Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ontwikkeling en karakterisering van Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/54014
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University
* These authors contributed equally

Abstract

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype. Hoewel de ontwikkeling van microfluïdische apparaten is omarmd door ingenieurs meer dan twee decennia, hun biologische toepassingen blijven beperkt. Een fysiologisch relevant in vitro model microvaatje bevestigd met biologische toepassingen is het belangrijk om het veld bevorderen en overbruggen van de kloof tussen in vivo en in vitro onderzoeken. Hier presenteren we gedetailleerde procedures voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk via een microfluïdische inrichting met een lange-termijn perfusie vermogen. We tonen ook aan haar verzoeken om kwantitatieve metingen van-agonist geïnduceerde veranderingen in EG [Ca 2+] i en stikstofmonoxide (NO) productie in real-time met behulp van confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De gevormde microvaatje nettowerken met continue perfusie toonde goed ontwikkelde verbindingen tussen EC. VE-cadherine distributie was dichter bij die waargenomen in intacte microvaatjes dan statisch gekweekte EC monolagen. ATP-geïnduceerde tijdelijke toename van EG [Ca2 +] i en NO productie werden kwantitatief gemeten op individueel celniveau, die de functionaliteit van de gekweekte microvaatjes gevalideerd. Deze microfluïdische apparaat kan ECs te groeien onder goed gecontroleerde, fysiologisch relevante stroom, waarbij de celkweek omgeving dichter bij in vivo dan die in de conventionele, statische 2D culturen maakt. Het microkanaal netwerk ontwerp is zeer veelzijdig, en het fabricageproces is eenvoudig en herhaalbaar. Het apparaat kan eenvoudig worden geïntegreerd in de confocale microscopische of conventionele systeem voor hoge resolutie beeldvorming. Belangrijker, omdat de gekweekte microvaatje netwerk kan worden gevormd door primaire humane EC, zal deze benadering een nuttig instrument om te onderzoeken hoepathologisch veranderde bloedcomponenten van patiënt monsters hebben voor de EC en geven inzicht in de klinische problemen. Het kan ook worden ontwikkeld als een platform voor drug discovery.

Introduction

Endotheelcellen (ECs) langs de bloedvatwand in vivo worden voortdurend blootgesteld stromen, maar gekweekte EC's worden vaak gekweekt in statische toestand en vertonen een pro-inflammatoir fenotype 1,2. De microfluidics technologie maakt een nauwkeurig gecontroleerde vloeistof door een geometrisch beperkt microschaal (sub-millimeter) kanalen 3, dat de mogelijkheid voor gekweekte cellen voorziet, met name voor vasculaire EC, om te groeien onder de gewenste stroom omstandigheden. Deze eigenschappen maken de celkweekomstandigheden dichter bij in vivo dan de conventionele, statische 2D celkweken. Ze zijn zeer belangrijk bij de microfluïdische apparaten worden gebruikt om verschillende soorten vasculatures modelleren en EG reacties op mechanische en / of chemische prikkels bestuderen.

Ondanks de voordelen aangetoond door de microkanaal-netwerk via een statisch celkweek, de aanpassing en de toepassing van microfluidics in de biomedische field blijven beperkt. Gemeld door een recent overzicht, het merendeel van de publicaties van dit gebied (85%) zijn nog in engineering journals 4. De prestaties van microfluïdische apparaten is niet overtuigend genoeg voor de meeste biologen over te stappen van de huidige technieken, zoals de Transwell test en de macro-schaal cultuur schotel / glasplaatje om dit geminiaturiseerde apparaat. Microfluidics is een multidisciplinair veld, dat interdisciplinaire samenwerking vereist dat dit gebied vooruitgang te boeken. Het doel van dit technische artikel is om de lacunes in de kennis te verminderen tussen disciplines en maken de fabricage procedures begrijpelijk door biologen, terwijl het verstrekken van biologische toepassingen en functionele validatie van de microfluïdische microvaatjes. De gevisualiseerde experimentele protocollen omvatten fabricage van zowel microfluïdische apparaten en hun biologische nutsbedrijven, die een nauwe samenwerking tussen ingenieurs en biologen vertegenwoordigt.

We hebben onlangs melding gemaakt van enkelebiologische toepassingen die de in vitro microvaatje netwerk microfluïdische apparaat 5. Om op passende ontwerp van de afmetingen van het microkanaal netwerk en breng de gewenste schuifspanning werd een numeriek model gebouwd met numerieke stromingsleer software om het stromingsprofiel nauwkeurig schatten. Primaire humane navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC) die werden gezaaid in de microkanalen confluentie bereikten, dat wil zeggen onder de volledige binnenoppervlakken van het microkanaal, 3-4 dagen continue perfusie. De barrièrevorming juiste bleek uit VE-cadherine kleuring en vergeleken met die gevormd in statische celkweekomstandigheden en in intacte microvaatjes. Door toepassing van de experimentele protocollen ontwikkeld individueel intacte geperfundeerde microvaatjes 6-8, we kwantitatief gemeten veranderingen in EG [Ca2 +] i en stikstofoxide (NO) in reactie op adenosine trifosfaat (ATP) met fluorescerende indicators en confocale en conventionele fluorescentiemicroscopie. De door agonist geïnduceerde toenamen in EG [Ca2 +] i en NO productie gemeld noodzakelijk intracellulaire signalen voor inflammatoire mediator-geïnduceerde toenames in permeabiliteit microvaatjes 6-15. Hoewel sommige eerdere studies beelden van DAF-2 DA beladen microfluïdische apparaten 16,17 toonde, had juiste resolutie en data-analyse nog niet bereikt 18. Voor zover wij weten, deze studie toont de eerste kwantitatieve metingen van door agonist veroorzaakte dynamische verandering in endotheelcellen [Ca2 +] i en NO opstelling met microfluïdische systeem.

Microproductietechnieken de flexibiliteit om microkanalen fabriceren tot een paar micrometer en maken de ontwikkeling mogelijk van complexe patronen op de geometrie van in vivo microvasculatuur nabootsen. Hier presenteerden we een typische microkanaal netwerk met drie niveaus van vertakking. Dezenetwerk wordt vervaardigd door de combinatie van fotolithografie die wordt uitgevoerd in een cleanroom microfabrication en zachte lithografie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. microfluïdische apparaat Fabrication

  1. Standard Fotolithografie Fabrication van een SU-8 50 Master Mold
    1. Reinig de siliciumwafel voor spin-coating. Gespoeld kale 2 inch silicium wafer met aceton gedurende 15 minuten gevolgd door isopropylalcohol (IPA) gedurende 15 min. Dehydrateer de wafer door het op een verwarmingsplaat bij 150 ° C gedurende 1 uur. Na dehydratatie Koel de wafer bij kamertemperatuur.
    2. Spin-coat het silicium wafer met SU-8. Voeg 2 ml SU-8 op de wafer. Ramp de wafel 500 rpm en 100 rpm / sec versnelling gedurende 10 seconden, gevolgd door 1000 rpm bij 300 rpm / sec versnelling gedurende 30 sec. (Zie Aanvullende Video 1)
    3. Pre-bak de wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 10 min, vervolgens zacht bakken bij 95 ° C gedurende 30 minuten.
    4. Met UV blootstelling aan de ontworpen patroon te vormen van een film masker op het roterend bedekken fotoresist. Druk de patroon op een dunne transparante film als een film masker. Plaats de film masker boven despin-beklede fotoresist en blootstellen aan UV met een dosis van 300 mJ / cm2. (Zie Aanvullende Video 2)
      Let op: In dit protocol, het microkanaal netwerk patroon (159 micrometer breed moeder kanalen vertakking in vier 100 micrometer breed dochter kanalen) is ontworpen met CAD-software. Het patroon op de film toont als ruim baan en de rest van de film wordt bedekt met zwarte inkt. Omdat SU-8 is een negatieve fotoresist, wordt het gedeelte van de fotoresist die is blootgesteld aan UV verknoopt en onoplosbaar oplosmiddel worden tijdens de ontwikkeling van schimmels (stap 1.1.6). Na de ontwikkeling wordt het onoplosbare gedeelte het ontworpen netwerkpatroon repliceren en dienen als meester mal.
    5. Post-bak de belichte wafer op een hete plaat bij 65 ° C gedurende 1 min, vervolgens 95 ° C gedurende 10 minuten.
    6. Ontwikkel de meester mal. Gebruik SU-8 developer als oplosmiddel om de niet-verknoopt fotoresist te verwijderen. Dompel de wafer in SU-8 developer gedurende 3 minuten en spoel af met IPAgedurende 1 min.
    7. Herhaal deze ontwikkelen cyclus 2-3 keer totdat er geen witte streep vorming (residu van niet uitgeharde fotolak) na de IPA spoelen. Voorzichtig drogen van de wafel met stikstofgas en onderzoekt de kleine elementen van het patroon onder een microscoop. Herhaal dit extra ontwikkelen cycli indien nodig.
    8. Hard bak de wafer op een hete plaat bij 150 ° C gedurende 15 minuten.
  2. Soft Lithography
    1. de twee delen (basis en verharder) van polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer handmatig te mengen in een gew. verhouding van 10: 1.
    2. De gas de PDMS mengsel met een exsiccator verbonden met een vacuümbron voor 15 min. Werpt het PDMS oplossing op de fotolak meester mal. De dikte van de PDMS moet zijn dan 3 mm een ​​stabiele aanhouden van de inlaat / uitlaat slang verschaffen. De-gas de PDMS opnieuw voor 15 minuten, en verwijder de resterende luchtbellen met stikstofgas indien nodig. Hard de gegoten PDMS in een oven bij 65 ° C gedurende 3 uur.
    3. Reinig het oppervlak vanhet glas dekglaasje met een plakband en een plasma-cleaner (30 sec plasma behandeling). Spin-coat-un uitgeharde PDMS (0,5 ml) op de glazen dekglaasje door verhoging tot 4000 rpm en 500 rpm / sec acceleratie voor 30 sec. Hard de PDMS roterend bedekken dekglaasje in een oven bij 65 ° C gedurende ten minste 30 min.
    4. Knip en laat de uitgeharde PDMS van de master mal. Vervolgens maakt een inlaat en een uitlaat met een 1 mm diameter perforator bij het distale einde van de moeder kanalen.
    5. Binden het apparaat naar de PDMS roterend bedekken dekglaasje. Oxideren van de oppervlakken van de PDMS en dekglaasje met een plasma reiniger voor 1 min. Na de zuurstof plasmabehandeling, plaats een druppel gedeïoniseerd water (DI water) aan het verbindingsoppervlak en plaats de twee delen samen. Bak de inrichting in een oven bij 65 ° C gedurende 30 minuten om een ​​permanente verbinding te verkrijgen.

Aanvullende Video 1 Aanvullende Video 1 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Aanvullende Video 2
Aanvullende Video 2 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

2. endotheelcellen zaaien en Cultuur

  1. Sterilisatie-inrichting en fibronectine Coating
    1. Het behoud van de hydrofobe eigenschap van het PDMS oppervlak rond de inlaat / uitlaat van oxidatie. Bedek het PDMS oppervlak rond de inlaat en uitlaat met strookjes plakband om oxidatie te voorkomen. Deze procedure kan voorkomen DI water verspreiden over het bovenoppervlak van de inrichting tijdens het vullen stap (2.1.3).
    2. Behandel de PDMS apparaat met zuurstof plasma for 5 min veranderen het oppervlak hydrofiel, waardoor vloeistofstroom door de microkanaal vergemakkelijken en te voorkomen dat de belletjesopsluitfilterdeel de vulprocedure (2.1.3).
    3. Gebruik ofwel een spuit met een naald bevestigd of een pipet om het apparaat met DI-water te vullen van de inlaat. Blijven de vulling tot er een druppel DI water (30-50 ui) geaccumuleerd bij de uitlaat. Onderzoek van het apparaat onder een microscoop om te controleren of er luchtbellen gevangen in de microkanaal. Verwijder de buitensporige waterdruppeltje bij de inlaat en uitlaat met een tissue.
    4. Steriliseer het apparaat in een petrischaal met UV gedurende minimaal 3 uur in een laminaire bioveiligheid kap. Om verdamping te voorkomen, hebben betrekking op de ingang / uitgang met een dun stukje PDMS, zet een natte papieren tissue binnen het gerecht, en wikkel het gerecht met Parafilm.
    5. Coat het apparaat met fibronectine. Spoel het apparaat eerst met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), smeer met 100 ug / ml fibronectine overnacht in de koelkast (4 ° C). Plaats een druppel oplossing bij de inlaat, en vervolgens een negatieve druk bij de uitlaat met een huisvacuüm, een injectiespuit met een naald of een pipet.
    6. Vul het apparaat met celkweek media. Spoel het apparaat met PBS handmatig 3 keer voordat de celkweek media. Warm-up van het apparaat in een incubator bij 37 ° C.
  2. EC Zaaien en lange termijn Perfusion
    Opmerking: In vergelijking met gebruikelijke statische 2D EG cultuur, de in vitro microvaatje netwerkmodel continue perfusie uit de celkweek omgeving dichter bij de in vivo omstandigheden. De in vitro microvaatje netwerk aangetoond in dit protocol kan maximaal twee weken gehandhaafd. De goed-gecontroleerde perfusie zal continu aan te vullen voedingsstoffen, te verwijderen afval, en te voorkomen dat over-samenvloeiing van de EC monolaag. Derhalve kan worden uitgebreid tot een langere termijn studies, nabootsen van de cellulaire en hemodynamische omgeving onder verschillende Physiological en pathologische omstandigheden.
    1. Meng primaire HUVECs in HUVEC cultuur media (MCDB 131) met 8% dextran (molecuulgewicht 70.000). Het dextran wordt gebruikt om de viscositeit van het afdrukmateriaal verhogen en bereiken een betere cel seeding resultaat. De aanbevolen celdichtheid ongeveer 2-4 x 10 6 cellen / ml.
    2. Zaad van de cellen in het apparaat. Plaats een 10-20 ul druppel van cellen via inlaat. Introduceer een zachte stroom door ofwel het kantelen van het apparaat, of de capillaire werking met een glazen Pasteur pipet bij de uitlaat. De sleutel voor een succesvolle cel laden moet de stroomsnelheid regelen minder dan 1 mm / sec in de kleinste kanalen.
    3. Controleer de cel zaaien. Na de eerste enting, incubeer de inrichting voor 15-20 min (bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C) voor het controleren van de status van enten onder de microscoop. Voer eventueel aanvullende celbelading een gewenste celdichtheid bereikt.
    4. Voorzichtig Spoel het apparaat met celkweekmedium (37° C) om het dextran te verwijderen. Cultuur de inrichting in afwezigheid van bereikte na 6 uur in een incubator (5% CO2 bij 37 ° C).
    5. Stel de slangaansluiting voor langdurige perfusie. Tape het apparaat in een petrischaaltje om verplaatsing te voorkomen. Maak kleine gaatjes in het deksel van de petrischaal voor inlaat en uitlaat slang inserties. Sluit de inlaat slang aan op een injectiespuit met een naald voor de celkweek media perfusie. Sluit de uitlaat slang aan een inzamelaar van afvalstoffen.
      Opmerking: Plaats het apparaat en de afvalinzamelaar in een celkweek incubator, terwijl het plaatsen van een perfusie pomp buiten de couveuse en sluit deze met het apparaat door de lange inlaat slang. De perfusie wordt bepaald door het experimentele ontwerp. In de onderhavige inrichting gebruikt een perfusiesnelheid van 0,35 pl / min en een afschuifspanning bereik tussen 1-2 dyne / cm2. Op grond van deze perfusie toestand, de HUVEC's te bereiken samenvloeiing in ongeveer 3-4 dagen.

3. Immunofluorescent kleuring

  1. Bevestig de EC in de inrichting door perfusie van 2% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij 4 ° C, gevolgd door spoelen 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 min, en 1% BSA blokkering gedurende 30 min. Gebruik een perfusie snelheid die dezelfde is als die gebruikt voor celkweek.
  2. Permeabilize vaste ECS antilichaam kleuring met 0,1% Triton X-100. Perfuseren het apparaat met Triton voor 5-7 min tot label VE-cadherine, en 3 min naar label F-actine.
  3. Laad de antilichamen in het apparaat. Perfuseren het apparaat met 1x PBS gedurende 15 minuten te spoelen de vorige oplossingen. Handmatig te laden het primaire antilichaam tegen VE-cadherine (anti-geit) in het apparaat bij een concentratie van 2 ug / ml (totaal volume 20-50 ui). Houd het apparaat in een koelkast bij 4 ° C overnacht. Perfuseren het secundaire antilichaam (ezel anti-geit) van een injectiepomp bij een concentratie van 7 ug / ml gedurende 45-60 min.
  4. Label EC F-actine met phalloidin. Perfuseren het apparaat met 1x PBS for 15 min voor handmatig laden phalloidin (10 ug / ml) gedurende 7-10 min.
  5. Label EC kernen (zie Materials List).
  6. Spoel het apparaat met 1x PBS en handhaven bij 4 ° C tot beeldvorming.

4. Fluorescentie Imaging van endotheliale [Ca 2+] i

  1. Perfuseren het apparaat met albumine (10 mg / ml) -Ringer's oplossing gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Gebruik dezelfde perfusie tarief als die wordt gebruikt voor celkweek. De concentraties van alle componenten van albumine-oplossing Ringer's zijn beschreven in de Materialen List.
  2. Opgezet confocale systeem voor het EG [Ca 2+] i beeldvorming met fluo-04:00. Gebruik van een confocale microscopische voor Ca2 + imaging. Gebruik een argon laser (488 nm) voor excitatie en stel de uitstoot band als 510-530 nm. Verzamel de beelden met een 25X objectief (onderdompeling in water, NA: 0,95) bij 512 x 512 scan-formaat. Gebruik een z-stap van 2 urn en een scanning interval voor elke stapel images van 20 sec.
  3. Perfuseren het apparaat met fluo-04:00 (5 uM) gedurende 40 min bij 37 ° C, dan was het lumen fluo-04:00 met een oplossing van albumine-Ringer's.
  4. Acquire beelden van fluo-4 geladen microvaten. Verzamel de basislijn afbeeldingen voor 10 min. Perfuseren het apparaat met ATP (10 pM) en de veranderingen in fluorescentie-intensiteit (FI) opnemen 20 min.

5. Fluorescentie beeldvorming van productie van stikstofoxide

  1. Perfuseren het apparaat albumine-oplossing van Ringer gedurende 15 min. Gebruik een perfusie snelheid die dezelfde is als die gebruikt voor celkweek.
  2. Stel de fluorescentie afbeeldingssysteem maat ATP-geïnduceerde productie van stikstofoxide. Gebruik een microscoop uitgerust met een 12-bit digitale CCD camera en een computergestuurde sluiter voor stikstofmonoxide meting. Gebruik een 75 W xenon lamp als lichtbron.
    Let op: Selecteer de excitatie en emissie golflengte voor DAF-2 DA door een interferentie filter (480/40 nm) en een dichroïsche spiegel(505 nm) met een band-pas barrière (535/50 nm). Gebruik een 20X objectief (NA: 0,75) om de beelden te verzamelen. Fotobleken te minimaliseren, plaatst een grijsfilter (0,5 N) voor het interferentiefilter en beperken de blootstellingstijd aan 0,12 sec.
  3. Laad de cellen met DAF-2 DA (5 pm). Perfuseren het apparaat met DAF-2 DA gedurende ongeveer 35-40 minuten bij 37 ° C. Noteer de basislijn van DAF-2 fluorescentie-intensiteit (FI DAF) na de eerste belasting.
    Opmerking: DAF-2 DA continu aanwezig is in het perfusaat gedurende het experiment 7.
  4. Verzamel DAF-2 beelden. Noteer de basislijn FI DAF 5 minuten. Perfuseren het apparaat met ATP (10 pM) en verzamel de afbeeldingen voor 30 min met 1 minuut intervallen. Verzamel alle van de beelden van dezelfde groep cellen op hetzelfde focal plane.

6. Data Analysis

  1. Selecteer handmatig de regio van belang (ROI) van de verzamelde beelden op individueel celniveau. ElkROI bestrijkt het gebied van een individuele cel die de fluorescentie lijnen worden aangegeven.
  2. Aftrekken achtergrond fluorescentie en berekent het gemiddelde FI van elk ROI.
  3. Meet ATP-geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i en NO productie. Kwantificeren ATP-geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i door het berekenen van de veranderingen in Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, waarbij FI 0 is de gemiddelde basislijn FI tijdens albumine-Ringer perfusie voor het toevoegen van ATP) minus de gemeten achtergrond. Kwantificeren NO productie snelheid door het uitvoeren van de eerste differentiële conversie van de FI DAF in de tijd.
    Opmerking: Het tijdsverloop van FI DAF is een cumulatieve productie van NO in de tijd. Daarom wordt de NO-productie berekend op basis van het profiel van FI DAF zowel onder basale en ATP gestimuleerde omstandigheden. Details van data-analyse en experimentele procedures zijn beschreven in een eerdere publicatie 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In dit gedeelte wordt een aantal van de resultaten verkregen met de gekweekte microvaatjes netwerk ontwikkeld met dit protocol resultaten. Het microkanaal patroon is een drie niveau vertakking netwerk (figuur 1A). In dit ontwerp, een 159 micrometer breed moeder kanaal takken in twee 126 micrometer brede kanalen, en takken weer in vier 100 micrometer breed dochter kanalen. Een 3D numerieke simulatie werd uitgevoerd om de schuifspanning verdeling schatten onder de stroomsnelheid van 0,35 pl / min (Figuur 1B), waarbij drie verschillende afschuifspanning geeft op deze microkanaal netwerk. De laminaire stroming binnen de microkanalen wordt voorspeld hydrodynamisch stabiel zonder de aanwezigheid van verstoorde of secundaire stroom zijn. Na een SU-8 meester mal werd vervaardigd met een standaard fotolithografie proces (figuur 1C), werd een PDMS apparaat gefabriceerd door middel van zachte lithografie om de microkanaal ne replicerentwork ontwerp in een transparante, luchtdoorlatend steiger (figuur 1D - E). Na enten EG (Figuur 1F - G) en 3-4 dagen continue perfusie, EC confluentie bereikten en met succes de binnenoppervlakken van de microkanalen bedekt.

EG F-actine en kernen werden fluorescent gelabelde binnen het netwerk en geïllustreerd met confocale beelden. Onder schuifspanning van 1,0 dyne / cm 2, ongeveer 30% van de HUVEC's langwerpige langs de stroomrichting met verhoogde centrale stressvezels, terwijl de overige 70% gehandhaafd zijn geplaveide patroon met gedomineerde perifere F-actine 5. De shear cell-geïnduceerde vormverandering lijkt minder prominent dan vaak waargenomen in 2D statische celculturen. Eigenlijk onder in vivo omstandigheden, de EC verschillende cellen vormen in verschillende typen schepen, maar niet gemakkelijk veranderen celvorm in reactie op de stroom change's. Meer onderzoek is nodig om te bepalen of dit verschil was het resultaat van de kanaalgeometrie en perfusie omgeving die dichter bij in vivo omstandigheden.

Ook succes gemeten ATP-geïnduceerde veranderingen in EG [Ca2 +] i en NO productie (figuren 4 en 5). ATP-geïnduceerde voorbijgaande verhogingen van EG [Ca 2+] i en NO productie. De gemiddelde piek FI fluo-4 was 187 ± 22% van de basislijn, die plaatsvond op 35 ± 10 seconden na de start van de ATP perfusie. De NO productiesnelheid verhoogd van een basaal niveau van 0,15 ± 0,05 AU per minuut tot 1,18 ± 0,37 AU per minuut binnen de eerste vijf minuten blootstelling ATP. Alle resultaten werden gerapporteerd als het gemiddelde ± standaardfout (SE). Zij zijn vergelijkbaar met de resultaten verkregen uit individueel perfusie intact venulen 6,9,14,19.


Figuur 1: microfluïdische apparaat Fabricage en EG lading (A) Schematische weergave van het microkanaal netwerk.. De breedte en bifurcatie hoek van de microkanalen worden vermeld op elke vertakking niveaus. (B) De numerieke simulatie van schuifspanningsverdeling. Het debiet is 0,35 pl / min. De hoogte van het microkanaal na ontwikkeling is 80 urn. Deze twee cijfers zijn gewijzigd ten opzichte van de vorige publicatie met extra details 5. (C) De ontwikkeling van de master mal. De kapitein mal van het microkanaal netwerk is gefabriceerd met SU-8 op silicium wafer. (D) De werkwijze van zachte lithografie. PDMS mengsel wordt gegoten op de master schimmel en uitgehard in een oven. (E) Bonding PDMS kanaal naar het substraat. Als substraat voor dit apparaat is een dekglaasje spin bekleed met een dunne laag van PDMS. De inlaat en uitlaat zijn gemaakt met een hole-puncher. (F en G) EG laden. Ongeveer 10 ul van cel oplossing wordt aan de inlaat. Een zachte stroom wordt vervolgens geïnduceerd door het plaatsen van een Pasteur pipet bij de uitlaat via capillaire flow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Confocale beelden van EC F-actine in gekweekte microkanaal netwerk (A) een schematisch aanzicht van het netwerkontwerp.. De geselecteerde gebieden getoond in B - D zijn aangegeven in de grafiek. (B - D) confocale beelden van EC F-actine (rood) en kernen (blauw) van de in vitro microvaatje netwerk B 1. C en 1 D 1 zijn de geprojecteerde beelden van bovenste helft van het beeld microkanaal stacks, en B2, C2 en D2 zijn de projecties van het onderste gedeelte van het beeld stacks. E. De dwarsdoorsnede aangeduid als 1-1, 2-2, en 3-3 in B 1 - D 1, schaal bar = 100 urn. Deze beelden worden aangepast van de vorige uitgave 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Vergelijkingen van VE-cadherine distributie in gekweekte microvaatjes netwerk met statisch gekweekte EC monolaag en intacte rat mesenteriale venule (. B - D. (B - D) VE-cadherine (groene) en celkernen (blauw) kleuren van de in vitro microvaatje netwerk D1 en D2 zijn de boven- en onderkant van de geprojecteerde beelden bij dezelfde vertakking regio, respectievelijk.. (E) VE-cadherine kleuring van statisch gekweekte EC. (F) VE-cadherine kleuring van individueel perfusie intact rat venule. Dit cijfer eerder 5 gepubliceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: ATP-geïnduceerde stijgingen van EG [Ca 2+ p>] i. Experimenten werden uitgevoerd vanaf 4 apparaten en 7-12 ROI (individuele EC) per inrichting werden geselecteerd voor data-analyse. (A) Het tijdsverloop van de ATP (10 uM) geïnduceerde veranderingen in de EG [Ca 2+] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) van één representatief experiment. (B) De beelden van de representatieve experiment (gegevens getoond in A). Dit is een eerder gepubliceerde cijfer 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: ATP-geïnduceerde NO productie Experimenten werden uitgevoerd in inrichtingen 3 en 11-12 ROI (individuele EC) per inrichting werden geselecteerd voor gegevensanalyse.. (A DAF ± SE, links Y-as) in EC onder basale omstandigheden en na blootstelling aan ATP. De NO productie snelheid (df / dt, stippellijn), is afgeleid van de eerste differentiële conversie van de geaccumuleerde FI DAF (rechter Y-as). (B) Representatieve beelden van een experiment. De FI ​​DAF verder verhoogd na een NO-donor, natriumnitroprusside (SNP), werd aan het perfusaat toegevoegd, hetgeen een voldoende hoeveelheid intracellulair DAF-2 reageren met NO. Dit is een eerder gepubliceerde cijfer 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de ontwikkeling van gekweekte microvaatje netwerk, de karakterisering van EG kruispunten en F-actine cytoskelet distributie en de kwantitatieve metingen van EG [Ca2 +] i en NO-productie met behulp van een microfluïdische apparaat. Geperfundeerde microfluïdische apparaat verschaft een in vitro model dat een getrouwe simulatie van de in vivo microvasculaire geometrieën afschuiving stroomomstandigheden toelaat. Sinds de gekweekte microvaatje netwerk kan worden gevormd door primaire humane EC, kan deze aanpak dienen als een nuttig instrument om te onderzoeken hoe pathologisch veranderde bloedcomponenten van patiënt monsters zijn voor de menselijke EC door directe perfusie van de patiënt bloedmonsters aan de gekweekte microvaatjes en inzicht geven in de klinische kwesties. De humane EC ontwikkelde microvaatjes kan ook worden gebruikt voor drug screening de potentiële verschillen in drug reacties tussen menselijke en dierlijke weefsels voorkomen.

ve_content "> Het substraat van de microfluïdische inrichtingen die in dit protocol is een glazen afdekplaat slip (150-180 urn) roterend bedekken met een dunne laag van PDMS. Deze dunne laagje PDMS essentieel voor hoge resolutie en levend weefsel realtime beeldvorming, omdat de grotere numerieke apertuur doelstellingen meestal korte werkafstand. de laminaire stroming binnen de microkanaal (submillimeter range) een zeer lage Reynolds getal en het drukverschil is lineair gerelateerd aan de stroom, waardoor de schuifspanning verdeling uitsluitend afhankelijk de kanaalgeometrie. Derhalve kan goed worden gecontroleerd door zeer nauwkeurige perfusiepomp 20. In onze studie, de afschuifspanning uitgeoefend op de HUVEC gekweekte microvaatje netwerk lag tussen 1-10 dyne / cm 2, hetgeen in de scala van shear stress, gemeten in het veneuze systeem 21,22. de macro-vloeibare systemen, zoals parallelle stroom kamer ontbreekt complexe stromingspatronen. in grotere schaal stroom kamers (mm-cm range), ECs zijn meestal alleen gekweekt in het ondervlak (2D monolaag), zonder de geometrische gelijkenissen met bloedvaten in vivo. Wanneer de breedte van de stromingskamer is dan 2 mm, wordt de homogene stroming opgesloten in een regio die gewoonlijk enkele millimeters afstand van de uitlaat / inlaat en een paar honderd micrometer afstand van de zijwand 23. Wanneer de breedte van de kamer wordt verhoogd tot het bereik van centimeters, zal de stroom differentiëren in verschillende stroomlijnt en de stroomsnelheden verandert over het hele gebied 24. Bovendien, de schaalvergroting stromingskamer verbruikt minstens 100 maal perfusaat dezelfde afschuifspanning als in microkanalen bewerkstelligen. De schuifspanningsverdeling binnen de microkanaal netwerk kan worden gesimuleerd met behulp van een numerieke modellering gereedschap en de stationaire onsamendrukbare Navier-Stokes vergelijkingen kunnen worden opgelost door de meeste eindige elementen programmapakket.

De microfluïdische apparaat kunnen met formae masker microfabrication proces. Het succes van gekweekte microvaatje ontwikkeling vereist echter speciale aandacht voor de details. Na het laden van de oplossing in de microkanalen, moet elk apparaat voor belletjesopsluitfilterdeel te worden gecontroleerd onder de microscoop voor EG zaaien. Wanneer een bel optreedt, is het nog mogelijk om deze met kracht in dit stadium door een hydraulische druk bij de inlaat met een gesloten afvoer, zoals PDMS wordt een luchtdoorlatend materiaal. Om een ​​gewenste perfusie handhaven, nauwsluitende zonder dat er een lek is noodzakelijk voor alle van de naald / slang aansluitingen. De aangepaste hole-puncher en slangen grootte zijn van cruciaal belang voor een strakke montage te bereiken. Om een ​​nauwkeurige aflevering van de stroomsnelheid te verzekeren, moet de spuit op de perfusiepomp en de inrichting op hetzelfde niveau geplaatst. Het perfusaat veranderen, moeten de ingebrachte buis voorzichtig worden losgekoppeld van de inrichting naar alle strekken voorkomen. Om schuifspanning stap toeneemt (bijvoorbeeld 10 stappen van stijging van 18 uur) te verhogen zijn aanbe-DED plotselinge stroom verandering te vermijden veroorzaakt EG peeling.

Eerdere studies uitgevoerd op individueel geperfuseerd intacte microvaatjes aangegeven door agonist geïnduceerde toenamen in EG [Ca2 +] i en de daaropvolgende endotheel stikstofoxide synthase (eNOS) activatie en NO productie nodig signalering voor verhoogde microvasculaire permeabiliteit onder ontstekingsaandoeningen 6,7 , 9-13,25. In dit protocol selecteren we ATP als vertegenwoordiger agonist, aangezien algemeen wordt vrijgegeven door rode bloedcellen, geaggregeerde bloedplaatjes en beschadigde weefsels of onder ontstekingsaandoeningen in vivo. Fluorescentie calciumindicator, Fluo-04:00, werd gebruikt om de veranderingen in endotheelcellen [Ca2 +] i na blootstelling aan ATP te meten. EG [Ca 2,] reacties in gekweekte microvaatjes zijn vergelijkbaar met die gevonden in intacte microvaatjes 7,9. Het meten van EC NO productie is technisch uitdagend geweest voor biologen.Tot op heden is er geen fluorescerende indicator die de detectie van dynamische veranderingen in NO-concentratie op soortgelijke wijze als de calcium indicatoren maakt geweest. DAF-2 DA is op grote schaal gebruikt om NO productie beoordelen. Echter, het juiste gebruik, data-interpretatie, en data-analyse nodig om de aandacht van gebruikers te trekken. Aangezien de chemische omzetting van DAF-2 DAF-2T in aanwezigheid van NO onomkeerbaar (unidirectioneel conversie) 26, de gedetecteerde fluorescentie DAF intensiteitprofiel niet de veranderingen in NO-concentratie vertegenwoordigt. In plaats daarvan geeft de geaccumuleerde DAF-2T productie met de tijd. Op basis van deze gecumuleerde DAF-2 fluorescentie (FI DAF) curve, de NO productie snelheid (df / dt) kan worden afgeleid door de eerste differentiële conversie van de FI DAF 7,11. Namelijk, de helling van de curve geeft de FI NO productiesnelheid en de plateaufase geeft NO productie niet verder verhoogd. Na de conversie, de gegevens die zijn gegenereerd uit deze protocol presented zowel de basale NO productie snelheid en de veranderingen in NO-productie in reactie op ATP met temporele en ruimtelijke resolutie op individueel EC niveaus binnen het microvaatje netwerk.

PDMS nog wijd gebruikt voor microfluïdische toepassingen, omdat het een optisch transparant, niet-toxisch en zuurstofdoorlatende zacht elastomeer 27-30. Echter, aangezien PDMS is niet waterdoorlatend, we konden niet direct de doorlaatbaarheid van EC monolaag meten. Om deze beperking te overwinnen, sommige toepassingen gewijzigde kanaalwand structuren zoals het integreren van een permeabel membraan in het kanaal 31, of het creëren van een permeabel "raamopeningen" met micro-pijlers of micro-openingen 32,33, andere zijn gericht op de modificatie van apparaat materialen zoals het gebruik van hydrogel inrichtingen of hydrogel / PDMS hybride apparaten 17,34-36. De nadelen van dergelijke inrichtingen hun kwetsbare aard uitdroging en hun relatief zwakke mechanische eigenschappen om stress of onder druk staan. Toekomstige ontwikkeling van permeabel materiaal met mechanische sterkte zal verdere verbetering van de inrichting en zijn potentieel voor bredere biologische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen of conflicterende belangen te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute verleent HL56237, National Institute of Diabetes en spijsvertering en Kidney Diseases Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 en EPS-1003907).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Sigma-Aldrich A2383
Acetone Fisher Scientific A929
Biopsy punch Miltex 33-31 AA
Bovine Albumin MP Biomedicals 810014
Bovine Brain Extract (BBE) Lonza CC-4098
Cover-slip Fisher Scientific 12-542C
DAF-2 DA Calbiochem 251505
Dextran Sigma-Aldrich 31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody Life technologies A-11055
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-250
DRAQ5 (nuclei staining)  Cell Signaling Technology 4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) Sigma-Aldrich E2759-15MG
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Fibronectin Gibco PHE0023
Fluo-4 AM Life technologies F-14201
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml) Gibco 15750-078
Glass coverslip Fisher Scientific 12-548B
Glass Pasteur pippette VWR 14672
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3393-10KU
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza CC-2517
Isopropyl alcohol (IPA) VWR 89125
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-081
Mammalian Ringer Solution Ingredient
NaCl (132 mM) Fisher Scientific S671-3
KCl (4.6 mM) Fisher Scientific P217-500
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) Fisher Scientific C79-500
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) Fisher Scientific M63-500
Glucose (5.5 mM) Fisher Scientific BP350-1
NaHCO3 (5.0 mM) Fisher Scientific S233-500
Hepes Salt (9.1 mM) Research Organics 6007H
Hepes Acid (10.9 mM) Research Organics 6003H
MCDB 131 Culture Medium Life technologies 10372-019
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phalloidin (F-actin staining) Sigma-Aldrich P1951
Phosphate Buffered Saline  Life technologies 14040-133
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation Sylgard 184
Scalpel Exel Int 29552
Scotch tape 3M 34-8711-3070-3
Silicon wafer VWR 14672
SU-8 photoresist MicroChem SU-8 2050 Y111072
SU-8 developer MicroChem Y020100
tissue culture flasks Sigma-Aldrich Z707503-100EA
Triton X-100 Chemical Book T6878
Trypsin Neutralizer solution Gibco R-002-100
Trypsin/EDTA Solution (TE) Gibco R-001-100
Tubing Cole-Parmer PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD
VE-cadherin Santa Cruz Biotechnology SC-6458
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Biosafety Laminar hood NuAire NU-425 Class II, Type A2
CCD camera Hamamatsu ORCA
Confocal microscope Leica TCS SL
Desiccator Bel-Art F42022
Hotplate Wenesco HP-1212
Incubator Forma Scientific 3110
Isotemp oven Barnstead 3608-5
Lithography bench Karl Suss MA6 Contact Lithography
Optical microscope Nikon L200 ND & Diaphod 300
Shutter for the CCD camera Sutter Instrument Lambda 10-2
Plasma cleaner PVA TePla/Harrick plasma M4L/PDC-32G
Spin coater Brewer Science Cee 200X
Syringe pump system Harvard Apparatus 703005
Name of Software Company Catalog Number Comments/Description
CAD software Autodesk AutoCAD 2015
CFD simulation software COMSOL COMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Images acquire and analyse for NO production  Universal Imaging Metafluor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

Tags

Cellular Biology microvaatje endotheliale cellen intracellulaire calcium stikstofoxide VE-cadherine F-actine microfluidics
Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P.… More

Xu, S., Li, X., Liu, Y., He, P. Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production. J. Vis. Exp. (111), e54014, doi:10.3791/54014 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter