки. Около 10 мкл клеточного раствора помещают на входе. Мягкое поток затем индуцировали путем помещения пипетки Пастера на выходе через капиллярный поток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: конфокальных изображений EC F-актина в культивируемых сеть микроканалов (А) Схематический вид конструкции сети.. Выбранные регионы , показанные на B - D обозначены на графике. (B - D) конфокальной изображения EC F-актина (красный) и ядер (синий) сети микрососудов в пробирке B 1. C 1 и D 1 являются проецируемые изображения из верхней части штабеля Микроканал изображения, и B 2, C 2 и D 2 являются изображения проекции из нижней части штабеля изображения. Е. вид в поперечном сечении , как показано 1-1 ', 2-2' и 3-3 'в B 1 - D 1, шкала бар = 100 мкм. Эти изображения взяты из предыдущей публикации 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сравнение VE-кадгерина распределение в культивируемых микрососудов сети с статически культивированных монослоя EC и неповрежденной крысы брыжеечной венулы (.
Рисунок 4: АТФ-индуцированное увеличение EC [Ca 2+ р>] я. Эксперименты проводились с 4 -х устройств и от 7 до 12 трансформирования (индивидуальная ЭКС) на одно устройство было отобрано для анализа данных. (A) Временной ход АТФ (10 мкМ) индуцированный изменения в EC [Ca 2+] (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) от одного репрезентативного эксперимента. (Б) образы репрезентативного эксперимента (данные приведены в А). Это ранее опубликована цифра 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: АТФ-не индуцируется NO производства Эксперименты проводились в 3 -х устройств и были выбраны 11 до 12 трансформирования (индивидуальные ЭКС) на устройство для анализа данных.. (A DAF ± SE, левая ось Y) в КЧС под базальных условиях и после воздействия АТФ. NO дебит (ДФ / дт, пунктирная линия), был получен из первого дифференциального преобразования накопленной FI DAF (правая ось Y). (Б) Типичные изображения из одного эксперимента. Частотный преобразователь DAF дополнительно увеличена после того, NO донор нитропруссид натрия (SNP), был добавлен к перфузату, что указывает на достаточное количество внутриклеточного DAF-2 реагирует с NO. Это ранее опубликована цифра 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы приводим подробные протоколы для развития культурной сети микрососудов, характеристика переходов ЕС и цитоскелета F-актин распределения, а также количественные измерения EC [Ca 2+] и NO производства с использованием микрожидкостных устройств. Перфузировались Микрожидкостных устройство обеспечивает модель в пробирке , которая позволяет близкое моделирование в естественных условиях микрососудистых геометрии и условий потока сдвига. Поскольку культивируют сеть микрососудов может быть образована первичным человеческим КЧС, этот подход может служить полезным инструментом для исследования, как патологически измененные компоненты крови из образцов пациентов влияют на человека ECs путем прямого перфузии образцов крови пациентов с культивируемыми микрососудов и обеспечить понимание в клиническую вопросы. Человеческие КЭ, разработанные микрососуды также могут быть использованы для скрининга лекарственных средств, чтобы избежать возможных расхождений в ответах наркотиков между ткани человека и животных.
ve_content "> Подложка из микрожидкостных устройств, показанных в этом протоколе является стеклянная крышка скользит (150-180 мкм) спин-покрытый тонким слоем PDMS. Этот тонкий слой PDMS имеет важное значение для высокого разрешения и живой ткани в реальном масштабе времени визуализации, так как большие цели числовой апертуры обычно имеет короткое рабочее расстояние. ламинарный поток внутри микроканалов (субмиллиметровом диапазоне) имеет очень низкое число Рейнольдса, и перепад давления линейно связан с потоком, таким образом, касательное распределение напряжений зависит только от на геометрии канала. Таким образом, он может быть хорошо контролируется высокоточной перфузионного насоса 20. в нашем настоящем исследовании, напряжение сдвига применительно к культивируемым сети микрососудов HUVEC составляет от 1 до 10 дин / см 2, что находится в пределах диапазон напряжения сдвига , измеренной в венозной системе 21,22. макросоци- жидкостный системы , такие как параллельной проточной камеры не хватает сложные структуры потока. в больших камерах шкала расхода (диапазон мм см), КЕ , как правило , только выращивают в нижней поверхности (2D монослоем), отсутствие геометрических сходства с микрососудов в естественных условиях. Когда ширина камеры потока составляет более 2 мм, однородный поток ограничен в области , которая обычно составляет несколько миллиметров от выпускного / входного отверстия, и несколько сотен микрон расстояние от боковой стенки 23. Когда ширина камеры увеличивается до диапазона сантиметров, то поток будет дифференцироваться в различные линии тока и скорости потока изменяется по всей зоне 24. Кроме того, чем больше камера масштаб потока потребляет по меньшей мере, в 100 раз больше Перфузат для достижения того же напряжения сдвига, что и в микроканалов. Сдвига распределения напряжений внутри сети микроканалов могут быть смоделированы с помощью численного моделирования инструмента, и стационарные несжимаемых уравнений Навье-Стокса может быть решена с помощью большинства конечных элементов программного обеспечения.Микрожидкостных устройство может быть выполнено с Singlе процесс маска микротехнологий. Успех развития культивируемых микрососудов, однако, требует, особое внимание к деталям. После загрузки раствора в микроканалы, каждое устройство должно быть проверено на пузырьковой отлова под микроскопом перед посевом ЕС. При возникновении пузырь, это все еще возможно, чтобы заставить его на этом этапе путем применения гидравлического давления на входе с закрытым выходом, так как PDMS является воздухопроницаемым материалом. Для поддержания требуемой скорости перфузии, плотно облегающей без утечки необходимо для всех соединений иглы / насосно-компрессорных труб. Согласованный отверстие-нокаутер и размер трубки имеют решающее значение для достижения плотного прилегания. Для обеспечения точного доставки скорости потока, шприц на перфузионного насоса и устройства должны быть размещены на том же уровне. Для изменения перфузат, вставленная трубка должна быть аккуратно отсоединяется от устройства, чтобы избежать какого-либо растягивания. Для увеличения напряжения сдвига, шаг увеличивается (например, 10 ступеней увеличения 18 ч) являются рекоменDed, чтобы избежать внезапного изменения потока, вызванного шелушение EC.
Предыдущие исследования , выполненные по отдельности перфузированных неповрежденные микрососудов показали , что агонисты увеличение вызванных EC [Ca 2+], и последующее эндотелиальной синтазы окиси азота (Енос) и активации NO производства являются необходимыми для передачи сигналов повышенной проницаемости микрососудов при воспалительных состояниях 6,7 , 9-13,25. В этом протоколе, мы выбираем АТФ в качестве репрезентативного агониста, так как он обычно выпущен эритроциты, агрегированных тромбоцитов и поврежденных тканей или при воспалительных процессах в естественных условиях. Индикатор кальция флуоресценции, Fluo-4 А.М., был использован для измерения изменений в эндотелиальной [Ca 2+] я после воздействия АТФ. EC [Ca 2+] ответы в культуре микрососудов аналогичны тем , которые найдены в неповрежденных микрососудов 7,9. Измерение производства EC NO было технически сложным для биологов.На сегодняшний день не было никакого флуоресцентного индикатора, который позволяет обнаруживать динамические изменения в NO концентрации аналогичным образом, к показателям кальция. DAF-2 DA широко используется не для оценки NO производства. Тем не менее, правильное использование, интерпретации данных и анализа данных необходимо обратить внимание пользователей. С химической трансформации DAF-2 к DAF-2T в присутствии NO является необратимым (один из способов преобразования) 26, обнаруженный DAF профиль интенсивности флуоресценции не отражает изменения в NO концентрации. Вместо этого, он указывает на то накопленное производство ДАФ-2Т со временем. Исходя из этого совмещаться DAF-2 флуоресценции (FI DAF) кривая, тем НЕТ дебит (DF / DT) может быть получена с помощью первого дифференциального преобразования FI DAF 7,11. А именно, угол наклона кривой FI указывает скорость производства NO и плато-фаза указывает на отсутствие дальнейшего увеличилось никакого производства. После преобразования, данные, полученные от этого протокола прesented как базальный NO дебит и изменения в NO производства в ответ на АТФ с временным и пространственным разрешением на отдельных уровнях ЕС в рамках сети микрососудов.
В настоящее время ПДМС широко используется для микрофлюидальных приложений, так как она является оптически прозрачным, не токсичен, и газопроницаемостью из мягкого эластомера 27-30. Однако, поскольку PDMS не водопроницаемой, мы не могли непосредственно измерить проницаемость монослоя EC. Чтобы преодолеть это ограничение, некоторые приложения изменили стенки канала структуры , такие как интеграция проницаемой мембраны в канал 31, или создание проницаемой "оконных проемов" с микро-столбов или микроотверстий 32,33, в то время как другие были сосредоточены на модификация материалов устройств , таких как использование гидрогеля устройств или гидрогелевые / PDMS гибридных устройств 17,34-36. К недостаткам таких устройств являются их уязвимого характера к обезвоживанию и их относительно слабым мechanical свойства стоять стресс или давление. Дальнейшее развитие проницаемого материала с механической прочностью будет способствовать дальнейшему улучшению устройства, а также его потенциал для более широких биологических применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие интересы или противоречащие друг другу интересы раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL56237, Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний Институт DK97391-03, Национальный научный фонд (NSF-1227359 и EPS-1003907).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E.
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G.
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
![Разработка и определение характеристик<em> In Vitro</em> Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са<sup> 2+</sup>]<sub> я</sub> И оксид азота Производство](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/54014.jpg)
