Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC). THY1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato ratos foram usados para estas experiências, mas nenhum camundongos que expressam proteínas fluorescentes pode ser apagada e fotografada com sucesso.
1. Preparação do Tecido
Cuidado: paraformaldeído (PFA) e acrilamida são tóxicos e irritantes. Realizar experimentos utilizando estes reagentes em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).
- Sacrificar o animal na câmara de eutanásia com ~ 1 ml de isoflurano até que a respiração cessa (~ 2-3 min).
- Usar uma bomba peristáltica ajustado para ~ 5 ml / min para perfundir intracardial o rato com uma solução de perfusão (Tabela 1), a 4 ° C até que o sangue é limpo a partir de tecidos (5 - 10 min).
- Alterar o perfusato a solução fixadora (Tabela 1)a 4 ° C até que o pescoço e a cauda endureceram significativamente (5-10 min).
- Terminar a perfusão e decapitar o animal. Cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio removendo primeiro o tecido conjuntivo em torno do crânio e em seguida a remoção de osso a partir da superfície ventral do crânio e o levantamento do cérebro para fora (Figura 1a), tal como descrito em 20.
Nota: Dê um cuidado especial para a remoção de osso que circunda os lobos flocculonodular do cerebelo e os bulbos olfatórios.- Dissecar a medula espinal a partir da coluna vertebral através da inserção suavemente a ponta de uma fina, tesoura afiada entre a medula espinal e a coluna vertebral e o corte dos segmentos de coluna vertebral individuais embora, tal como descrito em 21.
- Hemisect o cérebro, colocando-o numa matriz de plástico de cérebro de ratinho e de corte ao longo da linha média com uma lâmina de matriz.
- Adicionar cada hemisfério e da medula espinhal para separar 50 ml banheira de centrífugaES com ~ 40 ml de solução de hidrogel (Tabela 1). A partir deste ponto tampa para a frente os tubos com folha de alumínio para proteger os fluoróforos durante todas as etapas subseqüentes.
- Incubar o tubo que contém a amostra em hidrogel a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 7 dias.
2. Polimerização
- Descartar ~ 25 ml de hidrogel, preservando a amostra e ~ 25 ml de hidrogel no tubo de centrifugação.
- Desoxigena-se a amostra removendo a tampa e a colocação do tubo de centrífuga frasco em exsicador e ligar o frasco a vácuo. Aplicar vácuo durante pelo menos 10 minutos para permitir que os gases dissolvidos a sair da solução e formar bolhas. Agite suavemente para desalojar as bolhas.
- Substituir o vácuo no frasco exsicador com gás de azoto a 100% durante 2-3 min. Uma vez que a pressão equaliza (uma vez que a parte superior do frasco exsicador pode ser aberto), rapidamente tampa do tubo para evitar a reintrodução de oxigénio.
- Polímeroize o hidrogel através da colocação do tubo com a amostra num banho de água a 37 ° C durante 3 h até que a polimerização esteja completa. Hidrogel polimerizado irá assumir uma consistência (Figura 1b) do tipo gel. Nota: Uma pequena quantidade de hidrogel não polimerizada no topo é aceitável.
- Usar uma espátula para remover a amostra polimerizada a partir do tubo de centrifugação, depois cortar o excesso de hidrogel a partir da amostra.
- Remover o hidrogel restante, colocando a amostra num fiapos e limpar esfregando suavemente e rolando o tecido nele, deixando para trás apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra.
3. Lipid Remoção
Nota: tecido limpou-Lipid é frágil, punho com cuidado. Use um filtro de células durante a drenagem do tubo para evitar a perda de amostra. Além disso, a amostra irá inchar durante o processo de limpeza, no entanto, o inchaço pode ser invertida durante o processo de harmonização do índice de refracção.
Cuidado: SodiUM sulfato de dodecilo (SDS) e ácido bórico são irritantes. Realizar experimentos utilizando-os em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).
- Transferir a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga de 50 ml limpos e adicionar 45 ml de tampão de compensação (Tabela 1). Incubar a 45 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). Alterar o tampão por dia durante um período inicial de 7 dias por vazamento fora do buffer de compensação usado para resíduos químicos e adicionando ~ 45 ml de tampão de compensação fresco. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos.
- Após os primeiros 7 dias, incubar a amostra a C e troca de compensação tampão 40 ° a cada 2 - 3 dias. Continue compensação até que todos os lipídios são dissolvidos e tecido atinge a transparência (Figura 1c). Isto vai ser de 4 - 6 semanas para um hemisfério cerebral do rato e 2 - 4 semanas para uma medula espinal.
- Uma vez que o tecido é limpo, transferiramostra para um novo tubo de centrífuga de 50 ml e lava-se 4 vezes em PBST (Tabela 1), a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 horas para remover o SDS residual.
4. Coloração Molecular
Cuidado: 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) é um irritante e quaisquer experiências utilizando deve ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).
- Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 1 ug / ml de DAPI em PBST 1x, pH 7,5. Incubar à temperatura ambiente (TA) durante 24 horas. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos.
- Lavar 3 vezes em PBST à temperatura ambiente durante pelo menos 6 h / lavagem.
5. Índice de Refração Matching
Cuidado: 2,2? Tiodietanol (TDE) é um irritante e quaisquer experimentos utilizando-should ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos).
- Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 30% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 h.
- Troca TDE 30% com 63% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave durante 24 horas.
Nota: A amostra vai encolher volta ao tamanho de aproximadamente originais. - Sobre uma superfície plana, limpo rolar um pedaço de adesivo reutilizável para um cilindro com diâmetro uniforme apenas ligeiramente maior do que a espessura da amostra.
- Colocar o cilindro de adesivo reutilizável em um círculo aberto (~ 25 mm de diâmetro interno com uma pequena abertura na parte superior) em um 40 mm prato de vidro de fundo. Se correcções devem ser feitas, remover o cilindro a partir do vidro e cortado com uma lâmina de barbear.
- Utilizar uma ponteira P1000 pipeta para criar um selo entre o adesivo reutilizável e vidro porrolando-o em torno do rebordo exterior do cilindro.
- Lugar ~ 100 mL de 63% TDE para o prato de vidro e se espalhou para cobrir a superfície de vidro dentro do círculo de adesivo reutilizável.
- Usando uma espátula, coloque cuidadosamente a amostra no meio do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas.
- Pipeta mais 100 ul de 63% TDE diretamente sobre a amostra, em seguida, coloque imediatamente a 40 milímetros circular tampa de vidro sobre o adesivo reutilizável.
- Usando o indicador, médio e anelar de ambas as mãos, pressione cuidadosamente ao redor do perímetro do círculo até que a tampa de vidro fez contato com a amostra.
- Lentamente trazer o fundo da placa de vidro para uma posição vertical de descanso de encontro a uma superfície, em seguida, adicionar 63% TDE com uma pipeta até que a solução atinge a pequena abertura na parte superior. Usar um cotão livre limpe para secar a ponta da pipeta de modo a que a solução não goteje sobre o vidro. Para evitar bolhas na câmara, não esvaziar a pipeta de todo o caminho.
- Paraa pequena abertura, adicionar de elastómero de silicone para delimitar o círculo e criar uma câmara fechada. Espere 5 minutos para secar antes de imagem.
6. Microscopia
Cuidado: Os lasers usados em confocal, iluminação plano único e microscopia folha de luz são muito poderoso e pode causar cegueira. Quaisquer experiências utilizando lasers deve ser realizada após o treinamento extenso e com grande cuidado e proteção para os olhos adequada.
- Coloque a câmara de imagem com a amostra dentro no palco de um microscópio de varredura a laser confocal.
- Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais). Para ligar o laser de argônio de excitação, clique na guia de configuração na parte superior do programa, em seguida, no ícone do laser. Verifique a caixa ao lado de argônio para energizar o laser e mover a escala deslizante para 30%. Observar o ponteiro lentamente aquecer para a posição seleccionada.
- Retornar à guia adquirir no topo. Na caixa grande "Configurações caminho do feixe &# 34; ir para a carga / salvar caixa de configuração e selecione o menu drop-down para selecionar um canal de comprimento de onda adequado para a imagem YFP (527 nm).
- Selecione objectivos adequados para imagiologia por localizar a hiperligação vermelho escrito "objetivo: objeto atual" abaixo da caixa de configurações do canal. Ao clicar na guia abre todos os objetivos disponíveis e uma selecção irá girar automaticamente a torre.
- Utilização objectivos (por ex., 10X), com um raio grande de trabalho (maior do que a espessura do tecido a ser visualizado, por exemplo: 11 mm) e uma grande abertura numérica (por ex., 0,3) para maximizar no plano resolução de imagem e minimizar espessura de corte óptico.
- Na coluna à esquerda da menus drop-down, abra o "XY: resolução" janela para definir matriz de aquisição, chamado de "formato", a 1.024 x 1.024 ou um valor adequado para o limite de resolução lateral do objectivo. Defina o fator de zoom mais baixo possível (por exemplo., 10,7).
- Na mesma janela, jogo 8 média de linha e um quadro de parâmetros médios por cair para baixo os menus marcados individualmente em conformidade. Use valores grandes para uma alta relação sinal-ruído e valores pequenos para a aquisição rápida.
Nota: 8 médias de linha e uma média quadro vai adquirir imagens de um hemisfério do cérebro do rato de alta qualidade em aproximadamente 4 horas. - Localize a amostra usando os controles do estágio. Uma vez que um campo representativo é visível, definir o ganho e offset.
Nota: O ganho e offset variará substancialmente com base no tipo de tecido, fluoróforos, e / ou característica anatômica a ser trabalhada. Para YFP, definir valores de 760-780 para o ganho e de -1,0 para -1,5 para o deslocamento. - Selecione "varredura telha" e selecione os limites da região de interesse. Definir os limites superior e inferior do z-stack a ser adquirido. Definir a espessura da secção óptica baseado em secção de limite de resolução óptica do objectivo.
Nota: Um objetivo dolimite de resolução óptica secção é definida principalmente pela sua abertura numérica. A maioria dos softwares de controle microscópio irá calcular automaticamente um valor apropriado para o objetivo que está sendo usado. Para uma objectiva 10X com uma abertura numérica de 0,3 que seria de aproximadamente 11 uM. - Iniciar a aquisição.
Nota: Isso pode demorar vários horas. - Coletar imagens de alta resolução usando objectivos maior ampliação de regiões específicas de interesse.
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Representative Results
Visualizando a organização estrutural do cérebro é fundamental para a compreensão de como morfologia e conectividade afetar a função cerebral na saúde e na doença. técnicas de limpeza ópticas tornam possível a populações de células de imagem em 3D em tecidos intactos, o que nos permite estudar a morfologia e conectividade coesa.
Os ratinhos que expressam proteínas fluorescentes impulsionado por promotores específicos para sub-populações de células permitir uma para provocar uma separação do complexo padrão de conectividade neural no cérebro. Ratinhos transgénicos THY1-YFP foram utilizados extensivamente na literatura de compensação óptica porque estes ratinhos expressam YFP em um subconjunto de neurónios de projecção que residem no córtex cerebral e no hipocampo, bem como outras estruturas no cérebro (Figura 2a e b). Além disso, YFP + neurônios corticais camada V do projeto através do trato corticospinal nos sPinal cabo (Figura 2c & d), tornando-os muito útil para avaliar o efeito do insulto axonal e / ou lesões na medula espinal em neurónios corticais 15. Através da utilização de microscopia confocal e seccionamento de tecidos óptica opticamente apuradas pode facilmente avaliar as diferenças na densidade neuronal através de grandes estruturas anatómicas.
Além de ratinhos transgénicos THY1-YFP, qualquer número de ratinhos transgénicos podem ser trabalhada. Camundongos transgênicos PLP-EGFP expressa reforçada verde proteína fluorescente (EGFP) em oligodendrócitos maduros que expressam a proteína proteolip�ica (PLP) em todo o cérebro ea medula espinhal (Figura 3a). Ratinhos transgénicos PV-TdTomato expressar TdTomato em um subconjunto de parvalbumina (PV) que exprime interneurónios no cerebelo, corpo estriado e hipocampo (Figura 3b). Mesmo em ratinhos que não expressam transgenes fluorescentes, corantes fluorescentes de pequeno peso molecular, tais como DAPI, pode difundir facilmente para os tecidos de hidrogel incorporado e permitem a avaliação dos núcleos celulares no cérebro (Figura 4).
Figura 1:. Diferentes Fases do Cérebro Clearing Fotografia do cérebro THY1-YFP + mouse que tem sido retirados do crânio (a). Fotografia de THY1-YFP + rato hemisfério cerebral incorporado-hidrogel (b). Fotografia de THY1-YFP + rato hemisfério cerebral após a remoção de lipídios (c). Barras de escala são 5 mm em cada painel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão THY1-YFP no cérebro de umnd medula espinhal. Thy1-YFP + neurônios no córtex cerebral e hipocampo fotografada em 5X e reconstruída em 3D (a). Uma projeção de intensidade máxima de uma pilha de 10X do córtex cerebral demonstrando a arborização dendrítica de neurônios camada V piramidais corticais (b). expressão THY1-YFP em uma medula espinhal cervical e torácica intacta fotografada em 5X e reconstruída em 3D (c). Uma projeção de intensidade máxima de uma pilha de 10X da medula espinhal demonstrando axônios individuais (d). Barras de escala são de 1 mm de (a), 100 mm em (b), 2 mm em (c), e 100 mm em (d). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: PLP-EGFP e PV-TdTomato expressão no cérebro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração DAPI na expressão DAPI cerebral no cerebelo de um hemisfério cerebral intacta fotografada em 5X.. A imagem é de aproximadamente 1 mm do plano sagital mediano. A inserção mostra o nível de detalhe visível a essa profundidade de imagens em aumento de 10x. Escala de barras de umre 250 mm no painel principal e 50 mm na inserção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amortecedor | Químico | A concentração final |
| solução de perfusão | ||
| 10x tampão fosfato salino | 1x | |
| nitrato de sódio | 0,5% w / v | |
| heparina | 10 U / ml | |
| solução fixadora | ||
| 10x tampão fosfato salino | 1x | |
| Paraformaldehyde | 4% v / v | |
| solução de hidrogel | ||
| 10x tampão fosfato salino | 1x | |
| paraformaldeído | 4% v / v | |
| acrilamida | 4% v / v | |
| Bis-acrilamida | 0,05% v / v | |
| VA-044 Iniciador | 0,25% w / v | |
| tampão Clearing | ||
| Ácido bórico | 200 mM | |
| Dodecilsulfato de sódio | 4% w / v | |
| PBST | ||
| 10x tampão fosfato salino | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% v / v | |
| A azida de sódio | 0,1% w / v |
Tabela 1: Lista de tampões e soluções.
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Discussion
clearing passiva de tecidos de hidrogel incorporado (clareza passiva) é um método simples e barato para limpar grandes pedaços de tecido. Esta abordagem não requer equipamento específico e pode ser facilmente realizada num agitador com temperatura controlada. Durante o período de algumas semanas, mesmo grandes, tecidos altamente mielinizados, como um cérebro inteiro ou medula espinhal, vai se tornar transparente e adequado para microscopia. Embora este relatório concentrou-se a limpeza de tecidos do SNC, Clareza passiva pode ser aplicado a qualquer tecido.
Os pontos fortes e fracos de técnicas de limpeza ópticos foram discutidos anteriormente na literatura 13,17,22, mas são mais claramente definidos em 23. Clareza passiva é bem adequado para experiências em que um grande número de amostras simultaneamente, estão a ser apagada e a reprodutibilidade é de grande importância. A utilização de um hidrogel para fornecer suporte adicional ao tecido facilita multiple sondagem do tecido. Neste relatório, uma pequena corante peso molecular, DAPI, foi demonstrada, mas várias rodadas de anticorpo sondagem também são possíveis com esta abordagem.
A abordagem descrita acima se desvia do nosso protocolo publicado anteriormente 15 em um par de formas significativas. Em primeiro lugar, no actual abordagem, os espécimes foram perfundidos não intracardial com hidrogel. Isto deveu-se ao facto de o hidrogel pode prematuramente polimerizar na tubagem e agulhas do aparelho de perfusão, levando a perfusões incompletos e de compensação inconsistente. A incubação de tecidos fixados em paraformaldeído hidrogel durante 7 dias é consistente com o protocolo original de 14 Clareza, apesar de uma incubação de um dia é utilizado para 1 - 3 mm de espessura secções de tecido na técnica Clareza passiva (PACT) 17. Em segundo lugar, esta abordagem efectua a remoção de lípidos a uma temperatura ligeiramente mais elevada que a previamente relatada 15-17. temperatur superiore acelera a remoção de lipídios, mas deve ser equilibrado com a possibilidade de uma perda catastrófica da integridade do tecido (fusão). Ao aumentar a temperatura de incubação de 8 ° C (a 45 ° C) durante 7 dias e, em seguida, 3 ° C (40 ° C) durante o restante do processo de remoção de lípidos, limpeza de tecidos é acelerado, sem o risco concomitante de a perda da integridade do tecido. Este aumento de temperatura é consistente com as temperaturas reportadas durante electroforética de Compensação do tecido (etc) no protocolo de Clareza inicial (50 ° C) 14. Além disso, não houve diminuição da intensidade de fluoróforos expressas transgenicamente, nem diminuição da coloração de DAPI foi observada.
A desoxigenação é um passo importante na criação do hidrogel. O hidrogel pode polimerizar na presença de oxigênio dissolvido na solução de hidrogel, mas em nossas mãos a taxa e integridade de polimerização foi muito mais variável sem desoxigenação. Se o hO ydrogel não polimerizar, o motivo mais comum é a presença de oxigênio no hidrogel.
O processo de compensação óptica é notavelmente fácil de implementar, contudo, a microscopia que se segue pode ser bastante complicado. De importância fundamental são os objectivos utilizados para a imagem do tecido. A distância de trabalho de um objetivo define a profundidade que ele pode imagem em uma amostra de tecido. Um objectivo, com uma distância de trabalho de 2 mm podem única imagem 2 milímetros em uma amostra, por conseguinte, a distância de trabalho de um objectivo deve ser maior do que a espessura da amostra, a fim de imagem-a completamente. Do mesmo modo, a abertura numérica de um objectivo coloca um limite do tamanho de recursos que ela pode resolver ambos no plano e a espessura das secções ópticas que ele pode adquirir significativamente. Selective plano de iluminação Microscopia (SPIM) e folha de Microscopia de Luz (CLS) pode ultrapassar a limitação de espessura de corte óptico pela natureza da iluminação, mas estes microslida não estão amplamente disponíveis. alta abertura numérica, os objectivos de grande distância de trabalho são raros e caros, mas são necessárias para geração de imagens de alta qualidade a partir de grandes secções opticamente limpas.
Uma vez que as imagens tenham sido adquiridos, eles são frequentemente muito grandes, variando a partir de várias centenas de MB de baixa resolução (tanto no plano e a direcção z) para alguns TB para uma imagem de alta resolução recolhidas numa LSM. Os computadores utilizados para análise de imagem exigem não só uma grande quantidade de armazenamento, mas grandes quantidades de memória de acesso aleatório (RAM) para o processamento de imagem. Pacotes de software adequado da análise de grandes volumes de imagens opticamente apuradas incluem Amira, Imaris e ImageJ 14-16.
Entre as limitações desta abordagem, CLARITY passiva requer mais tempo para limpar tecidos do que outras abordagens de compensação óptica. Diminuindo o volume do tecido a ser limpo por recorte ou corte em pedaços mais pequenos podem accelrar lipídico-remoção. Além disso, diminuindo a concentração de paraformaldeído no hidrogel, por sua vez diminuição de reticulação e aumentar o tamanho hidrogel poros, levando a compensação mais rápida 17, embora isso possa levar a uma maior expansão do tecido, experimentadores individuais pode achar que vale a pena a diminuição da compensação Tempo. Além disso, combinado com TDE como um agente de eliminação, a quantidade de expansão total do tecido pode ser limitada.
Embora este relatório descreve o uso de pequenas corantes peso molecular, o anticorpo de sondagem é um passo muito natural. A presença do hidrogel não só proporciona suporte físico para os tecidos apuradas, mas também serve como um impedimento para que a penetração de anticorpos profundamente no tecido. Diminuir a concentração de acrilamida ou paraformaldeído a concentração vai aumentar o tamanho dos poros no hidrogel, facilitando (e, assim, acelerar) anticorpo penetração 17, mas este tem um efeito deletério sobre tissue expansão. No entanto, o anticorpo sondagem de blocos de tecido pode ser realizado em questão de dias e em todo o cérebro de um par de semanas utilizando as concentrações de acrilamida e paraformaldeído descritos no relatório original 14.
técnicas de limpeza ópticas permitem olhar profundamente no cérebro, promovendo a compreensão da sua estrutura e função. Estas novas ferramentas vão permitir aos investigadores para visualizar o cérebro em resoluções celulares e moleculares, aumentando a nossa compreensão da mais complexa de órgãos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi generosamente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NIH / NINDS) concessão 1R01NS086981 eo Hilton Fundação Conrad N.. Agradecemos ao Dr. Laurent Bentolila e Dr. Matthew Schibler por sua inestimável ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a todos os que contribuíram para o fórum CLAREZA (http://forum.claritytechniques.org). Agradecemos especialmente Dr. Karl Deisseroth para a abertura de seu laboratório para ensinar essa técnica fascinante. Os autores são gratos pelo apoio generoso da Organização Mapeamento Cerebral investigação médica, fundação Mapeamento Cerebral Suporte, Pierson-Lovelace Foundation, a Fundação Ahmanson, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. e Linda R. Fund Filantrópica Dietel e Fundo Northstar . Pesquisa relatada nesta publicação também foi parcialmente apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e pelo Escritório do Diretor da Naçãoal Institutes of Health, com os números premiados C06RR012169, C06RR015431 e S10OD011939. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
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