Protocol
모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었다. THY1-YFP, PLP-EGFP와 PV-TdTomato 마우스를 실험에 이용했지만, 형광 단백질을 발현하는 마우스를 성공적으로 삭제되고 묘화 될 수있다.
1. 조직 준비
주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA) 및 아크릴 아미드는 독성 및 자극한다. 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호) 이러한 시약을 이용하여 실험을 수행합니다.
- (- 3 분 ~ 2) 호흡이 중단 될 때까지 이소 플루 란의 ~ 1 ml의 안락사 챔버에서 동물을 희생.
- (- 10 분 5) 혈액이 조직에서 제거 될 때까지 ~ 5ml를 설정 연동 펌프를 사용하여 / 분 intracardially 4 ° C에서 관류 액 (표 1)와 마우스를 관류한다.
- 정착액 솔루션에 관류 변경 (표 1)(- 10 분 5) 4 ° C에서 목과 꼬리는 크게 보강 할 때까지.
- 관류를 종료하고 동물 목을 벨. 조심스럽게 제 두개골 주변 결합 조직을 제거한 후, 두개골의 복부 표면으로부터 뼈를 분리 및 20에 기재된 바와 같이, (도 1a)에 뇌를 올려 두개골로부터 뇌를 절개.
참고 : 소뇌의 flocculonodular 로브와 후각 전구를 둘러싼 뼈의 제거에 특별한주의를주십시오.- 조심스럽게 척추 및 척추 사이에 미세, 예리한 가위의 선단을 삽입 (21)에 기술 된 바와 같이, 거리 개별 척주 세그먼트를 절단함으로써 척추의 척추 해부.
- 플라스틱 마우스 뇌 매트릭스에 배치하고 매트릭스 블레이드와 중간 선을 따라 절단하여 뇌 Hemisect.
- 원심 분리 욕조 50 ㎖를 분리하는 각각의 반구와 척수 추가함께 ES ~ 겔 용액 (표 1) 40ml를. 이 시점 앞으로 커버에서 알루미늄 호일로 튜브는 이후의 모든 단계 동안 형광을 보호 할 수 있습니다.
- 부드러운 7 일 (~ 30 회전)을 진탕 4 ° C에서 하이드로 겔의 샘플이 들어있는 튜브를 품어.
2. 중합
- 원심 분리 튜브 하이드로 ~ 25 mL의 시료를 보존하고, ~ 25 ㎖의 하이드로 겔을 버린다.
- 뚜껑을 제거하고 건조기 항아리 원심 튜브를 배치하고, 진공 용기에 접속하여 샘플을 탈산 소화. 솔루션 및 양식 거품 나오는 용해 가스를 허용하기 위해 적어도 10 분 동안 진공을 적용합니다. 부드럽게 거품을 제거 흔들어.
- 3 분 - 2 이상 100 % 질소 가스로 데시 케이 터 항아리에 진공을 교체합니다. 압력 (데시 케이 병의 상부가 개방 될 수있을 경우에) 등화 후 신속 산소의 재 도입을 방지하기위한 튜브 캡.
- 중합체중합이 완료 될 때까지 3 시간 동안 37 ° C의 물 배스에서 샘플 튜브를 배치하여 하이드로 겔이지는. 중합 하이드로 겔은 겔 일관성 (그림 1b)에 걸립니다. 주 : 상단 미 중합 겔 소량 좋다.
- 다음, 원심 분리기 튜브에서 중합 된 샘플을 제거 샘플에서 과량의 하이드로 겔을 절단하기 위해 주걱을 사용합니다.
- 무료 닦아 보풀에 샘플을 배치하고 부드럽게 샘플에 중합 된 하이드로 겔의 얇은 층 뒤에 남겨두고, 마찰과의 조직을 압연하여 나머지 하이드로 겔을 제거합니다.
3. 지질 제거
참고 : 지질 삭제 조직이 취약, 취급에주의. 튜브를 배출 할 때 샘플 손실을 방지하기 위해 셀 스트레이너를 사용합니다. 또한, 샘플은 굴절률 매칭 프로세스 동안 반전 될 수 팽윤성 그러나, 소거 과정을 통해 팽창한다.
주의 : 소디음 도데 실 설페이트 (SDS)와 붕산을 자극한다. 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑과 눈 보호)로를 이용하여 실험을 수행합니다.
- 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 중합 샘플을 전송하고 버퍼 (표 1) 삭제의 45 ml에 추가 할 수 있습니다. 부드러운 흔들림 45 ° C (~ 30 RPM)에 품어. 화학 폐기물에 사용 청산 버퍼를 붓는 신선한 청산 버퍼 ~ 45 ml에 추가하여 초기 7 일간 매일 버퍼를 변경합니다. 형광 물질을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮여 샘플을 함유하는 원심 분리기 튜브를 유지한다.
- 삼일 - 초기 7 일 후, 매 2 ~ 40 ° C 및 교환 청산 버퍼에서 샘플을 품어. 모든 지질을 용해하고 조직 투명성 (그림 1C)에 도달 할 때까지 청소를 계속합니다. 마우스 뇌 반구 6 주에서 2 - - 척수에 대한 사주이 4됩니다.
- 조직이 삭제되면, 전송새로운 50 ML의 원심 분리 관에 시료 잔류 SDS를 제거하기 위해 24 시간 동안 부드러운 진동 (~ 30 RPM)와 40 ° C에서 PBST (표 1)에서 4 번 씻는다.
4. 분자 염색
주의 : 4 ', 6-Diamidino -2- 페닐 인돌 다이 하이드로 클로라이드 (DAPI)의 자극과는 흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호)을 수행해야합니다 사용하는 실험이다.
- 깨끗한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 1X PBST 1 μg의 / ㎖ DAPI, pH를 7.5로 입력합니다. 24 시간 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션. 형광 물질을 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮여 샘플을 함유하는 원심 분리기 튜브를 유지한다.
- 적어도 6 시간 / 세탁 동안 실온에서 PBST 3 회 반복한다.
5. 굴절률 매칭
주의 : 쉬 2,2'- 티 오디 에탄올 (TDE)는 자극이고 어떤 실험을 이용하여흄 후드와 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 장갑, 눈 보호)을 수행 할 수 울드.
- 깨끗한 15 ML의 원심 분리기 튜브에 샘플을 전송하고 30 % 1X PBS에서 (v / v)의 TDE, pH를 7.5로 입력합니다. 24 시간 동안 부드러운 흔들림 40 ° C (~ 30 RPM)에 품어.
- 1X PBS, pH가 7.5에서 63 % (v / v)의 TDE와 교환 30 % TDE. 부드러운 24 시간 동안 진탕 40 ° C에서 품어.
참고 :이 샘플은 약 원래 크기로 다시 축소됩니다. - 편평하고 청결한 표면에 시료의 두께보다 단지 약간 큰 균일 한 직경을 갖는 실린더에 재사용 가능한 접착제의 일부를 롤.
- 개방형 원으로 재사용 접착제 실린더를 마련 (~ 상단에 작은 구멍에 25mm 내경)는 40mm의 유리 바닥 접시에. 교정이 이루어질 필요하면 유리 실린더를 제거하고 면도날로 절단.
- 하여 재사용 가능한 접착제와 유리 사이의 밀봉을 생성하기 위해 P1000 피펫 팁을 사용하여실린더의 외주 주위 압연.
- 장소 ~ 100 ㎕의 63 % 유리 접시 상 TDE 재사용 가능한 접착제의 원 내에있는 유리 표면을 덮도록 주위에 전파.
- 주걱을 사용하여 조심스럽게 기포를 형성하지 않도록주의하면서, 원의 중간 샘플을 놓는다.
- 즉시 재사용 접착제를 통해 40mm 원형 커버 유리를 배치, 직접 샘플에 63 % TDE의 또 다른 100 μl를 피펫.
- 커버 유리 샘플과 연락을 할 때까지 인덱스, 중간, 양손의 약지를 사용하여 조심스럽게 원의 둘레를 누릅니다.
- 천천히, 표면에 휴식 수직 위치로 유리 바닥 접시를 가져 오는 솔루션은 상단에있는 작은 구멍에 도달 할 때까지 다음 피펫 63 % TDE를 추가합니다. 무료 솔루션이 유리에 떨어지지 않도록 피펫 팁을 건조 닦아 보풀을 사용합니다. 챔버에서 거품을 방지하기 위해, 피펫을 완전히 비울 수 없습니다.
- 에작은 구멍은 원형을 넣고 밀폐 된 챔버를 만들기 위해 실리콘 엘라스토머를 추가합니다. 이 영상 전에 건조를 위해 5 분을 기다립니다.
6. 현미경
주의 : 공 초점, 단일 평면 조명과 빛 시트 현미경에 사용되는 레이저는 매우 강력하고 실명의 원인이 될 수 있습니다. 레이저를 이용한 모든 실험은 광범위한 훈련 후 큰주의와 적절한 눈 보호를 수행해야합니다.
- 레이저 스캐닝 공 초점 현미경의 무대에 내부의 샘플 이미징 챔버를 놓습니다.
- 이미징 소프트웨어를 엽니 다 (재료의 표 참조). 아르곤 여기 레이저를 켜려면, 다음 프로그램 레이저 아이콘의 상단에있는 설정 탭을 클릭합니다. 레이저에 전력을 30 %로 슬라이드 규모를 이동 아르곤 옆의 확인란을 선택합니다. 포인터가 천천히 선택한 위치로 워밍업 관찰한다.
- 상단의 획득 탭으로 돌아갑니다. 큰 상자에서 "빔 경로 설정 및# 34; / 부하로 이동 상자를 설정 저장 및 이미지 YFP (527 ㎚)에 대한 적절한 파장 채널을 선택 드롭 다운 메뉴를 선택합니다.
- 채널 설정 상자에서 "현재 객체 목표"라고 표시된 빨간색 하이퍼 링크를 배치함으로써 이미징을위한 적절한 목표를 선택합니다. 탭을 클릭하면 사용 가능한 모든 목표를 열고 선택은 터렛을 자동으로 회전합니다.
- 사용 목적 (예., 10X)이 큰 작동 거리 (조직의 두께보다 더는 묘화 될 예를 들면, 11mm)과 큰 개구 수 (예. 0.3)을 평면 이미지 해상도를 극대화하고 최소화 할 광학 부 두께.
- 1,024 X 1,024에 "형식"이라고 인수 행렬을 설정하는 창 또는 목표의 측면 분해능 한계에 적절한 값 : "해결 XY"를 열고 메뉴를 드롭 다운의 왼쪽 열에서. (가능한 한 낮게 줌 배율을 예. 10.7).
- 같은 창에서 따라 개별적으로 표시된 메뉴를 드롭하여 8 라인 평균 1 프레임 평균 매개 변수를 설정합니다. 신속한 취득이 높은 신호 대 잡음비와 작은 값의 큰 값을 사용한다.
주 : 8 라인 평균 1 프레임의 평균은 약 4 시간에서 마우스 뇌 반구의 고품질 이미지를 획득한다. - 무대 컨트롤을 사용하여 샘플을 찾습니다. 대표적인 필드가 표시되면, 이득 및 오프셋을 설정합니다.
이득 및 조직 유형, 형광에 따라 크게 변화 오프셋 (offset), 및 / 또는 해부학 적 기능을 이미지화되는 참고. YFP를 들어, 이득 780-760로부터 -1.0에서 오프셋을위한 -1.5 값을 설정합니다. - "타일 스캔"을 선택하고 관심 영역의 경계를 선택합니다. 는 z 스택의 설정 상한과 하한 취득합니다. 목적의 광학 부재의 분해능 한계에 기초하여 상기 광학 부재의 두께를 설정한다.
참고 : 목적의광학 부재의 분해능 한계는 주로 그 개구에 의해 규정된다. 자동 목표 값을 적절한 계산할 대부분 현미경 제어 소프트웨어가 사용된다. 0.3의 개구 수와 10X 대물 렌즈의 경우 즉, 약 11 μm의 것이다. - 인수를 시작합니다.
참고 :이 여러 시간이 걸릴 수 있습니다. - 관심의 특정 지역에서 높은 배율 목표를 사용하여 높은 해상도의 이미지를 수집합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
뇌의 구조적 조직을 시각화하는 형태와 연결이 건강과 질병에서 뇌 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 광학 청소 기술은 우리가 응집력 형태와 연결을 연구 할 수 있도록, 손상 조직의 3 차원 이미지 세포 인구에 가능합니다.
세포가 뇌의 신경 연결의 복잡한 패턴을 떨어져 애타게 하나를 허용의 하위 집단에 대한 특이 적 프로모터에 의해 구동 형광 단백질을 발현 마우스. 이러한 생쥐 뇌 (도 2a 및 b) 프로젝션 대뇌 피질 및 해마에있는 신경 세포뿐만 아니라 다른 구조의 서브셋에 YFP 표현 때문에 THY1-YFP 트랜스 제닉 마우스는 광 지우기 문헌에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, YFP + 대뇌 피질의 계층 V 뉴런은의에서 피질 기관을 통해 프로젝트대뇌 피질의 뉴런 (15)의 척수에서 축삭 모욕 및 / 또는 부상의 효과를 평가하는 그들에게 매우 유용하게 PINAL 코드 (그림 2C & D). 광학적 클리어 조직의 공 초점 현미경 및 광학 절편을 사용하여 용이 한 큰 해부학 적 구조에 걸쳐 신경 밀도 차이를 평가할 수있다.
THY1-YFP 트랜스 제닉 마우스 이외에, 트랜스 제닉 마우스의 개수는 이미징 될 수있다. PLP-EGFP 유전자 변형 마우스는 뇌와 척수 (그림 3a)를 통해 프로 테오 단백질 (PLP)를 표현하는 성숙한 희소 돌기 아교 세포에서 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 강화 표현한다. PV-TdTomato 형질 전환 마우스는 소뇌, 줄무늬 및 해마 (그림 3B)에서의 interneurons을 표현 parvalbumin (PV)의 부분 집합에 TdTomato을 표현한다. 심지어 생쥐에서 같은 D 형광 유전자, 작은 분자량 형광 염료를 표현하지 않는API는 쉽게 하이드로 겔 포함 된 조직으로 확산 뇌 (그림 4)에서 세포 핵의 평가를 허용 할 수 있습니다.
그림 1 :. 두개골에서 제거 된 THY1-YFP + 마우스 뇌의 뇌 용지 사진의 다른 단계 (A). 하이드로 겔 포함 THY1-YFP + 마우스 뇌 반구의 (b)의 사진. 지질 제거 (C) 후 THY1-YFP + 마우스 뇌 반구의 사진. 스케일 바는 각 패널에 5mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 뇌 A의 THY1-YFP 식대뇌 피질의 차 척수. THY1-YFP는 + 뉴런과 5 배의 배율로 이미징 및 3D로 재구성 된 해마의 (a). 피질 층 V 피라미드 신경 세포 (B)의 돌기 arborization 시연 대뇌 피질의 10X 화상 스택의 최대 강도 투영. 온전한 경추와 흉추 척수 THY1-YFP 식 5 배 배율에서 영상화 및 3D (c)에서 재구성. 각각의 축삭 (d)를 보여주는 척수의 10X 화상 스택의 최대 강도 투영. 스케일 바는 1 mm입니다 (A), 100 μm의 (b)에 2의 (c)에서 mm, 및 (d)에서 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 뇌의 PLP-EGFP 및 PV-TdTomato 식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 5 배 배율로 몇 군데 손상되지 않은 뇌 반구의 소뇌의 뇌 DAPI 식 DAPI 염색. 이미지는 midsagittal면으로부터 대략 1 mm이다. 삽입 된 10 배 배율에서이 영상의 깊이에서 보이는 세부 사항의 수준을 보여줍니다. 스케일 바인 세트 250 메인 패널에서 μm의 50 μm의 재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 완충기 | 화학 | 최종 농도 |
| 관류 솔루션 | ||
| 10 배 인산 완충 식염수 | 1 배 | |
| 질산 나트륨 | 0.5 % / V w | |
| 헤파린 | 10 U / ㎖ | |
| 정착액 솔루션 | ||
| 10 배 인산 완충 식염수 | 1 배 | |
| Paraformaldehy드 | 4 %의 v / V | |
| 히드로 겔 솔루션 | ||
| 10 배 인산 완충 식염수 | 1 배 | |
| 파라 포름 알데히드 | 4 %의 v / V | |
| 아크릴 아미드 | 4 %의 v / V | |
| 비스 아크릴 아미드 | 0.05 %의 v / V | |
| VA-044 기자 | 0.25 % / V w | |
| 용지 버퍼 | ||
| 붕산 | 200 밀리미터 | |
| 도데 실 황산나트륨 | 4 % / V w | |
| PBST | ||
| 10 배 인산 완충 식염수 | 1 배 | |
| 트리톤 X-100 | 0.1 %의 v / V | |
| 아 지드 화 나트륨 | 0.1 % / V w |
표 1 : 버퍼 및 솔루션의 목록입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
하이드로 겔 포함 된 조직 (수동 CLARITY)의 수동 청소 조직의 큰 조각을 삭제하기위한 간단하고 저렴한 방법이다. 이러한 접근 방식은 전용 설비를 필요로하지 않고, 용이하게 온도 제어 진탕 기에서 수행 될 수있다. 몇 주의 기간 동안, 같은 전체 뇌 또는 척수로도 큰, 매우 유수 조직, 투명하고 현미경에 적합하게 될 것이다. 이 보고서는 CNS 조직의 청산에 초점을 맞추고있다하더라도, 수동 CLARITY 모든 조직에 적용 할 수 있습니다.
광학 정화 기술의 상대적 강점과 약점이 문헌 13,17,22에서 이전에 논의 된,하지만 가장 명확하게 (23)에 배치됩니다. 샘플 다수가 동시에 삭제 및 재현성이 매우 중요하다되고있는 경우 수동 CLARITY 실험에 적합합니다. 티슈는 m을 용이하게하기 위해, 하이드로 겔의 사용은 부가적인 지원을 제공 할ultiple는 조직의 프로빙. 이 보고서에서, 분자량이 작은 염료 DAPI이 입증되었지만, 프로빙 항체 여러 차례이 방법으로도 가능하다.
위에서 설명한 방법은 크게 몇 가지 방법으로 우리의 이전에 게시 된 프로토콜 15을 벗어나. 우선, 현재의 방식에서, 시험편 intracardially 하이드로 관류 않았다. 이 하이드로 겔 조기 불완전 관류 그리고 모순 클리어로 이어지는 배관 및 관류 장치의 바늘 중합 할 수 있다는 사실 때문이다. 수동 CLARITY 기법 (PACT) (17) 3 mm 두께의 조직 절편 - 1 일 배양 1에 사용되는 불구하고 7 일간 하이드로 겔에 파라 포름 알데히드 고정 된 조직을 배양하는 것은, 원래 CLARITY 프로토콜 (14)과 일치한다. 둘째로, 이러한 접근법은 이전에보고 15-17 약간 높은 온도에서 지질의 제거를 행한다. 높은 그리고 온도전자는 지질의 제거를 촉진하지만, 조직의 무결성 (용융)의 치명적인 손실의 가능성에 대해 균형을 이루어야한다. 지질 제거 프로세스의 나머지 (40 ° C까지) 3 ° C로 다음 7 일간 (45 ° C까지) 8 ° C에 의해 배양 온도를 증가함으로써, 조직의 청산이 가속화되지만,의 동시 위험없이 조직 무결성의 손실. 온도 증가는 원래 CLARITY 프로토콜 영동 티슈 반제 (ETC) (50 ° C) (14) 중에보고 된 온도와 일치한다. 또한, 형질 전환되어 발현 형광체 나 DAPI 염색 감소 강도에서 어떠한 감소는 관찰되지 않았다.
탈 산소는 하이드로 겔의 생성에 중요한 단계입니다. 하이드로 겔은 하이드로 겔 용액에 용해 된 산소의 존재 하에서 중합 될 수 있지만, 우리 손 레이트 및 중합 완전성 훨씬 변수 탈산 소화 선수. 가 H 경우ydrogel 가장 일반적인 이유는 하이드로 겔의 산소의 존재이고, 중합하지 않는다.
광 클리어링 프로세스 구현하기 매우 용이하다, 그러나, 이하의 현미경은 매우 복잡 할 수있다. 매우 중요 조직 이미지에 사용되는 목적이다. 목적의 작동 거리가 조직 샘플에 깊이가 할 수있는 이미지를 정의합니다. 2mm의 작동 거리를 가지는 대물는 화상 샘플에 2mm, 따라서 목적의 작동 거리 이미지를 순서대로 완전히을 시료의 두께보다 더 커야 할 수있다. 마찬가지로, 목적의 개구 제한을가 면내 의미하고 획득 할 수 광 부분의 두께를 모두 해결할 수있는 피처들의 크기를 놓는다. 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM) 및 광 시트 현미경 (LSM)은 상기 조명의 특성에 의해 광학 부재의 두께의 한계를 극복 할 수 있지만, 이러한 마이크로대처 널리 사용할 수 없습니다. 높은 개구 큰 작동 거리 목적 희귀하고 고가이지만, 큰 광학 해제 부로부터 고품질 영상에 대한 필요하다.
이미지가 인수되고 나면, 그들은 낮은 해상도 수백 MB에 이르기까지, 종종 매우 큰 (모두와 z 방향면에서)을 LSM에서 수집 한 높은 해상도 이미지에 대한 몇 가지 TB의 이미지입니다. 이미지 분석을 위해 사용 된 컴퓨터의 기억 상당한, 그러나 화상 처리를위한 랜덤 액세스 메모리 (RAM) 대량뿐만 아니라 요구한다. 큰 광학적으로 클리어 이미지 볼륨의 분석에 적합한 소프트웨어 패키지는 아미라, Imaris 및 ImageJ에 14-16을 포함한다.
이 방법의 한계 중 수동 CLARITY는 다른 광학 청소 방법보다 조직을 취소하는 데 시간이 더 필요합니다. 조직의 양을 줄이면 가속 수 작은 조각으로하여 트리밍 절편 클리어 할생이 지질 제거. 이 큰 조직의 확장을 초래할 수 있지만 또한, 하이드로 겔의 파라 포름 알데히드의 농도를 감소시키는 것은 차례로 감소 가교에서,보다 신속한 청소 (17)로 이어지는, 하이드로 겔 기공 크기를 증가 개별 실험자은 소거의 감소 가치 찾을 수도 시각. 또한, 소거 제로 TDE와 함께, 전체 조직 확장의 양이 제한 될 수있다.
이 보고서는 분자량이 작은 염료의 사용을 설명했지만, 프로빙 항체는 매우 자연스러운 다음 단계이다. 하이드로 겔의 존재뿐만 아니라 클리어 조직에 물리적지지를 제공 할뿐만 아니라 깊은 조직에 대한 항체의 침투에 대한 장애물로서 작용한다. 아크릴 아마이드 농도를 감소 또는 파라 포름 알데히드 농도는 항체 17의 침투 촉진 (따라서 가속), 하이드로 겔의 기공 크기를 증가되지만,이 담배 마는에 해로운 영향을 미친다UE 확장. 그럼에도 불구하고, 조직 블록 프로빙 항체는 원래 보고서 (14)에 기재된 아크릴 및 파라 포름 알데히드의 농도를 사용하여 몇 주 일 전뇌 만에 달성 될 수있다.
광학 소거 기술 한 구조 및 기능의 이해를 촉진, 뇌에 깊이보고 할 수있다. 이 새로운 도구는 기관이 가장 복잡한 우리의 이해를 증가, 세포 및 분자 해상도에서 뇌를 시각화하는 연구를 가능하게 할 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 넉넉한 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) 부여 1R01NS086981과 콘래드 N. 힐튼 재단의 보건 / 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 공 초점 현미경과의 귀중한 도움 박사 로랑 Bentolila 박사 마태 복음 Schibler 감사합니다. 우리는 CLARITY 포럼 (http://forum.claritytechniques.org)에 기여한 것들 감사합니다. 우리는 특히이 매혹적인 기술을 가르치는 그의 연구실을 개방 박사 칼 Deisseroth 감사합니다. 저자는 뇌 매핑 의료 연구 조직, 뇌 매핑 지원 재단, 피어슨 - 난봉꾼 재단, Ahmanson 재단, 캐피탈 그룹 회사 자선 재단, 윌리엄 M. 린다 R. Dietel 자선 기금, 그리고 노스 스타 펀드의 관대 한 지원에 감사 . 이 책에서보고 된 연구는 부분적으로 연구 자원을위한 국립 센터와 국가의 이사의 사무실에 의해 지원되었다보너스 번호 C06RR012169, C06RR015431 및 S10OD011939에서 건강의 알 연구소. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
