Summary
このプロトコルの目的は、非侵襲的B-およびMモード心エコー法およびカラー/脈波ドップラーイメージングを用いて、横方向の大動脈狭窄によって作成された心臓病のマウスモデルにおいて心臓の構造的および機能的変化を評価することです。
Protocol
プロトコルは、ワシントン大学の施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従います。
1.手術手順およびイメージングのための準備
- TACまたは偽手術の対象とC57BL / 6マウスは、以前に10を説明しました。
- 一週間TACまたは偽手術後、1リットル/分のO 2を混合し、2％イソフルランで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。つま先や尾のピンチに無反応により適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を使用してください。脱毛クリームを適用することにより、胸毛を削除してください。 70％エタノールでマウスの皮膚を消毒します。
- 仰臥位で動物取扱プラットフォームにマウスを固定します。 1リットル/分のO 2と混合した1％イソフルラン-麻酔の安定したレベルを維持するために、0.5を提供するためにノーズコーンを使用しています。
- マウスの足に電極ゲルを適用し、電極パッドにそれらをテープ。
- 体温を監視するための直腸プローブを挿入します。加熱パッドまたはランプを経由して37℃の体温を維持。
- マウス胸、心臓を覆う主領域に予熱した超音波ゲルの層を適用します。注：超音波ゲルを除去し、イメージング処理後、滅菌ガーゼでマウスを乾かします。
大動脈弓ビューで、[使用するBモードとドップラーイメージングは、横大動脈狭窄を評価します
- 大動脈、主要幹線分岐し、狭窄部位を可視化するために、大動脈弓のビューを取得するためにBモードの設定を使用します。
- 左側臥位にマウスを回転させることが可能な限りプラットフォームの左側を傾けます。垂直位置で待機することにより、超音波トランスデューサを持ち、ノッチがマウスのあごに向いて、右傍胸骨ラインに沿って胸の上に置きます。注：transdを下げたときに、マウスの胸部を圧縮しないでください。ucer;圧力の最小量が必要とされます。
- 肩甲骨のレベルでトランスデューサを傾け、大動脈弓が見えてくるまで少し時計回りに回転。腕頭動脈（IA）および左総頸動脈（LCCA）（ 図1）の分岐との間に配置される横方向の大動脈狭窄部位を観察します。
注：いいえくびれは、偽手術マウスでは検出されませんでした。
- 狭窄サイト全体の血流の方向と速度を監視するために、カラードプラモードに切り替えるには、ワークステーションの「カラードップラー」ボタンをクリックします。 「シネストア」ボタンをクリックして画像を取得し、保存します。
- 最高速度で狭窄ジェットを検索するための狭窄部位のすぐ遠位波ドプラモード、および場所のサンプルボリューム（破線のカーソルボックス）パルスに切り替えるに「PWドップラー」ボタンをクリックし、「PWドップラー」ボタンをクリックしてください大動脈FLの波形を取得しますOWとメジャーピーク速度（ 図2）。
- 圧力勾配= 4×V maxの2：変更されたベルヌーイの式を用いて狭窄サイト全体の圧力勾配を計算します。唯一の更なる分析のために40〜80 mmHgの範囲の圧力勾配をマウスに含まれています。
傍胸骨長軸ビューで、[使用するBモードとMモードイメージングは、心臓寸法及び収縮を評価します
- マウスがプラットフォーム上で仰臥位で横たわっていると、ノッチは、マウスの頭を指している垂直な方法でトランスデューサーを保持します。左胸骨傍のラインに胸部平行にトランスデューサを下げ、30°反時計回りに回転させます。
- 心の完全長軸「サジタル」ビューを得るために、Bモードイメージングを使用してください。トランスデューサの角度を調整し、左心室、室内隔壁、および右心室壁のわずかな部分を可視化する深さに焦点を当てます。 S心臓壁の厚さおよびチャンバ寸法の後の測定用の画像をaveの。このようなIVSまたはLVAW、LVID、およびLVPWなどの選択パラメータは、「心臓パッケージ」を使用して、その後、測定値を得るために、各パラメータに対応する線を描画するには画像をクリックしてください。
- 心臓壁運動パターンを観察し、無動、運動低下、および非同期性を含む可能性運動異常、かどうかを確認します。
注：無動と運動低下は、心臓壁の動きの完全および部分的な損失を示し、それぞれ。非同期は、不規則な、まとまりのない心臓壁の動きを示しています。 - 乳頭筋のレベルでLVの壁に垂直にMモード、場所Mモードカーソルに切り替えて、心臓の寸法および短縮率（ 図3）の後の測定のための画像を取得します。
傍胸骨短軸ビュー、心臓形態と機能を評価するために使用するBモードとMモードイメージング4.
- 金曜日オム傍胸骨長軸ビューは、トランスデューサ90°時計回りに回転させることにより、胸骨傍短軸像を得ます。はっきりと見えると右（2と4時の位置）に位置する乳頭筋の両方で、Bモードで心臓の水平断面「横」ビューを提供するために、トランスデューサを調整します。
- Mモードに切り替えて、左心室のミッドレベルでMモードの軸を配置します。心臓壁の厚さ、チャンバーの寸法、および短縮率（ 図4）の後の測定のために画像を取得して保存。 IVSまたはLVAW、LVID、およびLVPW含む「心臓パッケージ」、SAXでの選択パラメータ（短軸）を使用し、測定値を得るために、各パラメータに対応する線を描画するには画像をクリックしてください。
注：ここで得られた測定値は、傍胸骨長軸ビュー（ 図5）で得られたものと密接に相関するはずです。
アピカル四腔像、使用5.収縮期および拡張期機能を評価するためにドップラーイメージング
- 画面下部の心房と左と右の両方の心室を視覚化するために心尖部四腔像を取得します。 Bモードでは、短軸像から、ダウン角にマウスの頭を、プラットフォームの左上隅を傾け、マウスの右の肩に向けてトランスデューサを向けます。これは頂点に向かって見上げる心の「冠状」ビューを達成するために本質的です。
- Bモードで僧帽弁を可視化し、カラードプラモードに切り替えて、僧帽弁の先端に試料容量（破線カーソルボックス）を配置します。
- 僧帽弁を横切る流れのパターンを評価するためにPWドプラモードに切り替えます。僧帽弁血流の方向にドップラープローブカーソルを平行に合わせます。ピーク速度（ 図6）を決定するためにプローブの角度20°未満を使用してください。
- 後で測定のための画像を保存します。 「心臓パッケージ」を使用し、選択して "MV流れ。「各パラメータをクリックして、測定値を得るために、対応する線を描画可能な測定は、次のとおりです。ピークE速度（初期のアクティブ心室弛緩を充填）、速度（心房収縮と後半充填）ピーク、僧帽弁等容性弛緩と収縮時間（IVRTをし、それぞれIVCT）、および駆出時間（ET）。
- MPI =（IVCT + IVRT）/ ETにより心筋の性能指数（MPI）を計算します。
動物の6.術後の治療
- 必要なときに腹腔内手術用動物に鎮痛および/または滅菌生理食塩水を与えます。
- 動物が腹臥位に加熱パッド上で回復させます。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手続きを経た動物を返さないでください。
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Representative Results
図1は、偽（ 図1A）に供したマウスの心臓またはTAC手術（ 図1B）の大動脈弓図のBモード画像を示しています。大動脈弓、腕頭動脈は、総頸動脈を左、および左鎖骨下動脈が示されています。大動脈狭窄は、TACにはっきりと見えることに注意してくださいが、心を偽ません。大動脈のビューからのカラードップラー画像は、 図2Aに示されています。くびれサイト全体の大動脈流の波形は、PWドップラー画像（ 図2B）によって捕獲されました。成功したTACは、下流の狭窄部位（TACマウスでは一般的に〜4メートル/秒）が有意に増加した流速につながります。狭窄を横切る圧力勾配を変更ベルヌーイの方程式（ 図2C）によれば、最大流速に基づいて計算しました。
図3 図3A）またはTACの心臓（ 図3B）の傍胸骨長軸ビューのB-およびMモード画像を示します。上のパネルは、左心室、心室中隔、および偽またはTACマウスからの右心室の部分のBモード画像を示しています。下のパネルは、偽またはTACマウスからのいくつかの心周期のMモードトレーシングを示しています。心臓の寸法の測定値は、左心室前壁の厚さ（LVAW）、左心室内径（LVID）、拡張期および収縮期における左心室後壁厚さ（LVPW）を含む、示されています。偽手術と比較して、TACにさらさマウスの心臓で有意に増加した壁の厚さに注意してください。
図4は、偽（ 図4A）またはTACの心臓（ 図4B）の傍胸骨短軸像の画像を示しています。各パネルの上部がMモード軸を示している（dott左心室の中心に配置された編線）。各パネルの下部には、上述のように、心臓の寸法を示す線を有するMモードトレーシングです。肥大のマーカーとして、心室と中隔の壁の厚さを正確に決定することができます。 LVISdとLVISsにより評価されるようにLVAWdとLVPWd、心室拡張によって評価されるようにTACに供されたマウスは、増加した壁の厚さを示し、LVFS及びLVEFによって評価されるように収縮を減少させ、そして（ 図5）LV質量を増加させました。
図6は transmitralフローパターン（ 図6C、D）のBモード心尖部四腔像（ 図6A、B）とPWドプラ画像を示します。ピークEと速度、IVCT、IVRT、およびETの測定が示されています。 E / A比とMPIは、（ - I図6E）を算出します。健康なマウスの心臓は、E / A比≥1とMPI値≤0.5を持っています。 DIAとの病理学的状態ではstolicあるいはTAC減少E / A比および/または増加したMPI値に供されたマウスと同様に収縮期心機能障害は、典型的に観察されます。
手術（A）またはTAC（B）を、偽を施しマウス心臓の大動脈弓ビューの図1のBモード画像。腕頭動脈（IA）などの主要な大動脈の枝、総頸動脈（LCCA）を左、および左鎖骨下動脈（LSA）を示しています。 （白矢印で示す）は、横大動脈狭窄は、TACで可視化が、心を偽ないことができることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Transveの図2.カラー/ PWドップラーイメージングRSE大動脈弓ビュー。カラー（A）とシャムとTAC心臓からPW（B）ドップラー画像から大動脈に血液FOWが示されています。 PWドップラー画像から得られたピーク大動脈速度が変更されたベルヌーイの式（C）に記載の圧力勾配を計算するために使用される。これらのデータは、〜70 mmHgでの圧力勾配で成功TAC手術を確認します。 * P <0.05 対 。偽の。データは、平均±SEMとして表さnはTACのための偽のための15およびn = 13 =されています。スチューデントのt検定は、統計的有意性を決定するために使用された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウス心臓の図3.傍胸骨長軸（PLAX）閲覧手術（A）またはTAC（B）を偽に供しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
マウス心臓の図4.傍胸骨短軸（PSAX）閲覧手術（A）またはTAC（B）を偽に供した。Mモード画像はサンプルボリューム（上のパネルの破線黄色の線）と心臓の測定の配置を示しています拡張期と収縮期における寸法（下のパネルにある青い線）。アスタリスクは、乳頭筋を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.心臓形態と 図4のように実施した短軸像でTAC。Mモード撮像後の機能の変更の心エコー評価 。（A）LVAWd、拡張期における左心室前壁の厚さ。 （B）LVPWd、拡張期における心室後壁の厚さを残しました。 （C）LVIDdは、拡張期における心室内径を残しました。 （D）LVIDs、収縮期における左室内径。 （E）LVFS、左心室短縮率。 LVFS（％）=（LVIDd-LVIDs）/ LVIDd×100％。 （F）LVEF、左心室駆出分画。 LVEF（％）=（LVEDV-LVESV）/ LVEDV×100％。 LVEDV及びLVESVはそれぞれ、左心室拡張末期と収縮末期容積を示しています。 LV容積と駆出率を正確にSimpsoによって評価されています n個の方法。 LV容積は、心室に多数のディスクを当てはめることによって推定される：シンプソン体積= [エリア（1）+面積（2）+ ... +領域（N）]×長さ。シンプソン面積と長さは、長軸と短軸ビューでLVの心内膜の境界をトレースすることにより得られます。 （G）LV（左心室）質量。 LV質量（mg）を= 1.05のx [（LVIDd + LVPWd + IVSd）3 - （LVIDd）3]。係数1.05は、心筋の特定の密度を表します。 （H） HR、心拍数。 * P <0.05 対 。偽の。分析したマウスの数は、各パネルのバーで示されています。 ±SEMスチューデントのt検定は、統計的有意性を決定するために使用された平均値としてデータが表現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図6.評価ドップラーイメージング。（A及びB）シャム（A）のBモード心尖部四腔像やTAC（B）は、心臓によってTransmitral血流 。 LV、左心室; RV、右心室。 MV、僧帽弁。テレビ、三尖弁。 LA、左心房。 RA、右心房。 （C及びD）トランス僧帽偽の血流（C）またはTAC（D）は、心臓のPWドプラ波形。関連した測定値が示されています。 （E）E / A、ピークEと速度比。 （F）IVCT、等容性収縮時間。 （G）IVRT、等容弛緩時間。 （H）ET、駆出時間。 （I）MPI、心筋の性能指標。 * P <0.05 対 。偽の。分析したマウスの数は、各パネルのバーで示されています。データは、平均値として表されています77; SEMスチューデントのt検定は、統計的有意性を決定するために使用された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
心エコー検査は、広く心疾患2,6の齧歯類モデルにおいて心機能を評価するために使用されてきました。このような圧力-容積ループ測定11などの侵襲的または端末の方法論などに比べると、ex vivoでの心臓12は 、心エコー検査は、生きている動物で進行中の心臓の構造的および機能的変化を評価するための強力な、非侵襲的なツールを提供して取り組んでいます。信頼性のあるデータを得るためには、慎重な加熱装置と麻酔のレベルを調整することにより、生理的範囲13内の体温と心拍数を維持することが重要です。すべての画像は、異なる株または遺伝子型のマウスとの間の比較を容易にするために、一貫して標準化されたイメージング手順に従って取得され、分析されるべきです。
TACは、一般的に、マウス1における心肥大および心不全を誘導するために使用されます。ドップラーにより狭窄サイト全体の圧力勾配の非侵襲的測定イメージングは、マウスの圧負荷の程度の信頼性の評価を表しています。成功したTACは、一般的に圧力勾配を生成≥40mmHgで。低すぎる、または高すぎる圧力勾配を持つマウスは除外すべきながら、圧負荷の類似度を施したマウスだけは、さらなる分析のために含まれるべきです。 TAC後、マウスは、圧負荷し、試験したマウスの遺伝的バックグラウンドの程度に依存して、4週間後に1〜2週間、および心臓拡張内の心臓肥大を発症することが予想されます。上記のように動的な心臓リモデリング及びTAC以下の機能の変更が確実に心エコー画像化によって評価することができます。
人間14での頻繁な使用とは対照的に、カラー/ PWドプラのみげっ歯類超音波イメージング9で最近利用されています。ここでまた、我々は圧力勾配だけでなく、収縮期および拡張期の性能を測定する際にドップラーイメージングのアプリケーションを記述しました。メジャー僧帽弁と三尖弁血流方向と速度のメント（ すなわち 、E / A比、IVRT、IVCT、ET、およびMPI）は、心臓機能に関する重要な情報を提供します。したがって、心エコーイメージングは、小さな動物で心臓生理学と病態生理学を研究するための重要なツールを表します。
心臓の超音波画像化の限界は、測定変動性および再現に関連しています。間および分子内のオペレータの変動を低減するためには、画像が取得され、分析される方法を標準化することが重要です。測定値は、複数の音響窓やモードから実行すべきである（Bモード、Mモード、およびPW /カラードップラー）と、少なくとも3つの別々の測定の精度と信頼性を確保するために平均化されるべきです。また、限られた音響窓があり、時には低品質の画像が原因で、超音波を妨害する組織の腫れ、手術の痕、および肺水腫に、TAC等の外科的処置を施した小さなげっ歯類で得られます梁。ドップラーイメージングのために、時にはそれが特にTACまたはMIの手術を受けたマウスでは、小さいためげっ歯類では比較的高い心拍数に、独立したEとA波に挑戦し、僧帽弁の流れの完全な波形を得るです。心拍数を下げると、測定値を得るために有用であり得るが、これは、ドップラーイメージング、したがってデータ解釈した値に影響を与えます。
最近の技術進歩により、新しくリリースされた超音波システムは、小動物に正確な定量的測定を確保するために、高い画像解像度とフレーム/サンプリングレートを提供します。新しい心エコー検査技術は、心臓機能の心エコー評価の感度を向上させ、心臓病の早期発見を可能にします。例えば、スペックル追跡株画像15を正確に局所的な心筋機能を測定するために使用されています。現在開発中の新たな変換器技術は、リアルタイムの3D又は4Dの可能性を提供しますイメージング。高度な開発であるコントラスト心エコー検査は、体積測定、組織灌流の評価、心血管疾患の分子イメージング、および治療薬の送達を可能にします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
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