Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af Animal Center for Biomedicinsk Eksperimenteren på Gyeongsang National University.
1. Forberedelse af Animal Procedure
- Forbered den voksne kvindelige minigrise for den ikke-invasive samling af MSC'er fra knoglemarv og synovialvæske. Udfør den kliniske undersøgelse af de minigrise en dag før anæstesi og prøvetagning.
- Giv klinisk normale dyr for fysiske undersøgelser, som omfatter kropstemperatur, respirationsfrekvens, og puls, og til observation af grisenes adfærd og hæmatologiske status, ved hjælp af komplet blodtælling test.
Bemærk: Parameter intervaller for klinisk sunde minigrise er 11-29 / min for respiration sats, 68-98 / min for puls, og 37 - 38 ° C til kropstemperatur.
- Giv klinisk normale dyr for fysiske undersøgelser, som omfatter kropstemperatur, respirationsfrekvens, og puls, og til observation af grisenes adfærd og hæmatologiske status, ved hjælp af komplet blodtælling test.
- Fjern alle spiselige strøelse fra buret i den præoperative faste periode af 6 - 12 timer prior til administrationen af anæstesi for unge og voksne minigrise, bør overholdes 3 timer af fastende for nyfødte. Tilvejebringe drikkevand indtil tidspunktet for anæstesi.
2. Forberedelse af Dyr til Anæstesi
- Medicate de minigrise før administration af anæstesi med acepromazin (0,1 mg / kg), medetomidin (0,03 mg / kg), og atropin (0,04 mg / kg).
- Injicere al medicin intramuskulært (IM) ved anvendelse af en 21 G nål med en længde på mindst 30 mm for voksne minigrise. Udfør IM injektion 1-3 cm bag øret i den laterale cervikale muskel eller i lårmusklen.
Bemærk: Udfør alle de procedurer uden at fremkalde frygt eller stress hos dyrene eller kræver hårdhændet behandling til sikkert injicere præmedicinering.
- Injicere al medicin intramuskulært (IM) ved anvendelse af en 21 G nål med en længde på mindst 30 mm for voksne minigrise. Udfør IM injektion 1-3 cm bag øret i den laterale cervikale muskel eller i lårmusklen.
- Placer minigrise i en dorsal-liggende stilling.
- Femten minutter efter administration af præmedicinering, indleder bedøvelse ved hjælp af 1,5% isofluran adminstreret ved indånding.
- Fortsæt indånding af isofluran (1,5%) gennem et endotrachealt rør, efterfulgt af en stigning i koncentrationen til 2,5%, med oxygen (1,5 l / min) som bæregas.
- Løbende overvåge puls, kropstemperatur, og perkutan blod iltmætning (SpO 2) af minigrise under anæstesi. Brug en cirkulerende vand tæppe ved en temperatur på 38 - 39 ° C for at opretholde legemstemperatur. Påfør en oftalmologisk salve for at beskytte øjnene tørrer ud under anæstesi.
- Følg Guedel klassificering til at vurdere dybden af anæstesi 13.
3. Forberedelse af Cell Isolation og Dyrkning
- At dyrke MSC'erne afledt fra knoglemarv og synovialvæske, forberede 500 ml fremskreden Dulbeccos modificerede Eagle-medium (ADMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor factor (bFGF) og 1,0% penicillin-streptomycin (10.000 IU og 10.000 ug / ml, Pen-Strep).
- Inkuber ADMEM ved 38,5 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 i en CO2-inkubator.
- Forbered 500 ml Dulbeccos phosphatbuffer saltvand (DPBS) ifølge producentens anvisninger for celleisolering og vask.
4. Indsamling knoglemarv fra minigrise
- Vælg et område cirka 15 x 15 cm i størrelse på hoftebenskammen (figur 1), og fjerne hår fra dette område ved hjælp af steriliserede barbermaskiner eller elektriske neglesaks. Når smågris er anbragt, skrubbe skiftevis proceduren websted tre gange med følgende steriliseringsmidler: povidoniod og 70% ethanol. Efter området er helt tørt, anvende sterile forhæng.
- Pre-coat 10 ml sprøjte med 100 U / ml heparin ved at skylle den med 3 - 4 ml heparin før ejecTing anti-koagulerende middel.
Bemærk: Udfør dette trin for at undgå koagulation i sprøjten under knoglemarven aspiration. - Uddrag mindst 5 ml knoglemarv fra crista iliaca knogle af minigrise under anæstesi ved anvendelse af en knoglemarvstransplantation extractor (3,0 x 100 mm) stramt fastgjort til heparin pre-coated 10 ml sprøjte.
5. Isolering af celler udvundet fra knoglemarv og in vitro dyrkning
- Isoler cellerne fra den ekstraherede knoglemarv.
- Fortynd den ekstraherede knoglemarven med et tilsvarende volumen af DPBS i et 15 ml konisk rør ved stuetemperatur.
- Tilsæt 3 ml densitetscentrifugering medier (Ficoll-Paque) til 15 ml konisk rør.
- Fortynd en 4 ml lag af knoglemarven med DPBS, som er placeret på densitetscentrifugering medier uden opblanding og centrifugeres den ved 400 x g i 40 minutter ved stuetemperatur.
- Høst laget af mononukleære celler(MNC'er) fra buffy coat mellem de to lag indeholdende plasma (øverste lag) og densitetscentrifugering medier (nederste lag), og overføre MNC'er i et 15 ml konisk rør.
- Fortynd de overførte MNC'er med 7 - 8 ml DPBS og centrifuger dem ved 500 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og vask af cellerne to gange med DPBS.
- Cellepelletten suspenderes i 2 ml ADMEM og overføre den til en 35 mm vævskulturskål. Inkubér dyrkningsskålen ved 38,5 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.
- In vitro dyrkning af celler isoleret fra knoglemarv.
- Efter 48 timer aspireres mediet med cellerne, der ikke er knyttet til skålen, og erstatte 2 ml af ADMEM og inkuberes den ved 38,5 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. Skift medium hver tredje dag.
- Ved 70 - med 80% sammenflydning, vaskes cellerne med DPBS, adskille dem med 1 ml 0,25%trypsin / EDTA, og inkubere dem ved 37 ° C i 3 - 5 min, indtil cellerne løsnes.
- Cellerne høstes under anvendelse af 10 ml ADMEM, overføre dem til en 15 ml konisk rør, og centrifugeres dem ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
- Hæng de høstede celler i 1 ml frisk ADMEM og tælle dem ved hjælp af et hæmocytometer.
- Placer cellerne i en 5 - 7,5 x 10 5 / 25T kolbe indeholdende 4 ml ADMEM og inkubere dem ved 38,5 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. Skift medium hver tredje dag.
6. Indsamling af Synovialvæske fra minigrise
- Svarende til proceduren for knoglemarv aspiration, vælge en passende areal på ca. 15 x 10 cm (længde / bredde) over femoralis fælles, og fjerne hår ved hjælp steriliserede barbermaskiner eller elektriske neglesaks, følg med desinficering procedurer (trin 4.1).
- Indsæt en 3 ml sprøjte med en 23 Gnål i leddet efter palpering vartegn (patella og tibia crest).
- Påfør blid sugning til sprøjterne for aspiration af ledvæske i leddet. Det omtrentlige volumen af synovialvæske opsamlet fra et fælles er 0,5 - 1 ml, men dette varierer efter størrelsen af smågris eller leddet. Skylle gennem DPBS i synovialkaviteten hvis det opsamlede volumen af synovialvæsken er for lille.
- trække Umiddelbart sprøjten for at undgå forurening med blod.
7. Cell Isolation fra Indsamlet Synovialvæske og in vitro dyrkning
- Isoler af cellerne fra aspirerede ledvæske.
- Fortynd aspireret synovialvæsken med et tilsvarende volumen af DPBS i et 15 ml konisk rør ved stuetemperatur.
- For at fjerne snavs, filtrere den fortyndede ledvæske ved hjælp af en 40 um nylon celle si.
- Der tilsættes 10 ml DPBS til rør indeholdende den filtrerede synovialvæske og centrifugeres den ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og vask af cellerne to gange med DPBS.
- Cellepelletten suspenderes i 2 ml ADMEM, placere cellerne på en 2 - 3 x 10 5 celler / 35 mm vævskulturskål med 2 ml ADMEM, og inkubere dem ved 38,5 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 .
- Gentag trin 5.2 til in vitro dyrkning af isolerede synovialvæske MSC'er.
8. Post-procedure Pleje af minigrise
- Hvis det er nødvendigt, at lukke huden på knoglemarven emhætte injektionsstedet med en enkelt sutur ved hjælp af en hud hæftemaskine, efter knoglemarven kollektion.
- Efter at proceduren er afsluttet, indgivelse af en intramuskulær injektion af enrofloxacin (5 mg / kg) og meloxicam (0,2 mg / kg) til de minigrise én gang dagligt i 3 dage.
- Efter at proceduren er afsluttet, desinficere knoglemarven og synovialvæske opsamlingsstedetmed 0,1% povidoniod gang om dagen i 3 dage. Observere omhyggeligt dagligt at overvåge for tegn på komplikationer (fx hævelse, pus eller rødme).
9. Cell fænotype anvendelse af flowcytometri
- Når MSC'erne er 70 - 80% sammenflydende ved passager 3 - 5, vask af cellerne med DPBS og behandle dem med 1 ml 0,25% (v / v) Trypsin / EDTA. Derefter inkubere dem ved 37 ° C i 3 - 5 min, indtil cellerne er fritliggende.
- Cellerne høstes under anvendelse af 10 ml DPBS, overføre dem til en 15 ml konisk rør, og centrifugeres dem ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres opløsningen.
- For at rette cellerne, suspendere cellepelleten i 10 ml af en 3,7% formaldehyd-opløsning og holde dem ved 4 ° C i en dag før analysen.
- En dag efter montering, vaske cellerne med DPBS to gange med centrifugering ved 300 x g i 5 min hver gang. Supernatanten kasseres opløsningen.
- Cellepelletten suspenderes i 4 mlDPBS, som er suppleret med 1% (vægt / volumen) bovint serumalbumin (BSA), og inkuber pelleten i 1 time ved 4 ° C for at blokere ikke-specifikke Fc-medierede interaktioner.
- Fordel 500 pi prøver af cellesuspensionen i 1,5 ml rør.
- For ikke-konjugerede antistoffer (CD29 og vimentin), vask af cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 3 min. Supernatanten kasseres opløsningen.
- Cellepelletten suspenderes i 500 pi af en 1: 100 fortynding af det primære antistof og inkuber det i 1 time ved 4 ° C.
- Vask cellerne to gange med 1% bovint serumalbumin ved centrifugering ved 300 x g i 5 min hver gang. Supernatanten kasseres opløsningen.
- Cellepelletten suspenderes i 500 pi af en 1: 100 fortynding af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret sekundært antistof og inkuber det i 1 time i mørke ved 4 ° C.
- For FITC-konjugerede antistoffer (Isotype, CD34, CD44 og CD45), vaskes cellerne ved centrifugelse på 300 × g i 3 min. Supernatanten kasseres opløsningen.
- Cellepelletten suspenderes i 500 pi af 1: 100 FITC-konjugeret antistof og inkuberes det i 1 time i mørke ved 4 ° C.
- For begge farvningsbetingelser vaskes cellerne to gange med DPBS ved centrifugering ved 300 x g i 5 min hver gang. Supernatanten kasseres opløsningen.
- Suspendere cellerne i 500 pi af DPBS, overføre dem i en 5 ml rundbundet rør, og analysere resultaterne ved anvendelse af et flowcytometer 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering af MSC'er afledt af knoglemarv og Synovialvæske af minigrise
MSC'er lykkedes isoleret fra knoglemarven og artikulære synoviale led på minigrise og ekspanderes in vitro (figur 2). Sprøjte aspiration af ledvæske er enkel, og det er muligt at opnå tilstrækkelige adhærente celler under in vitro dyrkning af de primære celler. Morfologien af synovial-væske MSC'er er svarer til den for knogle-MSC'er, og begge MSC'er har en fibroblastisk spindel form og er homogent vedhængende. De blev observeret at have en positiv ekspression for alkalisk phosphatase (AP) farvning, efter tredje subkultur var fuldstændig.
Evaluering af Cell Fænotype af MSC Afledt af knoglemarv og Synovialvæskeaf minigrise
Assays af celleoverflademarkørerne blev udført for at skabe en fænotype af Knoglemarven og synovial-væske-afledte MSC'er af minigrise. Begge typer af MSC'er udtrykte signifikante mængder af positive celleoverflademarkører, såsom CD29, CD44, og vimentin (≥96 - 99% af de positive celler), medens udtrykkene for CD34 og CD45 var negative og lav (≤2% af positive celler) (figur 3). Disse resultater var identiske med dem, der opnås fra markante MSC, herunder celler isoleret fra ledvæske, og der var ingen signifikante forskelle i celleoverflademarkører mellem disse MSC'erne. De celler isoleret fra knoglemarv og ledvæske er blevet bekræftet som MSC'er i vores tidligere undersøgelse 8. Både knogle marrow- og synovialvæske MSC'er udtrykte stamcelle transkriptionelle faktorer (Oct3 / 4, NANOG, og Sox2); endvidere en in vitro differentiering evne hsom er blevet bekræftet ikke kun ind i mesenkym afstamning (osteocytter, adipocytter og chondrocytter), men også neurale celler ved cytokemisk farvning og påvisninger af cellespecifik genekspression 8.
Figur 1. Placering af hoftebenskammen af minigrise. Den røde pil repræsenterer site på hoftebenskammen anvendes til knoglemarven samlingen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. MSC'er afledt fra knoglemarven og synovialvæske af minigrise. (A) Den homogene morfologi af primære kulturer af MSC'er afslørede en fibroblastisk form. (B) Farvning med blanding af5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat og nitro blå tetrazolium (BCIP / NBT) afslørede AP aktivitet i MSC'erne ved passage 3. Scale bar: 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyse af celleoverflademarkører af MSC'er afledt fra knoglemarven og synovialvæske af minigrise ved passage 3. celleoverflademarkører af MSC'er blev identificeret under anvendelse af en flowcytometrianalyse, og MSC'er blev identificeret som værende positive for CD29, CD44 og vimentin og negativ for CD34 og CD45. klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigrise blev anvendt til at etablere MSC'er isolation fra knoglemarv og synovialvæske. For at eliminere forskellige fysiologiske tilstande, såsom alder, køn og sygdom, blev minigrise fra isogene baggrund donorer valgt til nøjagtigt vurdere cellekilde afhængige karakterisering. Grise er kendt for at være anatomisk, fysiologisk og genetisk ligner mennesker, og især, minigrise kan producere size-matchede organer; Derfor kan de bruges som en erstatning donor art til xenotransplantation 14,15. Vedrørende nylig foreslået immunmodulerende egenskab af MSC'er, indolamin 2, 3-dioxygenase (IDO) og nitrogenoxidsyntase (NOS) blev anvendt med MSC'er til at mediere immunosuppression, som er artsspecifik, selvom MSC'er fra svin og mennesker har samme IDO 9 . Således kan en gris model som en MSC donor give vigtig indsigt i de immunreaktioner af MSC for menneskelige behandlingsformer. Endvidere forskning af den porcine stamcellerceller spiller en vigtig rolle i den biologiske forståelse af in vitro processer og deres forskellige prækliniske anvendelser i mennesker 16,17. Knoglemarv og synovialvæske kan være ikke-invasivt høstet fra minigrise. Hele proceduren, fra anæstesi til prøve indsamling, reduceret stress niveauet af systemiske eller lokale organer; derfor kan minigrise anvendes som recipienter for autolog transplantation. I dette eksperiment blev MSC'er isoleres fra knoglemarven og synovialvæske af minigrise, baseret på bekræftelse af synovial-væske MSC'er med immunosuppression kapacitet afledt fra en RA musemodel i en tidligere undersøgelse 8
Indsamling af knoglemarv fra minigrise
Hos svin, voksne stamceller afledt af knoglemarv er multipotente og har fremkaldt neovaskularisering og cardiomyocyte regenerering. Alderen på en donor er forbundet med øget fedtindhold ognedsat proliferation og differentiering af knoglemarv; derfor, knoglemarv er ikke den bedste kilde til MSC'er gamle dyr. Den hoftebenskammen i minigrise er det foretrukne site for knoglemarv-afledte MSC isolation, fordi det er bredt og er en lav risiko procedure site for iskiasnerven skade. I tilfælde af ældre eller overvægtige minigrise, kan fedt-berigede tykke muskler være til stede på hoftebenskammen. Under sådanne omstændigheder er en stikkende indsnit på huden nødvendig og knoglemarvsbiopsi nålen skal indsættes korrekt, hvilket kan være vanskeligt at anvende på hoftebenskammen. Manglende finde den korrekte biopsisted kan føre til mislykkede knoglemarvsceller forhåbninger fordi nålen bliver blokeret af knoglen eller måske ikke være i stand til at nå knoglemarven inde hoftebenskammen. Derfor skal biopsinålen kontrolleres ordentligt, og viden om tykkelsen af blødt væv og cortex af knoglen af hoftebenskammen er påkrævet, før der begynder prøvesamlinger.
Aspiration af Synovialvæske fra leddene i minigrise
Synovialvæske findes i hulrummet i synovialled, og rumfanget af synovialvæsken øges sædvanligvis i betændte led. Synovial-væske MSC'er er taget fra foretrukne kandidat sites for bruskregenerering, både in vivo og in vitro. Derudover er de blevet vist at fremkalde immunmodulerende egenskaber i RA 8. Synovialvæsken er ikke kun en let tilgængelig kilde, men har også værdifulde mesenchymale egenskaber. Begrænsninger ved brug af synovialvæske som kilde for MSC'er er de forskellige volumener, der findes i leddene baseret på de varierende størrelser og patologiske tilstande i led og vanskeligheden ved anvendelse af en 3 ml sprøjte til synovialvæske aspiration fra leddene. Derfor bør størrelsen af sprøjten være 5 - 10 ml med højt tryk. Desuden skylning af synovialvæsken med 1 - 2 ml DPBS fra en sprøjteforetrækkes. Ved at bruge denne metode kan der opnås et stort antal celler, selv fra små rum i leddene.
Beskrivelser af de Bone-marrow- og synovial-væske MSC'er af minigrise
Hos mennesker er de morfologier af synovial-væske- og synovial-membran-afledte MSC'er fra osteoarthritis patienter er ens men smallere end morfologien af knogle-MSC'er 12. Men i in vitro kulturer blev morfologier begge synovial-væske-afledte MSC'er og knoglemarv-afledte MSC'er observeret at være ens i dette eksperiment. I forskernes tidligere undersøgelse, spredning evne synovial-væske-afledte MSC var høj, sammenlignet med knogle-MSC'er 8.
MSC er etableret fra forskellige væv kilder i voksne donorer; derfor, ikke-invasivt opnået væv-Source MSC'er er værdifulde til autolog stamcelletransplantation therapy. Cellekilden er afhængig af de karakteriseringer og kapacitet af sygdommen eller formål stamcelleterapi. Hos svin, voksne stamceller afledt af knoglemarv er multipotente og har fremkaldt neovaskularisering og cardiomyocyte regenerering 18,19. MSC'er har hovedsagelig været isoleret fra knoglemarv, men også fra periosteum, skeletmuskulatur, synovium, navlestrenge og dentale væv, selv om opnåelse af celler fra disse væv er ikke let og kan kræve yderligere kirurgiske procedurer for patienterne. Men mængden af ledvæske normalt stiger, i leddene i osteoarthritis eller RA-patienter, og biopsier af disse øgede synovialvæsker anvendes til at diagnosticere og behandle patienter. Antallet af MSC'er øger også i synovialvæsken hos patienter med degenereret brusk og slidgigt 20.
I denne undersøgelse blev cellefænotyper ikke-marrow- og synovial-væske-afledte MSC'er evalueret, end både MSC præsenterede tilsvarende niveauer af udtryk for celleoverflademarkører. Derfor celler isoleret fra ledvæske og bekræftet som MSC'er har lignende fænotyper til knogle-MSC'er i minigrise. Forskernes tidligere forskning evalueret andre celleoverflademarkører, såsom CD90 og de store histokompatibelt og komplekse klasse II (MHC II), og bekræftede en kapacitet til multi-slægt differentiering til osteocytter, adipocytter, chondrocytter og neuroner i synovial-væske -afledte MSC fra minigrise 8. Hos mennesker celleoverfladeantigenet profil synovial-væske MSC'er er ligner den i synovial-membran-2,21 og knogle-MSC'er. Men CD34 og CD45 udtryk blev ikke påvist i MSC'er afledt af ledvæske i Bidfunktion uorden patienter. Således kan mikromiljøet i leddet påvirker cellens fænotype af MSC'er afledt af ledvæske. I dette eksperiment blev cellerne opnået fra knoglen maRROW og ledvæske af minigrise ved hjælp af ikke-invasive metoder. Begge typer af in vitro dyrkede celler blev bekræftet som MSC'er, og de havde lignende cellefænotyper og fælles kompatible mesenchymale egenskaber. Imidlertid viste synovial-væske-afledte MSC'er et større potentiale for autolog stamcelletransplantation terapi for ikke kun brusk og knogle regeneration men også til immunosuppression af slidgigt og leddegigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
