Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי מרכז בעלי חיים לניסויים ביו באוניברסיטה הלאומית גיאונגסאנג.
1. תכשירים לניקוי נוהל בעלי החיים
- כן המבוגר minipigs נקבה לאיסוף בלתי פולשני של MSCs ממח עצם נוזל הסינוביאלי. בצע הבדיקה הקלינית של minipigs יום אחד לפני הרדמה ותרופות אוסף מדגם.
- ספק חיות קליניות נורמליות עבור בדיקות גופניות, הכוללות טמפרטורת גוף, קצב נשימה, קצב לב, ועל התצפית של סטטוסי ההתנהגות המטולוגיות 'החזירים, תוך שימוש בבדיקות ספירת דם מלאות.
הערה: במרווחי פרמטר עבור minipigs הבריא קליני 11 - 29 / min עבור קצב הנשימה, 68 - 98 / min עבור קצב הלב, ו -37 - 38 ° C עבור טמפרטורת הגוף.
- ספק חיות קליניות נורמליות עבור בדיקות גופניות, הכוללות טמפרטורת גוף, קצב נשימה, קצב לב, ועל התצפית של סטטוסי ההתנהגות המטולוגיות 'החזירים, תוך שימוש בבדיקות ספירת דם מלאות.
- הסר את כל המצעים אכילים מהכלוב בתקופת הצום לפני הניתוח של 6 - PRIO 12 שעותr לממשל של הרדמה עבור minipigs צעיר ובוגר, 3 שעות של צום יש לשים לב עבור הילודים. לספק מי שתייה עד למועד הרדמה.
2. הכנת בעלי החיים עבור הרדמה
- תרופות minipigs לפני מתן הרדמה עם acepromazine (0.1 מ"ג / ק"ג), medetomidine (0.03 מ"ג / ק"ג), ו אטרופין (0.04 מ"ג / ק"ג).
- להזריק כל התרופות בהזרקה לשריר (IM) באמצעות מחט 21 G עם אורך של 30 מ"מ לפחות עבור minipigs מבוגר. בצע את זריקת IM 1-3 סנטימטר מאחורי האוזן לתוך שריר צוואר רחם לרוחב או לתוך שריר הירך.
הערה: בצע את כל ההליכים בלי לעורר פחד או מתח החיות או הדורשים טיפול אגרסיבי להזריק את premedication בבטחה.
- להזריק כל התרופות בהזרקה לשריר (IM) באמצעות מחט 21 G עם אורך של 30 מ"מ לפחות עבור minipigs מבוגר. בצע את זריקת IM 1-3 סנטימטר מאחורי האוזן לתוך שריר צוואר רחם לרוחב או לתוך שריר הירך.
- מניחים את minipigs בעמדה הגבי-שכיבה.
- רבע שעה לאחר מתן של premedication, ליזום הרדמה באמצעות מנהל isoflurane 1.5%istered באמצעות אינהלציה.
- המשך שאיפה של isoflurane (1.5%) דרך הטובוס, ואחריו מעלייה בריכוז 2.5%, עם חמצן (1.5 ליטר / דקה) כגז המוביל.
- ברציפות לפקח על קצב הלב, טמפרטורת הגוף, ועל רוויון החמצן בדם מלעורית (SpO 2) של minipigs במהלך ההרדמה. השתמש שמיכה במחזור מים בטמפרטורה של 38 - 39 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת גוף. החל משחה ophthalmologic כדי להגן על העיניים מפני התייבשות במהלך ההרדמה.
- עקוב הסיווג של guedel להעריך את עומק ההרדמה 13.
3. תכשירי בידוד תא וטיפוח
- כדי לטפח את MSCs נגזר ממח העצם נוזל סינוביאלי, להכין 500 מ"ל של מדיום הנשר שונה של מתקדמים Dulbecco (ADMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml של צמיחה פיברובלסטים בסיסי פקטוr (bFGF), ו -1.0% פניצילין, סטרפטומיצין (10,000 IU ו -10,000 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, עט סטרפטוקוקוס).
- דגירה ADMEM על 38.5 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2 בתוך CO 2 באינקובטור.
- כן 500 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט החיץ של Dulbecco (DPBS) על פי הוראות היצרן עבור בידוד תא ושטיפה.
4. איסוף מח עצם מן Minipigs
- בחר שטח של כ 15 x 15 ס"מ גודל על פסגת הכסל (איור 1), ולהסיר את השיער מאזור זה באמצעות סכיני גילוח בטיחות מעוקר או קוצץ חשמלי. לאחר Minipig ממוצבת, לסירוגין לשפשף באתר ההליך שלוש פעמים עם סוכני העיקור הבאים: יוד povidone ו -70% אתנול. אחרי השטח הוא יבש למרוח בסדינים מעוקרים.
- טרום מעיל המזרק 10 מ"ל עם 100 U / ml של הפרין ידי שטיפה זה עם 3 - 4 מ"ל של הפרין לפני ejecטינג הסוכן-מקריש אנטי.
הערה: בצע פעולה זו כדי למנוע קרישה בתוך המזרק במהלך שאיבת מוח עצם. - חלץ מינימום של 5 מ"ל של מח העצם של עצם הכסל ציצה של Minipig בהרדמה, באמצעות חולץ מח עצם (3.0 × 100 מ"מ) מחוברת בחוזקה אל מזרק 10 מ"ל מצופה מראש הפרין.
בידוד 5. של תאים שחולצו ממח העצם ו בטיפוח Vitro
- לבודד את התאים ממח עצם החילוץ.
- לדלל את מח העצם חילוץ עם נפח שווה של DPBS צינור חרוטי 15 מ"ל בטמפרטורת החדר.
- הוסף 3 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה צפיפות (Ficoll-Paque) אל צינור חרוטי 15 מ"ל.
- לדלל שכבה 4 מ"ל של מח העצם עם DPBS, אשר ממוקם על התקשורת צנטריפוגה צפיפות ללא ערבוב, צנטריפוגות אותו גרם 400 × 40 דקות בטמפרטורת החדר.
- קציר את שכבת התאים mononuclear(MNC) מן המעיל באפי בין שתי שכבות המכיל את הפלזמה (השכבה העליונה) והתקשורת צנטריפוגה צפיפות (השכבה התחתונה), ולהעביר את MNCs לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- לדלל את MNCs הועבר עם 7 - 8 מ"ל של DPBS ו צנטריפוגות אותם גרם 500 × במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS.
- להשעות את התא גלולה ב 2 מ"ל של ADMEM ולהעביר אותו בצלחת בתרבית רקמה 35 מ"מ. דגירה תרבות צלחת על 38.5 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2.
- בטיפוח במבחנה של תאים מבודדים ממח העצם.
- לאחר 48 שעות, לשאוב את המדיום עם התאים שלא מצורף הצלחת, ולהחליף 2 מיליליטר של ADMEM דגירה זה על 38.5 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2. שנה את בינונית כל יום שלישי.
- בגיל 70 - 80% confluency, לשטוף את התאים עם DPBS, לנתק אותם עם 1 מ"ל של 0.25%טריפסין / EDTA, דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 - 5 דקות עד שהתאים לנתק.
- קציר התאים באמצעות 10 מ"ל של ADMEM, ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, ו צנטריפוגות אותם ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant.
- להשעות את התאים שנקטפו 1 מ"ל של ADMEM טריים לספור אותם באמצעות hemocytometer.
- מניחים את התאים 5 - בקבוק 7.5 x 10 5 / 25T המכיל 4 מ"ל של ADMEM דגירה אותם על 38.5 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2. שנה את בינונית כל יום שלישי.
אוסף 6. הסינוביאלי נוזלים מן Minipigs
- בדומה לנוהל שאיבת מוח עצם, בחר באזור רצוי של כ 15 x 10 סנטימטרים (אורך / רוחב) על מפרק הירך, ולהסיר את השיער באמצעות סכיני גילוח בטיחות מעוקרים או קוצץ חשמלי, פעל לפי נהלי חיטוי (שלב 4.1).
- הכנס מזרק 3 מ"ל עם 23 Gמחט לתוך המפרק לאחר הציונים דרך המישוש (פיקת ברך ואת ציצת שוקה).
- החל שאיבה עדינה אל המזרקים עבור השאיפה של נוזל סינוביאלי במפרק. ההיקף המשוער של נוזל סינוביאלי שנאסף משותף הוא 0.5 - 1 מיליליטר, אבל זה משתנה בהתאם לגודל של Minipig או המפרק. שטוף באמצעות DPBS בחלל הסינוביאלי אם נפח שנאספו של הנוזל הסינוביאלי הוא קטן מדי.
- מיד למשוך את המזרק כדי למנוע זיהום בדם.
בידוד תא 7. מן Collected הסינוביאלי נוזלים בטיפוח Vitro
- לבודד את התאים מן הנוזל הסינוביאלי לריאות.
- לדלל את הנוזל הסינוביאלי aspirated עם נפח שווה של DPBS צינור חרוטי 15 מ"ל בטמפרטורת החדר.
- כדי להסיר שאריות, לסנן את הנוזל הסינוביאלי מדולל באמצעות מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר.
- הוסף 10 מיליליטר של DPBS אל הצינור המכיל את סינוביאלי המסונןנוזל צנטריפוגות אותו גרם 400 × במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS.
- להשעות את התא גלולה ב 2 מ"ל של ADMEM, למקם את התאים על 2 - צלחת בתרבית רקמה 3 x 10 5 תאים / 35 מ"מ עם 2 מ"ל של ADMEM, דגירה אותם על 38.5 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2 .
- חזור על שלב 5.2 עבור הטיפוח במבחנה של MSCs נגזרות נוזל הסינוביאלי המבודדת.
טיפול פוסט-הליך 8. של Minipigs
- במידת הצורך, לסגור את העור במקום ההזרקה חולץ מח עצם עם תפר יחיד באמצעות מהדק העור, לאחר איסוף מח העצם.
- לאחר שהסתיים ההליך יושלם, לנהל זריקה תוך שרירית של Enrofloxacin (5 מ"ג / ק"ג) ו meloxicam (0.2 מ"ג / ק"ג) אל minipigs פעם ביום למשך 3 ימים.
- לאחר שהסתיים ההליך יושלם, לחטא את מח עצם אתר איסוף נוזל סינוביאליעם יוד povidone 0.1% פעם אחת ביום למשך 3 ימים. אנא קראו בעיון מדי יום כדי לעקוב אחר סימנים של סיבוכים (למשל, נפיחות, מוגלה, או אודם).
9. נייד phenotyping שימוש cytometry זרימה
- כאשר MSCs הם 70 - 80% ומחוברות על קטעים 3 - 5, לשטוף את התאים עם DPBS ולהתייחס אליהם עם 1 מ"ל של 0.25% (v / v) טריפסין / EDTA. לאחר מכן, דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 - 5 דקות עד התאים מנותקים.
- קציר התאים באמצעות 10 מ"ל של DPBS, ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, ו צנטריפוגות אותם ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחק את הפתרון supernatant.
- כדי לתקן את התאים, להשעות את התא גלולה ב 10 מ"ל של פתרון פורמלדהיד 3.7% ולשמור אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפני הניתוח.
- יום אחד לאחר התיקון, לשטוף את התאים עם DPBS פעמים באמצעות צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בכל פעם. מחק את הפתרון supernatant.
- להשעות את התא גלולה ב 4 מ"לשל DPBS, אשר השלים עם 1% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA), ו דגירה הגלולה עבור שעה 1 ב 4 ° C לחסום אינטראקציות בתיווך Fc הלא ספציפיות.
- הפץ 500 aliquots μl של השעיה התא לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
- עבור נוגדנים שאינם מצומדות (CD29 ו vimentin), לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 3 דקות. מחק את הפתרון supernatant.
- להשעות את התא גלולה ב 500 μl של דילול 1: 100 של נוגדן ראשוני דגירה אותו במשך שעה 1 ב 4 ° C.
- שוטפים את התאים פעמיים עם אלבומין 1% שור על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בכל פעם. מחק את הפתרון supernatant.
- להשעות את התא גלולה ב 500 μl של דילול 1: 100 של isothiocyanate והעמסת (FITC), מצומדות נוגדנים משני דגירה אותו במשך שעה 1 בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
- עבור נוגדנים FITC מצומדות (אלוטיפ, CD34, CD44 ו CD45), לשטוף את התאים על ידי centrifugation ב 300 × גרם במשך 3 דקות. מחק את הפתרון supernatant.
- להשעות את התא גלולה ב 500 μl של 1: 100 נוגדן FITC- מצומדות ו דגירה אותו במשך שעה 1 בחושך ב 4 ° C..
- עבור שני התנאים המכתימים, לשטוף את התאים פעמים עם DPBS על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בכל פעם. מחק את הפתרון supernatant.
- להשעות את התאים ב 500 μl של DPBS, ולהעביר אותם לתוך 5 מ"ל צינור מסביב לתחתית, ולנתח את התוצאות באמצעות cytometer זרימה 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמת MSCs נגזר מח עצם ו הנוזל הסינוביאלי של Minipigs
MSCs בודד בהצלחה ממח עצם מפרק סינוביאלי במפרק של minipigs והרחיב במבחנה (איור 2). שאיפת מזרק של נוזל הסינוביאלי היא פשוטה, ולא מן הנמנע להשיג תאים חסידים מספיק במהלך טיפוח במבחנה של התאים הראשוניים. המורפולוגיה של סינוביאלי-נוזל נגזרות MSCs דומה לזה של MSCs עצם נגזר מוח, ושניהם יש MSCs צורת כישור fibroblastic והם חסידים בצורה הומוגנית. הם נצפו להיות ביטוי חיובי עבור phosphatase אלקליין (AP) מכתים, לאחר תת השלישי היה שלם.
הערכת הפנוטיפ הנייד של MSCs נגזר מח העצם ו נוזל סינוביאלישל Minipigs
מבחנים של הסמנים פני התא בוצעו כדי ליצור פנוטיפ של MSCs מח עצם סינוביאלי הנגזרות-נוזל של minipigs. שני הסוגים של MSCs הביעו כמויות משמעותיות של סמנים פני תא חיוביים, כגון CD29, CD44, ו vimentin (≥96 - 99% מכלל התא החיובי), ואילו ביטויי CD34 ו CD45 היו שליליים ונמוכים (≤2% של תאים חיוביים) (איור 3). תוצאות אלו היו זהים לאלה המתקבלים MSCs הייחודי, כולל תאים מבודדים מן הנוזל הסינוביאלי, ולא היו הבדלים משמעותיים סמנים פני התא בין MSCs אלה. התאים מבודדים ממח העצם הנוזל הסינוביאלי אושרו כמו MSCs במחקר הקודם שלנו 8. שניהם מארו עצם MSCs נוזל סינוביאלי נגזרות הביעו גורמי תעתיק תאי גזע (Oct3 / 4, Nanog, ו Sox2); יתר על כן, h יכולת בידול במבחנהכמו אושר לא רק לתוך השושלת mesenchymal (osteocytes, adipocytes, ו chondrocytes), אלא גם תאים עצביים על ידי מכתים לתגליות cytochemical של ביטוי גנים תא ספציפי 8.
איור 1. מיקום לפסגת הכסל של Minipig. החץ האדום מייצג את האתר על פסגת הכסל המשמשת לאיסוף מח עצם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
MSCs האיור 2. נגזר מח עצם הנוזל הסינוביאלי של minipigs. (א) המורפולוגיה הומוגנית של תרבויות העיקריות של MSCs גילה צורת fibroblastic. (ב) מכתים עם תערובת של5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-פוספט tetrazolium הכחול נטר (BCIP / NBT) חשף פעילות AP ב MSCs בבר סולם מעבר 3.: 100 מיקרומטר אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח של סמנים פני התא של MSCs נגזר מח עצם הנוזל הסינוביאלי של minipigs ב מעבר 3. סמנים פני התא של MSCs זוהו באמצעות ניתוח תזרים cytometry, ו MSCs זוהו להיות חיובית עבור CD29, CD44 , ו vimentin ושלילית עבור CD34 ו CD45. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minipigs שימשו להקמת בידוד MSCs ממח העצם הנוזל הסינוביאלי. כדי לחסל בתנאים פיסיולוגיים שונים, כגון גיל, מין, מחלות, minipigs מתורמים רקע isogenic נבחר להעריך את האפיון התלוי מקור תא במדויק. חזירים ידועים להיות אנטומית, פיזיולוגית, וגנטית דומים לבני אדם, ובמיוחד, minipigs יכול לייצר איברים גודל בהתאמה; ולכן, הם יכולים לשמש כמין תורם תחליף ההשתלה שלא מבן-מינית 14,15. לגבי הנכס אימונו הציע לאחרונה של MSCs, indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) ו synthase תחמוצת החנקן (NOS) שימשו עם MSCs לתווך דיכוי חיסוני, שהוא מינים ספציפיים, למרות MSCs חזירים ובני אדם יש את אותה IDO 9 . לפיכך, מודל חזיר כתורמת MSCs עשוי לספק תובנות חשובות של המערכת החיסונית של MSCs עבור טיפולים האדם. מעבר לכך, במחקר של הגזע החזיריתאים ממלאים תפקיד חשוב בהבנה הביולוגית של תהליכים במבחנה והיישומים פרה-הקליניים השונים שלהם בבני האדם 16,17. מח עצם הנוזל הסינוביאלי ניתן לקצור הלא פולשני מ minipigs. ההליך כולו, מן ההרדמה לדגום אוסף, הקטין את רמת הלחץ של איברים מערכתיים או מקומיים; ולכן, ניתן להשתמש minipigs כמקבל להשתלה אוטולוגית. בניסוי זה, MSCs בודד ממח עצם הנוזל הסינוביאלי של minipigs, מבוסס על האישור של MSCs הנגזר סינוביאלי-נוזל עם יכולות דיכוי חיסוניות נגזרו מודל עכבר RA במחקר קודם 8
אוסף של מח עצם מן Minipigs
חזירים, ובתאים מבוגרים נגזרו מח עצם הם מולטיפוטנטיים ויש לי induced נאווסקולריזציה והתחדשות cardiomyocyte. הגיל של תורם קשור תוכן שומן מוגבר ירד התפשטות והבחנה של מח העצם; ולכן, מח העצם הוא לא המקור הטוב ביותר של MSCs בחיות בגילים. ציצת הכסל ב minipigs היא האתר המועדף לבידוד MSC הנגזר מח עצם כי היא רחבה ומהווה אתר הליך בסיכון נמוך עבור ניזק עצב sciatic. במקרה של minipigs בגילאי או מעודף המשקל, שרירים עבים מועשר שומן רשאיים להיות נוכחים על פסגת הכסל. בנסיבות כאלה, חתך דקירה על העור יש צורך ואת המחט ביופסיה של מוח העצם חייב להיות מוכנס כראוי, אשר יכול להיות קשה ליישם בפסגת הכסל. אי למצוא באתר הביופסיה הנכון עלולים לגרום שאיפות מח עצם נכשלו כיוון המחט נחסמה על ידי העצם או ייתכן שלא תוכל להגיע במח העצם בתוך ציצת הכסל. לכן, את מחט הביופסיה חייבת להיבדק כראוי, והידע של העובי של רקמות רכות קליפת העצם של ציצת הכסל נדרש לפני תחילת אוספי מדגם.
"jove_content"> שאיפה של הסינוביאלי נוזלים מן המפרידים של Minipigs
נוזל הסינוביאלי מקיים חלל מפרק סינוביאלי, ואת נפח נוזל הסינוביאלי בדר"כ גדל באזורי מפרקים דלקתיים. MSCs סינוביאלי הנגזרות-נוזל נלקחים מאתרי המועמד המועדף על התחדשות הסחוס, הן in vivo ו במבחנה. בנוסף, הם הוכחו לעורר תכונות מערכת חיסוניות ב- RA 8. נוזל הסינוביאלי אינו רק מקור ונגיש אבל יש גם תכונות mesenchymal יקרות. מגבלות של שימוש הנוזל הסינוביאלי כמקור MSCs הם כרכים שונים הנמצאים במפרקים מבוסס על בגדלים שונים במצבים פתולוגיים של המפרקים ואת הקושי באמצעות מזרק 3 מ"ל שאיפה נוזל סינוביאלי מן המפרקים. לכן, בגודל של המזרק צריך להיות 5 - 10 מ"ל עם לחץ גבוה. בנוסף, שטיפה של נוזל סינוביאלי עם 1 - 2 מ"ל של DPBS מתוך מזרקעדיף. באמצעות שיטה זו, מספר רב של תאים ניתן להשיג, אפילו בחללים קטנים במפרקים.
אפיונים של עצם-מארו ו הסינוביאלי-נוזל הנגזרות MSCs של Minipigs
אצל בני אדם, המורפולוגיות של MSCs הנגזרת סינוביאלי קרום סינוביאלי-fluid- ומתוך חולי אוסטיאוארתריטיס דומות אך צרות יותר את המורפולוגיה של MSCs הנגזר מח עצם 12. עם זאת, ב במבחנת תרבויות, המורפולוגיות של שני סינוביאלי-נוזל נגזרות MSCs ועצמות מח נגזרות MSCs נצפו להיות דומה בניסוי הזה. במחקר הקודם של החוקרים, יכולת ההתפשטות של MSCs הנגזרות-נוזל סינוביאלי הייתה גבוהה, בהשוואה לזו של MSCs הנגזר מח עצם 8.
MSCs מבוססים ממקורות רקמות שונים התורמים מבוגרים; ולכן, הלא פולשני השיג MSCs הנגזרות רקמות-מקור הם בעלי ערך עבור מח עצם אוטולוגית הerapy. מקור התא תלוי האפיונים ויכולותיה של המחלה או את המטרה של הטיפול בתאי גזע. חזירים, ובתאים מבוגרים נגזרו מח עצם הם מולטיפוטנטיים ויש לי induced התחדשות נאווסקולריזציה ו cardiomyocyte 18,19. MSCs בודד בעיקר ממח עצם, אלא גם מן periosteum, שרירי שלד, synovium, חבלי טבור, ורקמות שיניים, למרות קבלת תאים מרקמות אלה לא קלה והוא יכול לדרוש פעולות כירורגיות עבור המטופלים. עם זאת, את נפח הנוזל הסינוביאלי בדרך כלל מגביר את המפרקים של דלקת מפרקים ניוונית או חולי RA, וביופסיות של נוזלים סינוביאלי מוגדלים אלה משמשים כדי לאבחן ולטפל בחולים. מספר MSCs גם מעלה בנוזל סינוביאלי של חולים עם סחוס מנוון ניוונית 20.
במחקר זה, פנוטיפים התא של עצם-מארו ו סינוביאלי-נוזל הנגזרות MSCs הוערכו, גידולהן ד MSCs הציג רמות דומות של הביטוי עבור סמנים פני התא. לכן, תאים המבודדים מן הנוזל הסינוביאלי ואשרו כמו שיש MSCs פנוטיפים דומה MSCs עצם נגזר מוח minipigs. המחקר הקודם 'החוקרים העריך סמנים פני תא אחרים, כגון CD90 ואת מעמד histocompatible ומורכב הגדול השני (MHC II), ואשר יכולת בידול רבה שושלת לתוך osteocytes, adipocytes, chondrocytes, ונוירונים של נוזל סינוביאלי MSCs -derived מ minipigs 8. אצל בני אדם, פרופיל אנטיגן שטח פני התא של סינוביאלי-נוזל נגזרות MSCs דומה לזה של MSCs הנגזרת מח עצם סינוביאלי-membrane- 2,21 ו. עם זאת, CD34 וביטויי CD45 לא זוהו MSCs נגזר נוזל הסינוביאלי בחולי הפרעה משותפת רקתי. לפיכך, microenvironment במפרק עשויים להשפיע על הפנוטיפ התא של MSCs נגזר הנוזל הסינוביאלי. בניסוי זה, התאים התקבלו העצם marrow ואת הנוזל הסינוביאלי של minipigs בשיטות לא פולשנית. שני סוגי תאים בתרבית במבחנה אומתו כמו MSCs, והיו להם פנוטיפים תא דומים ומאפייני mesenchymal תואמים משותפים. עם זאת, סינוביאלי-נוזל נגזרות MSCs הראה פוטנציאל גדול עבור טיפול בתאי גזע עצמי להתחדשות סחוס ועצם לא רק, אלא גם עבור דיכוי חיסוני של דלקת מפרקים ניוונית דלקת מפרקים שגרונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) | Gibco | 12491-023 | MSC culture medium |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Component of MSCs medium |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Component of MSCs medium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378-016 | Component of MSCs medium |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Simga | F0291 | Component of MSCs medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A6003 | Component of MSCs medium |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell dissociation reagent |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of MSCs medium |
| Isotype antibody | BD Pharmingen | BD 550616 | Isotype Control |
| CD29 antibody | BD Pharmingen | BD 552369 | Integrin beta-1 MSCs marker |
| CD44 antibody | BD Pharmingen | BD 553133 | Cell surface glycoprotein MSCs marker |
| CD45 antibody | BD Pharmingen | BD 340664 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD34 antibody | BD Pharmingen | BD 555821 | Hematopoietic stem cells marker |
| CD90 antibody | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker |
| MHC Class II antibody | Santa Cruz | SC-32247 | Antigen presenting cells marker |
| Vimentin antibody | Sigma | Sigma-S6389 | Type III intermediate filament MSCs marker |
| Alkaline phosphatase | Promega | S3841 | Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Density gradient centrifugation |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µm nylon cell strainer |
| 15-ml polystyrene conical tube | BD Falcon | 351095 | Sample collection and cell isolation |
| 35 mm dishes | Nunc | 153066 | Cell culture dish |
| Bone marrow extractor | GmbH Medizintechnologie, Germany | 1145-1W010 | TrokaBone, 3.0 x 100 mm |
| Hematocritchamber | Marinfeld | 640130 | Cell counting chamber |
| Atropine | Jeil Pharmaceutical Co, South Korea | Atropine sulfate Hydrate | |
| Acepromazine | Samu Median, South Korea | Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug | |
| Medetomidine | Pfizer | Anesthetic and analgesic drug | |
| Enrofloxacin | Bayer Healthcare, Germany | Anti-biotics | |
| Meloxicam | Over Veterinary Medicine, Argentina | Anti-inflammatory and analgesic drug | |
| Isoflurane | Hana pharm, South Korea | Inhalational anesthesia | |
| Povidone iodine | Korea Pharma, South Korea | Sterilization agent | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | Sterilization agent |
| Heparin | Sigma | H3393 | Anti-coagulating agent |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell fixation agent |
| Ophthalmologic ointment | Pfizer | Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate | |
| Circulating water blanket | Gaymar Industries | Warming system during and after anesthesia | |
| Skin stapler | Covidien, USA | Suture skin closure | |
| CO2 Incubator | Thermo Forma | 3111 | Cell culture Equipment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Cell analyzer | |
| Minipig | PWG Genetics Korea, Ltd. | T-type | Miniature pig |
References
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
- De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
- Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
- Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
- Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
- Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
- Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
- Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
- John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
- Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
- Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
- Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
- Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
- Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
- Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).
