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Minipigs की श्लेष द्रव और अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल के अलगाव और सेलुलर phenotyping

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54077
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

Protocol

पशु प्रयोगों जायोंगसैंग राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में बायोमेडिकल प्रयोग के लिए पशु केंद्र द्वारा अधिकृत किया गया।

1. पशु प्रक्रिया के लिए तैयारी

  1. अस्थि मज्जा और श्लेष द्रव से MSCs के गैर इनवेसिव संग्रह के लिए वयस्क महिला minipigs तैयार करें। minipigs एक दिन संज्ञाहरण और नमूना संग्रह करने से पहले के नैदानिक ​​परीक्षा प्रदर्शन।
    1. शारीरिक परीक्षा, जो शरीर के तापमान, श्वसन दर, और हृदय गति, और सूअरों के व्यवहार और hematological स्थितियों के अवलोकन के लिए शामिल हैं, पूर्ण रक्त गणना परीक्षण प्रयोग करने के लिए चिकित्सकीय सामान्य जानवरों प्रदान करें।
      नोट: चिकित्सकीय स्वस्थ minipigs के लिए पैरामीटर अंतराल 11 कर रहे हैं - 29 / श्वसन दर के लिए मिनट, 68 - 98 / दिल की दर के लिए न्यूनतम, और 37 - 38 डिग्री शरीर के तापमान के लिए सी।
  2. 12 घंटा prio - 6 के preoperative उपवास की अवधि के दौरान पिंजरे से सभी खाद्य बिस्तर हटायेयुवा और वयस्क minipigs के लिए संज्ञाहरण के प्रशासन से आर, उपवास के 3 घंटा नवजात शिशुओं के लिए मनाया जाना चाहिए। संज्ञाहरण के समय तक पेयजल उपलब्ध कराने।

2. संज्ञाहरण के लिए पशु की तैयारी

  1. acepromazine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा), medetomidine (0.03 मिलीग्राम / किग्रा), और atropine (0.04 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ संज्ञाहरण के प्रशासन से पहले minipigs औषधि।
    1. सभी दवाओं intramuscularly (आईएम) के वयस्क minipigs के लिए कम से कम 30 मिमी की लंबाई के साथ एक 21 जी सुई का उपयोग इंजेक्षन। आईएम इंजेक्शन पार्श्व ग्रीवा मांसपेशी में या जांघ की मांसपेशी में कान के पीछे 1-3 सेमी प्रदर्शन करना।
      नोट: जानवरों में भय या तनाव जानने या सुरक्षित रूप से premedication इंजेक्षन करने के लिए किसी न किसी तरह से निपटने की आवश्यकता के बिना सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन।
  2. एक पृष्ठीय लेटा हुआ स्थिति में minipigs रखें।
  3. पंद्रह मिनट premedication के प्रशासन के बाद, 1.5% isoflurane व्यवस्थापक का उपयोग कर संज्ञाहरण आरंभसाँस के माध्यम से istered।
    1. वाहक गैस के रूप में एक अंतःश्वासनलीय ट्यूब के माध्यम से isoflurane (1.5%) की साँस लेना, 2.5% की एकाग्रता में वृद्धि के द्वारा पीछा किया, ऑक्सीजन के साथ (1.5 एल / मिनट) जारी रखें।
  4. लगातार संज्ञाहरण के दौरान हृदय गति, शरीर का तापमान, और percutaneous रक्त ऑक्सीजन संतृप्ति (एसपीओ 2) minipigs की निगरानी। शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए 39 डिग्री सेल्सियस - 38 के तापमान पर एक कंबल घूम पानी का प्रयोग करें। संज्ञाहरण के दौरान बाहर सुखाने से आंखों की रक्षा करने के लिए एक आंखों मरहम लागू करें।
  5. संज्ञाहरण 13 की गहराई का आकलन करने के guedel के वर्गीकरण का पालन करें।

3. सेल अलगाव और खेती के लिए तैयारी

  1. MSCs अस्थि मज्जा और श्लेष द्रव से निकाली गई खेती करने के लिए, उन्नत Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (ADMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 1% Glutamax की 500 मिलीलीटर, बुनियादी fibroblast वृद्धि कार्योत्तर के 10 एनजी / एमएल तैयारआर (bFGF), और 1.0% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 आइयू और 10,000 माइक्रोग्राम / एमएल, क्रमशः, कलम strep)।
    1. 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण सीओ 2 इनक्यूबेटर के भीतर में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर ADMEM सेते हैं।
  2. सेल अलगाव और कपड़े धोने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के 500 मिलीलीटर की तैयारी।

4. Minipigs से अस्थि मज्जा एकत्रित

  1. एक क्षेत्र श्रोणिफलक शिखा (चित्रा 1) पर आकार में लगभग 15 x 15 सेमी का चयन करें, और इस क्षेत्र निष्फल सुरक्षा छुरा या बिजली कतरनी का उपयोग करने से बालों को हटा दें। एक बार जब minipig तैनात है, बारी-बारी से प्रक्रिया साइट से हाथ धोने के बाद नसबंदी एजेंटों के साथ तीन बार povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल। बाद क्षेत्र को अच्छी तरह से सूखा है, बाँझ पर्दे लागू होते हैं।
  2. प्री-कोट 3 के साथ यह rinsing द्वारा 100 यू / हेपरिन की मिलीलीटर के साथ 10 मिलीलीटर सिरिंज - ejec पहले हेपरिन के 4 मिलीलीटरटिंग विरोधी coagulating एजेंट।
    नोट: अस्थि मज्जा आकांक्षा के दौरान सिरिंज में जमावट से बचने के लिए यह कदम प्रदर्शन करना।
  3. संज्ञाहरण के तहत minipig की श्रोणिफलक शिखा हड्डी से अस्थि मज्जा के 5 मिलीलीटर की एक न्यूनतम निकालें, एक अस्थि मज्जा चिमटा (3.0 × 100 मिमी) कसकर हेपरिन पूर्व लेपित 10 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी इस्तेमाल करते हैं।

5. कोशिकाओं के अलगाव अस्थि मज्जा से और इन विट्रो खेती में निकाले

  1. निकाले अस्थि मज्जा से कोशिकाओं को अलग।
    1. एक समान कमरे के तापमान पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में DPBS की मात्रा के साथ निकाली गई अस्थि मज्जा पतला।
    2. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब घनत्व centrifugation मीडिया (Ficoll-Paque) के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए 400 × छ DPBS के साथ अस्थि मज्जा, जो घनत्व centrifugation मीडिया पर मिश्रण के बिना रखा गया है की एक परत 4 मिलीलीटर, और यह सेंट्रीफ्यूज पतला।
    4. mononuclear कोशिकाओं की परत फसलप्लाज्मा (ऊपर परत) और घनत्व centrifugation मीडिया (नीचे की परत) युक्त दो परतों के बीच बफी कोट से (एमएनसी), और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बहुराष्ट्रीय कंपनियों के हस्तांतरण।
    5. 7 के साथ स्थानांतरित कर बहुराष्ट्रीय कंपनियों पतला - DPBS के 8 मिलीग्राम और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 500 × छ उन्हें अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    6. ADMEM के 2 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित और एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान को हस्तांतरण। 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति पकवान सेते हैं।
  2. अस्थि मज्जा से अलग कक्षों के इन विट्रो खेती में।
    1. 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं है कि पकवान से जुड़ी नहीं है साथ मध्यम aspirate, और ADMEM के 2 मिलीलीटर की जगह है और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं। मध्यम बदलें हर तीसरे दिन।
    2. 70 - 80% confluency, DPBS के साथ कोशिकाओं को धो उन्हें 0.25% की 1 मिलीलीटर के साथ अलग कर देनाtrypsin / EDTA, और उन्हें 3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते - 5 मिनट तक कोशिकाओं को अलग।
    3. ADMEM के 10 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं फसल, उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हस्तांतरण, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × छ पर उन्हें अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. ताजा ADMEM के 1 मिलीलीटर में काटा कोशिकाओं को निलंबित और एक hemocytometer का उपयोग कर उन्हें गिनती।
    5. 5 में कोशिकाओं की जगह - 7.5 x 10 5 / 25T ADMEM के 4 मिलीलीटर युक्त कुप्पी और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं। हर तीसरे दिन मध्यम बदलें।

Minipigs से द्रव श्लेष के 6. संग्रह

  1. अस्थि मज्जा आकांक्षा के लिए प्रक्रिया के लिए इसी प्रकार, ऊरु संयुक्त भर में लगभग 15 x 10 सेमी (लंबाई / चौड़ाई) का एक उपयुक्त क्षेत्र का चयन करें, और निष्फल सुरक्षा छुरा या बिजली क़ैंची का उपयोग बालों को हटाने, स्वच्छता प्रक्रियाओं (4.1 कदम) से पालन करें।
  2. एक 23 जी के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज डालेंटटोलने का कार्य स्थलों (पटेला और टिबिया शिखा) के बाद संयुक्त में सुई।
    1. संयुक्त में श्लेष तरल पदार्थ की आकांक्षा के लिए सीरिंज के लिए कोमल चूषण लागू करें। 1 मिलीलीटर, लेकिन इस minipig या संयुक्त के आकार के अनुसार बदलता रहता है - एक संयुक्त से एकत्र श्लेष तरल पदार्थ की अनुमानित मात्रा 0.5 है। श्लेष गुहा में DPBS के माध्यम से निकलवाने यदि श्लेष तरल पदार्थ की मात्रा एकत्र बहुत छोटा है।
    2. इसके तत्काल बाद खून से संक्रमण से बचने के लिए सिरिंज वापस ले लें।

7. एकत्र श्लेष द्रव से और इन विट्रो खेती में सेल अलगाव

  1. aspirated श्लेष तरल पदार्थ से कोशिकाओं को अलग।
    1. एक समान कमरे के तापमान पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में DPBS की मात्रा के साथ aspirated श्लेष द्रव पतला।
    2. मलबे को हटाने के लिए, एक 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी का उपयोग कर फिल्टर पतला श्लेष द्रव।
    3. फ़िल्टर श्लेष युक्त ट्यूब DPBS के 10 मिलीलीटर जोड़ेंतरल पदार्थ और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 400 × छ यह सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    4. ADMEM के 2 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित एक 2 पर कोशिकाओं की जगह - ADMEM के 2 मिलीलीटर के साथ 3 x 10 5 कोशिकाओं / 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते ।
  2. पृथक श्लेष द्रव व्युत्पन्न MSCs की इन विट्रो खेती के लिए दोहराएँ कदम 5.2।

Minipigs की 8. बाद प्रक्रिया की देखभाल

  1. यदि आवश्यक हो, त्वचा अस्थि मज्जा चिमटा इंजेक्शन स्थल पर एक भी सीवन एक त्वचा स्टेपलर का उपयोग के साथ, अस्थि मज्जा संग्रह के बाद बंद कर दें।
  2. प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद, 3 दिनों के लिए एक दिन में एक बार minipigs को Enrofloxacin (5 मिलीग्राम / किग्रा) और meloxicam (0.2 मिलीग्राम / किग्रा) के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन प्रशासन।
  3. प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद, अस्थि मज्जा और श्लेष द्रव संग्रह साइट कीटाणुरहित0.1% povidone आयोडीन एक बार 3 दिनों के लिए एक दिन के साथ। ध्यान से जटिलताओं के संकेत (जैसे, सूजन, मवाद, या लाली) के लिए नजर रखने के लिए दैनिक निरीक्षण करते हैं।

9. सेल phenotyping से फ्लो का प्रयोग

  1. मार्ग 3 पर 80% मिला हुआ - - 5, DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने और उन्हें 0.25% (वी / वी) trypsin / EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ इलाज MSCs 70 कर रहे हैं। फिर, उन्हें 3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते - 5 मिनट तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं।
  2. DPBS के 10 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं फसल, उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हस्तांतरण, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × छ पर उन्हें अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला समाधान त्यागें।
  3. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, एक 3.7% formaldehyde समाधान के 10 मिलीलीटर में सेल गोली को निरस्त करने और विश्लेषण से पहले एक दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए।
    1. फिक्सिंग के बाद एक दिन, DPBS दो बार 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए 300 × छ पर centrifugation का उपयोग कर के साथ कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला समाधान त्यागें।
    2. 4 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबितDPBS, जो 1% (w / v) गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पूरक, और गैर विशिष्ट एफसी की मध्यस्थता बातचीत ब्लॉक करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए गोली सेते है।
    3. 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में सेल निलंबन के 500 μl aliquots बांटो।
    4. गैर संयुग्मित एंटीबॉडी (CD29 और vimentin) के लिए, 3 मिनट के लिए 300 × छ पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं धो लें। सतह पर तैरनेवाला समाधान त्यागें।
    5. एक 1 के 500 μl में सेल गोली निलंबित: प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 कमजोर पड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए यह सेते हैं।
    6. कोशिकाओं में दो बार 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए 300 × छ पर centrifugation द्वारा 1% गोजातीय सीरम albumin के साथ धोएं। सतह पर तैरनेवाला समाधान त्यागें।
    7. एक 1 के 500 μl में सेल गोली निलंबित: fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के 100 कमजोर पड़ने माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए यह सेते हैं।
  4. FITC संयुग्मित एंटीबॉडी (निर्धारण, CD34, CD44 और CD45) के लिए, Centrifu द्वारा कोशिकाओं को धोने3 मिनट के लिए 300 × छ पर gation। सतह पर तैरनेवाला समाधान त्यागें।
    1. 1 के 500 μl में सेल गोली निलंबित: 100 FITC संयुग्मित एंटीबॉडी और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए यह सेते हैं।
    2. दोनों धुंधला की स्थिति के लिए, कोशिकाओं में दो बार DPBS के साथ centrifugation द्वारा 300 × छ पर 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए धो लें। सतह पर तैरनेवाला समाधान त्यागें।
    3. , DPBS के 500 μl में कोशिकाओं को निलंबित 5 मिलीलीटर में दौर नीचे ट्यूब उन्हें स्थानांतरित, और 8 कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग कर परिणाम का विश्लेषण।

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Representative Results

अस्थि मज्जा और Minipigs की श्लेष द्रव से व्युत्पन्न MSCs की स्थापना

MSCs सफलतापूर्वक अस्थि मज्जा और minipigs के जोड़ श्लेष जोड़ों से अलग और चित्रा (2) इन विट्रो में विस्तार किया गया। श्लेष तरल पदार्थ की सिरिंज आकांक्षा सरल है, और यह प्राथमिक कोशिकाओं की इन विट्रो खेती के दौरान पर्याप्त पक्षपाती कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव है। श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs की आकृति विज्ञान बोन मैरो व्युत्पन्न MSCs के समान है, और दोनों MSCs एक fibroblastic धुरी आकार दिया है और समान रूप से पक्षपाती हैं। बाद तीसरे उपसंस्कृति पूरा हो गया था वे alkaline फॉस्फेट (एपी) धुंधला के लिए एक सकारात्मक अभिव्यक्ति है करने के लिए मनाया गया।

अस्थि मज्जा और श्लेष द्रव से व्युत्पन्न MSCS की सेल phenotype का मूल्यांकनMinipigs की

कोशिका की सतह मार्कर की Assays minipigs के बोन मैरो और श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCS की एक phenotype बनाने के लिए प्रदर्शन किया गया। - (सकारात्मक कोशिकाओं के 99% ≥96) जबकि CD34 और CD45 के भाव नकारात्मक और कम (के ≤2% थे MSCs के दोनों प्रकार के ऐसे CD29, CD44, और vimentin के रूप में सकारात्मक कोशिका की सतह मार्कर, की काफी मात्रा में व्यक्त सकारात्मक कोशिकाओं) (चित्रा 3)। इन परिणामों के श्लेष तरल पदार्थ से अलग कक्षों सहित विशिष्ट MSCs, से प्राप्त उन लोगों के लिए समान थे और वहां MSCs बीच कोशिका की सतह मार्करों में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे। अस्थि मज्जा और श्लेष तरल पदार्थ से अलग कक्षों हमारे पिछले अध्ययन में 8 MSCs के रूप में पुष्टि की गई है। दोनों हड्डी marrow- और श्लेष द्रव व्युत्पन्न MSCs स्टेम सेल transcriptional कारकों (Oct3 / 4, Nanog, और Sox2) व्यक्त; इसके अलावा, इन विट्रो भेदभाव क्षमता जके रूप में पुष्टि की गई न केवल mesenchymal वंश में (osteocytes, adipocytes, और chondrocytes), लेकिन यह भी cytochemical धुंधला और सेल विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति 8 का पता लगाने के द्वारा तंत्रिका कोशिकाओं।

आकृति 1
चित्रा 1. minipig की श्रोणिफलक शिखा का स्थान। लाल तीर श्रोणिफलक अस्थि मज्जा संग्रह के लिए इस्तेमाल शिखर पर साइट का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. MSCs अस्थि मज्जा और minipigs की श्लेष तरल पदार्थ से निकाली गई। (ए) MSCs के प्राथमिक संस्कृतियों के सजातीय आकृति विज्ञान एक fibroblastic आकार का पता चला। (बी) के मिश्रण के साथ धुंधला5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl-फॉस्फेट और नाइट्रो नीले tetrazolium (BCIP / एनबीटी) पारित होने 3. स्केल पट्टी पर MSCs में एपी गतिविधि का पता चला: 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. MSCS की कोशिका की सतह मार्करों पारित होने के 3 पर अस्थि मज्जा और minipigs की श्लेष तरल पदार्थ से निकाली गई MSCS की कोशिका की सतह मार्करों cytometry विश्लेषण एक प्रवाह का उपयोग कर की पहचान की गई के विश्लेषण, और MSCs CD29, CD44 के लिए सकारात्मक होने के रूप में पहचान की गई और vimentin और CD34 और CD45 के लिए नकारात्मक। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

Minipigs अस्थि मज्जा और श्लेष द्रव से MSCs अलगाव स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। ऐसी उम्र, लिंग, और रोग के रूप में विभिन्न शारीरिक स्थिति, को समाप्त करने के लिए, isogenic पृष्ठभूमि दाताओं से minipigs सही सेल स्रोत निर्भर लक्षण वर्णन मूल्यांकन करने के लिए चुने गए हैं। सुअर हो जाना जाता है anatomically, physiologically, और आनुवंशिक रूप से मनुष्य के लिए समान है, और विशेष रूप से, minipigs आकार मिलान अंगों का उत्पादन कर सकते हैं; इसलिए, वे xenotransplantation 14,15 के लिए एक विकल्प दाता प्रजाति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। MSCs, indoleamine 2, 3-dioxygenase (भाषायें) और नाइट्रिक ऑक्साइड synthase (ओपन स्कूल) की हाल ही में सुझाव दिया इम्यूनोमॉड्यूलेटरी संपत्ति के बारे में, MSCs के साथ इस्तेमाल किया गया प्रतिरक्षादमन, जो प्रजातियों विशिष्ट है मध्यस्थता करने के लिए हालांकि सूअरों और इंसानों से MSCs ही भाषायें है 9 । इस प्रकार, एक MSCs दाता के रूप में एक सुअर मॉडल मानव उपचार के लिए MSCS की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान हो सकता है। इसके अलावा, सुअर का स्टेम के अनुसंधानकोशिकाओं में इन विट्रो प्रक्रियाओं और मनुष्य 16,17 में उनके विभिन्न preclinical आवेदनों की जैविक समझ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अस्थि मज्जा और श्लेष द्रव गैर invasively minipigs से काटा जा सकता है। इस पूरी प्रक्रिया में, संज्ञाहरण संग्रह करने के लिए नमूना से, प्रणालीगत या स्थानीय अंगों के तनाव के स्तर को कम कर; इसलिए, minipigs ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रयोग में, MSCs अस्थि मज्जा और minipigs की श्लेष तरल पदार्थ से अलग थे, पिछले एक अध्ययन में एक आरए माउस मॉडल से प्राप्त प्रतिरक्षादमन क्षमता के साथ श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCS की पुष्टि के आधार पर 8

Minipigs से अस्थि मज्जा का संग्रह

सूअरों में, वयस्क कोशिकाओं पूर्वज अस्थि मज्जा से प्राप्त होता multipotent कर रहे हैं और neovascularization और cardiomyocyte उत्थान प्रेरित किया है। एक दाता वर्ष की आयु में वृद्धि हुई वसा सामग्री के साथ जुड़ा हुआ है औरप्रसार और अस्थि मज्जा के भेदभाव में कमी आई; इसलिए, अस्थि मज्जा आयु वर्ग के पशुओं में MSCs का सबसे अच्छा स्रोत नहीं है। minipigs में श्रोणिफलक शिखा क्योंकि यह व्यापक है और sciatic तंत्रिका क्षति के लिए एक कम जोखिम प्रक्रिया साइट है बोन मैरो व्युत्पन्न एमएससी अलगाव के लिए पसंदीदा स्थल है। वृद्ध या अधिक वजन minipigs के मामले में, वसा में समृद्ध मोटी मांसपेशियों श्रोणिफलक शिखा पर मौजूद हो सकता है। ऐसी परिस्थितियों में, त्वचा पर एक छुरा चीरा आवश्यक है और अस्थि मज्जा बायोप्सी सुई ठीक से डाला जाना चाहिए, जो श्रोणिफलक शिखा पर लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है। सही बायोप्सी साइट में विफल रहा है अस्थि मज्जा आकांक्षाओं को जन्म दे सकती है क्योंकि सुई की हड्डी से अवरुद्ध हो जाता है या नहीं श्रोणिफलक शिखा अंदर अस्थि मज्जा तक पहुँचने में सक्षम हो सकता है पता लगाने के लिए विफलता। इसलिए, बायोप्सी सुई ठीक से जाँच की जानी चाहिए, और कोमल ऊतकों की मोटाई और श्रोणिफलक शिखा की हड्डी के कोर्टेक्स के ज्ञान नमूना संग्रह शुरू करने से पहले आवश्यक है।

श्लेष की आकांक्षा Minipigs के जोड़ों से द्रव

श्लेष द्रव श्लेष जोड़ों की गुहा में मौजूद है, और श्लेष तरल पदार्थ की मात्रा आमतौर पर जोड़ों में सूजन में वृद्धि हुई है। श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs, उपास्थि उत्थान के लिए पसंदीदा उम्मीदवार साइटों से लिया जाता है दोनों vivo में इन विट्रो में। इसके अतिरिक्त, वे आरए 8 में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण प्रकाश में लाना करने के लिए दिखाया गया है। श्लेष तरल पदार्थ न केवल एक आसानी से सुलभ स्रोत है लेकिन यह भी मूल्यवान mesenchymal गुण है। MSCs के लिए एक स्रोत के रूप में श्लेष तरल पदार्थ का उपयोग कर की सीमाएं विभिन्न संस्करणों अलग आकार और जोड़ों के रोग की स्थिति और जोड़ों से श्लेष द्रव आकांक्षा के लिए एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने में कठिनाई के आधार पर जोड़ों में पाए जाते हैं। उच्च दबाव के साथ 10 मिलीलीटर - इसलिए, सिरिंज का आकार 5 होना चाहिए। एक सिरिंज से DPBS के 2 मिलीलीटर - इसके अलावा, 1 के साथ श्लेष तरल पदार्थ की निस्तब्धताबेहतर है। इस पद्धति का उपयोग करके, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है, प्राप्त किया जा सकता जोड़ों में छोटे रिक्त स्थान से भी।

Minipigs के अस्थि-marrow- और श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs के अभिलक्षण

मनुष्यों में, पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रोगियों से श्लेष-fluid- और श्लेष झिल्ली व्युत्पन्न MSCS की morphologies समान है लेकिन बोन मैरो व्युत्पन्न MSCs 12 की आकृति विज्ञान से संकरा कर रहे हैं। हालांकि, इन विट्रो संस्कृतियों, दोनों श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs और बोन मैरो व्युत्पन्न MSCS की morphologies इस प्रयोग में समान होने के लिए मनाया गया। 'शोधकर्ताओं ने पिछले एक अध्ययन में, श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs के प्रसार की क्षमता बोन मैरो व्युत्पन्न MSCs 8 की तुलना में अधिक था।

MSCs वयस्क दाताओं में विभिन्न ऊतक स्रोतों से स्थापित कर रहे हैं; इसलिए, गैर invasively प्राप्त ऊतक स्रोत व्युत्पन्न MSCs ऑटोलॉगस स्टेम सेल वीं के लिए मूल्यवान हैंerapy। सेल स्रोत अभिलक्षण और रोग या स्टेम सेल थेरेपी के उद्देश्य की क्षमता पर निर्भर है। सूअरों में, वयस्क कोशिकाओं पूर्वज अस्थि मज्जा से प्राप्त होता multipotent कर रहे हैं और neovascularization और cardiomyocyte उत्थान 18,19 प्रेरित किया है। MSCs मुख्य रूप से अस्थि मज्जा से पृथक किया गया है, लेकिन यह भी periosteum, कंकाल की मांसपेशियों, synovium, गर्भनाल, और दंत ऊतकों से, हालांकि इन ऊतकों से कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आसान नहीं है और मरीजों के लिए अतिरिक्त शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है सकते हैं। हालांकि, श्लेष तरल पदार्थ की मात्रा आमतौर पर पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस या आरए रोगियों के जोड़ों में बढ़ जाती है, और ये वृद्धि हुई श्लेष तरल पदार्थ की बायोप्सी निदान और रोगियों के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है। MSCs की संख्या भी degenerated उपास्थि और ऑस्टियोआर्थराइटिस 20 के साथ रोगियों की श्लेष द्रव में बढ़ जाती है।

इस अध्ययन में, अस्थि-marrow- और श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCS की सेल phenotypes का मूल्यांकन किया गया है, एकडी दोनों MSCs कोशिका की सतह मार्करों के लिए अभिव्यक्ति के समान स्तर पर प्रस्तुत किया। इसलिए, श्लेष तरल पदार्थ से अलग और MSCs के रूप में पुष्टि की कोशिकाओं minipigs में अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न MSCs के समान phenotypes है। 'शोधकर्ताओं ने पिछले अनुसंधान ऐसे CD90 और प्रमुख histocompatible और जटिल वर्ग द्वितीय (एमएचसी द्वितीय) के रूप में अन्य कोशिका की सतह मार्कर, मूल्यांकन, और osteocytes, adipocytes, chondrocytes, और श्लेष तरल पदार्थ के न्यूरॉन्स में बहु-वंश भेदभाव के लिए एक क्षमता की पुष्टि की minipigs 8 से व्युत्पन्न MSCs। मनुष्यों में, श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs की कोशिका की सतह प्रतिजन प्रोफ़ाइल श्लेष-झिल्ली 2,21 और बोन मैरो व्युत्पन्न MSCs के समान है। हालांकि, CD34 और CD45 भाव temporomandibular संयुक्त विकार के रोगियों में श्लेष द्रव से निकाली गई MSCs में पता नहीं थे। इस प्रकार, संयुक्त में microenvironment श्लेष तरल पदार्थ से निकाली गई MSCS की सेल phenotype प्रभावित कर सकता है। इस प्रयोग में, कोशिकाओं की हड्डी मा से प्राप्त किया गयाrrow और गैर इनवेसिव तरीकों का उपयोग कर minipigs की श्लेष द्रव। इन विट्रो संवर्धित कोशिकाओं के दोनों प्रकार के MSCs के रूप में पुष्टि की गई है, और वे इसी तरह के सेल phenotypes और साझा संगत mesenchymal विशेषताओं था। हालांकि, श्लेष तरल पदार्थ व्युत्पन्न MSCs न केवल उपास्थि और हड्डी के उत्थान के लिए ऑटोलॉगस स्टेम सेल थेरेपी के लिए बल्कि पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस और आरए के प्रतिरक्षादमन के लिए एक बड़ा संभावित दिखाया।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (ADMEM) Gibco 12491-023 MSC culture medium
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190-144 Cell washing medium, free of Ca2+/Mg2+
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Component of MSCs medium
Glutamax Gibco 35050-061 Component of MSCs medium
Penicillin/streptomycin Gibco 10378-016 Component of MSCs medium
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Simga F0291 Component of MSCs medium
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A6003 Component of MSCs medium
Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell dissociation reagent 
β-mercaptoethanol Sigma M7522 Component of MSCs medium
Isotype antibody BD Pharmingen BD 550616 Isotype Control
CD29 antibody BD Pharmingen BD 552369 Integrin beta-1 MSCs marker
CD44 antibody BD Pharmingen BD 553133 Cell surface glycoprotein MSCs marker
CD45 antibody BD Pharmingen BD 340664 Hematopoietic stem cells marker
CD34 antibody BD Pharmingen BD 555821 Hematopoietic stem cells marker
CD90 antibody BD Pharmingen BD 555595 Thy-1 membrane glycoprotein MSCs marker
MHC Class II antibody Santa Cruz SC-32247 Antigen presenting cells marker
Vimentin antibody Sigma Sigma-S6389 Type III intermediate filament MSCs marker
Alkaline phosphatase Promega S3841 Mixture of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT)
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Density gradient centrifugation
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µm nylon cell strainer
15-ml polystyrene conical tube BD Falcon 351095 Sample collection and cell isolation
35 mm dishes Nunc 153066 Cell culture dish
Bone marrow extractor GmbH Medizintechnologie, Germany 1145-1W010 TrokaBone, 3.0 x 100 mm
Hematocritchamber Marinfeld 640130 Cell counting chamber
Atropine Jeil Pharmaceutical Co, South Korea Atropine sulfate Hydrate
Acepromazine Samu Median, South Korea Pre-anaesthetic sedative and antiemetic drug
Medetomidine Pfizer Anesthetic and analgesic drug
Enrofloxacin Bayer Healthcare, Germany Anti-biotics
Meloxicam Over Veterinary Medicine, Argentina Anti-inflammatory and analgesic drug
Isoflurane Hana pharm, South Korea Inhalational anesthesia
Povidone iodine  Korea Pharma, South Korea Sterilization agent
Ethanol Sigma E7023 Sterilization agent
Heparin Sigma H3393 Anti-coagulating agent
Formaldehyde Sigma F8775 Cell fixation agent
Ophthalmologic ointment  Pfizer Oxytetracycline HCl with polymyxin B sulfate
Circulating water blanket Gaymar Industries Warming system during and after anesthesia
Skin stapler Covidien, USA Suture skin closure
CO2 Incubator Thermo Forma 3111 Cell culture Equipment
Flow cytometer BD Biosciences Cell analyzer
Minipig PWG Genetics Korea, Ltd. T-type Miniature pig

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References

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चिकित्सा अंक 113 mesenchymal स्टेम सेल minipig श्लेष तरल पदार्थ अस्थि मज्जा सेल अलगाव सेल संस्कृति सेलुलर phenotype कोशिका की सतह मार्कर प्रवाह cytometry कोशिका जीव विज्ञान स्टेम
Minipigs की श्लेष द्रव और अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल के अलगाव और सेलुलर phenotyping
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Lee, W. J., Park, J. S., Jang, S. J., Lee, S. C., Lee, H., Lee, J. H., Rho, G. J., Lee, S. L. Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs. J. Vis. Exp. (113), e54077, doi:10.3791/54077 (2016).

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